Адгезивные и суспензионные клетки почек детенышей хомячка имеют разный цитоскелет и репертуар поверхностных рецепторов

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Вероника Дилл¹, Флориан Пфафф¹, Алин ЦиммерID², Мартин Бир¹, Майкл ЭшбаумерID^1*

Абстрактный

Культура клеток животных с одиночными клетками, растущими вприостановка, в идеале в химически определенной среде, является основой биофармацевтического производства. В синтетической среде отсутствуют экзогенные факторы роста, и обычно требуется длительный процесс адаптации для отбора клеточных клонов, которые размножаются вприостановкак большому количеству клеток. Молекулярные механизмы, облегчающие адаптацию и происходящие внутри клетки, во многом неизвестны. В частности, для клеточных линий, которые используются для продукции вирусных антигенов, таких как клетки почек детенышей хомячка (BHK), ограничение роста вируса за счет развития нежелательных характеристик клеток крайне нежелательно. Сравнение между адгезивно растущими клетками ВНК и суспензионными клетками с различнымивосприимчивостьк вирусу ящура выявили различия в экспрессии клеточных рецепторов, таких как интегрины и гепарансульфаты, и в организации актинового цитоскелета. Анализ транскриптома и росткинетикапродемонстрировали разнообразие клеточных линий BHK и подтвердили важность хорошо охарактеризованных клонов родительских клеток и тщательного скрининга, чтобы убедиться, что основные клеточные функции не теряются во время адаптации.

Cistanche tubulosa предотвращает заболевание почек, нажмите здесь, чтобы получить образец

1. Введение

Технология культивирования клеток животных была впервые использована для производства вирусного антигена в производстве вакцин, но в последнее время платформы для производства рекомбинантных белков из бактерий или дрожжей также переходят на клеточные системы млекопитающих [1, 2]. В обоих случаях важны клетки почек детенышей хомячка (BHK), полученные от сирийского золотого хомяка (Mesocricetus auratus). Первоначально клетки BHK представляли собой адгезивно растущую, зависимую от якоря клеточную линию млекопитающих с характером роста фибробластов в стандартных условиях культивирования клеток, включая фетальную бычью сыворотку (FBS) [3, 4]. Адаптация прикрепленных клеток BHK кприостановкавыращивание в бессывороточных средах в сочетании с крупномасштабными условиями культивирования является успешной историей получения рекомбинантных белков (например, фактора VIII) с высокими выходами [1, 2]. Кроме того, ВНК-клетки восприимчивы к широкому спектру вирусов, включая вирус ящура (Ящур) [5]. Чтобы удовлетворить растущий спрос на вакцины от ящура во многих частях мира, большое количество антигена должно производиться как можно дешевле, что достижимо за счет увеличения плотности жизнеспособных клеток на клеточной стороне и снижения затрат за счет упрощения обработки вверх и вниз по течению. антигена на стороне производства [6]. Среды без животных компонентов (ACFM) снижают риск контаминации посторонними агентами и дополнительно упрощают процесс, когда не нужно добавлять сыворотку [6, 7]. Однако адаптация клеток к росту в суспензии без сыворотки и в ACFM — длительный и постепенный процесс [6, 8]. Клетки BHK легко достигают клеточной плотности 3,5×106 клеток/мл в суспензии, но адаптация всегда сопряжена с риском развития нежелательных свойств клеток по сравнению с исходной популяцией, что может привести к плохим характеристикам роста, недостаточному клеточно-специфичному выходу или онкогенным активам. [5, 7]. В свою очередь, изменения в клетках могут привести к неожиданным вариантам вируса в процессе культуральной адаптации. В частности, для производства вакцинного антигена изменение характеристик и антигенности вируса крайне нежелательно. Клетки ВНК уже различаются по своей восприимчивости и способности размножать определенные штаммы вируса ящура [9]. Очевидно, что переход от зависимого от прикрепления роста фибробластов путем агрегации и образования сфероидов к клеткам, растущим независимо в суспензии, будет сопровождаться значительными изменениями самой клетки [4, 6]. Потеря передачи интегрина из-за прерывания контакта внеклеточного матрикса с клеткой приводит к изменениям в экспрессии мембранных белков и в организации актинового цитоскелета, который является важным реципиентом интегрин-опосредованной передачи сигналов [6, 10]. В то же время эти интегрины играют важную роль в инфицировании вирусом ящура, поскольку они являются рецептором вируса ящура в природном хозяине и первичным рецептором в культуре клеток [11].

Более глубокое понимание клеточных различий между адгезивно растущими НК-клетками и клеткамиприостановкаоткроет новые возможности для клеточной инженерии и упростит выбор подходящих клеточных клонов для производства вакцинного антигена.

В этом исследовании адгезивно растущие клетки BHK и ACFM-адаптированныеприостановкаКлетки BHK исследовали в отношении экспрессии клеточных рецепторов, таких как интегрины и гепарансульфаты (HS), их способности представлять белки на клеточной поверхности и организации клеточного актинового скелета. Анализ транскриптома и кинетика роста предоставляют информацию о разнообразии протестированных клеточных линий BHK.

цистанхе может питать почки и улучшать функцию почек

2. Материалы и методы

2.1 Клеточные линии и клеточные культуры

Основными используемыми клеточными линиями были два производных клона 13 BHK-21 (из Американской коллекции типовых культур [ATCC] CCL-10, зарегистрированных как CCLV-RIE 164 и 179 в Коллекции клеточных линий в ветеринарии. , Friedrich-Loeffler-Institut, Грайфсвальд, Германия; сокращенно: BHK164 или BHK179) иприостановкаклеточные линии BHK21C13-2P (BHK-2P), предоставленные Европейской коллекцией аутентифицированных клеточных культур (ECACC; 84111301) и BHK-InVitrus (BHK-InV, также называемая «линия № 8» как в нашей более ранней публикации [12]; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США).

Для кинетики роста дополнительно использовали следующие клеточные линии: BHK-2P, поддерживаемые либо в минимальной основной среде Глазго (GMEM) с 10% FBS («линия № 2»), либо адаптированные к ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Дармштадт, Германия) в двух разных процессах (линии № 4 и № 5), а также в четырех других процессах.приостановкаклеточные линии: BHK21C13 адаптированы к росту вприостановкапостепенным выводом сыворотки (линия № 3), БНК21-С (линия №6), БНК21-Гектор (линия №7) и продукции БНК (линия №9) [12]. Все эти ячейки были предоставлены Merck KGaA.

Все клетки BHK-21, использованные в исследовании, в конечном итоге получены из клеточной линии BHK-21 клона 13 Макферсона и Стокера [13]. Термин «клеточная линия» используется свободно; не все из одиннадцати линий BHK-21, описанных в настоящем исследовании, являются действительно отдельными клеточными линиями, а не производными, культивируемыми в разных условиях. Для удобства нумерация строк сохранена в соответствии с нумерацией в нашей предыдущей публикации [12].

Клеточная линия № 1 из предыдущей публикации не была включена в настоящее исследование, поэтому этот номер не используется. Вместо этого любая ссылка на ячейки BHK-2P, в которой не упоминаются номера строк № 2, № 4 или № 5, относится к основнойприостановкаклеточная линия BHK21C13-2P (ECACC84111301), представленная в начале этого раздела.

Адгезивные линии клеток яичника китайского хомячка (Cricetulus griseus) (CHO) CHO-K1 (ATCCCCL-61, зарегистрирован как CCLV-RIE 134) и CHO677 (CRL 2244, зарегистрирован как CCLV-RIE 1524), а также IB-RS Были использованы клетки -2 (Instituto Biol´gico-Rim Suı´no-2, зарегистрированные как CCLV-RIE 103) и клетки бычьей почки Madin-Darby (кратко: MDBK, зарегистрированные как CCLV-RIE261). в качестве контроля в экспериментах по проточной цитометрии.

Условия культивирования: 37 ˚C, 5% CO2 и дляприостановкаклеток при 320 об/мин в биореакторах TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Трасадинген, Швейцария) при относительной влажности 80 процентов. Все прилипшие клеточные линии культивировали в минимальной основной среде Игла (MEM) с добавлением солей Хенкса и Эрла (Sigma-Aldrich) с 10% FBS. Все суспензионные клеточные линии были адаптированы для роста в среде Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA), кроме клеточной линии №2, которую культивировали, как описано выше.

Измерения плотности и жизнеспособности клеток проводили с использованием трипанового синего (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и автоматического счетчика клеток (модель TC20, Bio-Rad).

2.2 Анализ кривой роста суспензионных клеток

Анализы кривых роста проводили в виде периодических экспериментов в двух экземплярах, два раза по отдельности, с плотностью посева 0,6×106 клеток/мл. Плотность жизнеспособных клеток (VCD) и жизнеспособность в процентах измеряли ежедневно в течение шести дней после инокуляции клеток.

Расчеты для конкретных ячеек проводились в соответствии с уравнениями, приведенными в [14]:

X: VCD (на мл); t: моменты времени отбора проб (час); n и n-1: две последовательные точки выборки.

Номер клеточного деления (cd):

2.3 Проточная цитометрия

Анализы проточной цитометрии выполняли с использованием прибора проточной цитометрии FACSCanto II (BD Biosciences, Оксфорд, Великобритания). Клеточный дебрис отсеивался на основании моделей прямого и бокового рассеяния. Для окрашивания актином непосредственно измеряли среднюю интенсивность флуоресценции в канале Alexa 488. Для всех пятен антител процент Alexa 488 или PE-положительных клеток определяли с помощью интервала, нижняя граница которого была установлена ​​на основе изотипического контроля. Все эксперименты проводились независимо трижды.

2.3.1 Окрашивание антителами рецепторов клеточной поверхности.

поверхность. Клетки MDBK служили положительным контролем экспрессии v 3, клетки IB-RS-2 служили положительным контролем экспрессии v 8, а клетки CHO-K1 служили положительным контролем экспрессии HS. . Клетки CHO677 не экспрессируют ни тестируемые интегрины, ни HS и поэтому служили в качестве отрицательного контроля во всех экспериментах. Использовали следующие антитела: для v3 — PE-конъюгированный клон LM609 (разведение 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); для v 8 первичное антитело 11E8, клон 68, мышиный IgG2a (разведение 1:100) (любезно предоставлено доктором Стивеном Нишимурой) с вторичным козьим антителом против мышиного IgG2a (разведение 1:1000), конъюгированным с Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); для HS, клон 10E4, мышиный IgM (разведение 1:200) (Amsbio, Абингдон, Великобритания) с мю-цепью вторичного антитела козы против мышиного IgM (разведение 1:2000), конъюгированного с Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Кембридж, Великобритания) . В каждом эксперименте использовали только одно первичное антитело.

Суспензию клеток промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Адгезивные клетки открепляли с помощью 10 мМ ЭДТА в PBS, а затем промывали PBS. После промывки клетки фильтровали через клеточный фильтр (нейлоновая сетка, диаметр пор 7{15}} мкм, VWR, Radnor, США) для удаления скоплений клеток и доводили до 1×106 клеток/мл перед добавлением 1 мкл LIVE/ Краситель мертвых клеток DEAD FixableViolet (Thermo Fisher Scientific) добавляли к 1 мл клеточной суспензии на 30 минут. Этот и все последующие этапы проводили в защищенном от света месте при 4°С. Первичные антитела инкубировали в течение 30 минут, а вторичные антитела инкубировали в течение 20–30 минут. После всех этапов проводили промывку 2 мл буфера FACS (PBS, 0,1% азида натрия, 0,1% BSA) и центрифугирование при 300×g, 5 мин, 4°C. Наконец, окрашенные клетки ресуспендировали в 300 мкл буфера FACS.

2.3.2 Окрашивание актином.

Нитевидный актин окрашивали с использованием реагента Phalloidin-iFluor 488 (ab176753, Abcam), приготовленного в соответствии с таблицей данных. Клетки BHK179, BHK-2P и BHK-InV отделяли, как описано выше, и фиксировали 4-процентным формальдегидом в течение 20 минут при комнатной температуре (КТ). Клетки дважды промывали PBS и 1×106 фиксированных клеток пермеабилизировали 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) в PBS с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 3 минут. Клетки дважды промывали PBS (центрифугирование при 300×g, 5 мин) перед добавлением приготовленного исходного раствора фаллоидина, разбавляли 1:1000 буфером FACS и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Наконец, клетки дважды промывали буфером FACS и ресуспендировали в 300 мкл буфера FACS. Окрашенные клетки анализировали непосредственно с помощью флуоресцентного микроскопа и использовали для анализа FACS.

2.3.3 Эксперименты по трансфекции.

Клетки BHK164 и BHK-2P трансфицировали либо EGFP-N1, плазмидой, экспрессирующей усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) (Clontech), либо в другой серии экспериментов pVSV-G, плазмидой, экспрессирующей G-белок везикулярных вирус стоматита Индианы (VSV), используя Липофектамин 3000 (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкции производителя. Вкратце, 2 мкг плазмидной ДНК и 1,875 мкл или 3,75 мкл липофектамина, разведенного в среде Cellvento™ BHK200, смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплекса. Затем эти смеси переносили на клетки в 12-луночные планшеты (приблизительно 4×105 клеток/мл) и добавляли среду до 200 мкл. Клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов.

Для анализа FACS все содержимое лунок собирали через 24 часа. Клетки, трансфицированные pEGFP, трижды промывали PBS и ресуспендировали в 300 мкл буфера FACS. Один дубликат клеток, трансфицированных pVSV-G, пермеабилизировали PBS с 0,1% (об./об.) TritonX-100 в течение 5 мин при комнатной температуре перед окрашиванием антителами, в то время как другой оставался непермеабилизированным. Окрашивание антителами проводили, как описано выше, поликлональной кроличьей сывороткой VSV 274/E (разведение 1:500, любезно предоставлено доктором Стефаном Финке) и вторичными козьими антителами против кроличьих (H плюс L), конъюгированными с Alexa Fluor 488 (разведение 1: 1000; Термо Фишер Сайентифик).

2.4 Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием GraphPad Prism версии 07.04 для Windows (GraphPad Software, La Jolla, США). Был проведен обычный однофакторный дисперсионный анализ с использованием пост-самых горячих результатов Тьюки для оценки различий между экспериментальными группами. Порог статистической значимости был установлен на уровне p 0,001.

2.5 Транскриптомный анализ

2.5.1 Экстракция РНК, подготовка библиотеки и секвенирование.

Для анализа транскриптома использовали три независимых партии каждой из прикрепленных клеточных линий BHK179 и суспензионных клеточных линий BHK-2P и BHK-InV. В среднем 8,3×105 клеток BHK179, 1,6×107 клеток BHK-2P и 1,4×107 клеток BHK-InV лизировали в реагенте TRIzol (Thermo Fisher Scientific). После добавления 0,2 объема трихлорметана к лизату клеток, инкубации и центрифугирования водную фазу собирали и смешивали с одним объемом 100-процентного этанола. Из него экстрагировали тотальную РНК с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) с расщеплением ДНКазы на колонке с набором ДНКазы, не содержащим РНКазы (Qiagen), следуя инструкциям производителей. ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) добавляли и использовали в качестве внутреннего контроля для всех последующих стадий. Затем полиаденилированную мРНК выделяли из 1–3 мкг тотальной РНК высокого качества с использованием набора Dynabeads mRNA DIRECT Micro kit (ThermoFisher Scientific). Затем мРНК фрагментировали и использовали для синтеза кДНК и подготовки библиотеки с использованием набора TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, Сан-Диего, США) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование проводили в Институте Генриха Петте в Гамбурге с использованием оборудования NextSeq 500 (2x75 п.н.) и HiSeq 4000 (1x50 п.н.) (Illumina).

2.5.2 Статистический анализ дифференциальной экспрессии генов.

Проверка качества необработанных считываний из каждой библиотеки секвенирования была выполнена с использованием FastQC (версия {{0}}.11.9; Институт Бабрахама, Кембридж, Великобритания) с акцентом на распределение длин считываний и загрязнение адаптера до и после адаптера. обрезка с использованием Trim Galore (версия 0.6.4_dev, Babraham Institute) и Cutadapt (версия 2.10) [15]. Затем с помощью Salmon [16] обрезанные необработанные чтения были квази-картированы с геномом сирийского золотистого хомяка.

Короче говоря, геномные и транскриптовые ссылки GCF{{0}}.1_MesAur1.0 были получены из Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и объединены с эталонными последовательностями шиповидного ERCC. в элементах управления. Индекс транскриптома с приманкой [17] был создан для обеспечения селективного сопоставления с лососем. Для количественной оценки использовали десять повторов начальной загрузки, и была включена компенсация смещений, связанных с последовательностью, смещений GC и смещений 5' или 3' положения.

Впоследствии данные количественного определения контрольных доз ERCC были сопоставлены с их теоретической концентрацией, чтобы выявить проблемы во время подготовки образцов.

Кроме того, данные количественного определения, специфичные для гена, были первоначально отфильтрованы (только гены, которые появляются более чем в одной реплике с более чем 15 подсчетами), нормализованы с использованием регуляризованного логарифмического преобразования (rlog) и использованы для исследовательского анализа данных, например, с помощью PCA. Гены с дифференциальной экспрессией были идентифицированы и впоследствии использованы для анализа путей с помощью DESeq2 [18]. Данные экспрессии были проанализированы для значительно отличающейся экспрессии генов между парами клеточных линий BHK-2P и BHK179, BHK-InV и BHK-2P, а также BHK-InV и BHK179. Впоследствии полученное двоично-логарифмическое (log2) изменение кратности было скорректировано с помощью функций «lfcShrink» и «apglm» в DESeq2, чтобы компенсировать низкие или переменные значения количества прочтений, которые могут привести к завышению дисперсии [19].

Критерии гена со значительно отличающейся экспрессией были установлены на максимальное скорректированное значение {{0}}.05 и минимальное абсолютное значение уменьшенного log2-кратного изменения, равное 1. Путь и критерии для значительно по-разному выраженного гена были установлены максимальное скорректированное значение 0,05 и минимальное абсолютное значение уменьшенного log2-кратного изменения 1. Анализ пути и обогащения был проведен с использованием функции «обогащать» в профиле кластера (версия 3.16.0).

цистанхе может питать почки и улучшать функцию почек

3. Результаты

3.1 Восприимчивость клеточной линии к ящуру не зависит от ее индивидуальной скорости роста и числа клеточных делений.

Периодические эксперименты с девятью различными суспензионными клеточными линиями ВНК проводились в течение шести дней, и ежедневно измерялась плотность жизнеспособных клеток (VCD) и жизнеспособность. Основываясь на предыдущих наблюдениях, что клеточные линии различались по своей восприимчивости к вирусу ящура серотипа Asia{{0}} [12], было исследовано, связаны ли повышенный клеточный метаболизм и скорость роста со сниженной восприимчивостью к инфекции этим вирусом. вирус (таблица 1). Две из трех восприимчивых суспензионных клеточных линий BHK представляют собой медленно растущие клетки с малым числом клеточных делений (cd) 0,60 (#3) и 0,70 (#9), в то время как третья восприимчивая клеточная линия (#8) имеет самая высокая скорость роста и cd (μ=0.035, cd=1.62) среди всех протестированных клеточных линий.

Отбор сыворотки и адаптация к росту в ACFM не повлияли на восприимчивость к ящуру в нашей группе исследованных клеточных линий. Клеточная линия № 2 представляет собой медленно растущий, зависящий от сыворотки предшественник клеточных линий BHK-2P, поддерживаемый в суспензии с помощью GMEM с фетальной бычьей сывороткой. При адаптации к росту в ACFM клетки отбирали по высокому VCD, связанному с высокой скоростью роста и cd. Как и основная клеточная линия BHK-2P, используемая для исследования, клеточные линии №4 и №5 также происходят от клеточной линии №2, но отличаются способом адаптации к ACFM. Все клеточные линии BHK-2P, поддерживаемые в ACFM, показали очень похожий профиль роста. Чувствительность к вирусу ящура серотипа Asia-1 не была приобретена ни одной из этих клеточных линий во время адаптации к ACFM, вероятно, потому, что исходная линия № 2 уже была устойчива. Точно так же не наблюдалось изменений в чувствительности для суспензионной клеточной линии №3. При адгезивном росте (ср. клеточную линию №1 в [12]) клетки были восприимчивы к вирусу ящура Asia-1 и сохраняли эту характеристику при адаптации к росту в суспензии. В то же время они не приобретали быстрого профиля роста других суспензионных клеток.

3.2 Суспензионные клетки имеют на своей поверхности меньше первичных рецепторов, но больше вторичных рецепторов к вирусу ящура, чем прикрепленные клетки ВНК.

Первым шагом вируса к успешному заражению клетки является связывание вирусной частицы с молекулами рецептора на поверхности клетки. Для анализа различий между адгезивно растущими клетками BHK и клетками BHK в суспензии были протестированы антитела к клеточным рецепторам, участвующим во взаимодействии внеклеточного матрикса и играющим важную роль в инфицировании вирусом ящура. Интегрины v 3 и v 8 были исследованы как репрезентативные клеточные рецепторы, которые распознают мотив связывания RGD (Arg-Gly-Asp) и взаимодействуют с компонентами сыворотки и внеклеточным матриксом, но также используются вирусом ящура в качестве его естественных первичных рецепторов. Ни одна из протестированных суспензионных клеточных линий (BHK-InV и BHK-2P) не экспрессировала интегрин v3 или v8 на поверхности клеток. В то время как разница между прикрепленными BHK и суспензионными BHK была незначительной для интегрина v 8 (рис. 1b), значительно более высокий процент прикрепленных BHK179 экспрессировал интегрин v 3 по сравнению с суспензионными клеточными линиями BHK-InV и BHK-2P ( Рис 1а).

Высокие количества HS присутствовали на поверхности обеих суспензионных клеточных линий. Экспрессия HS сильно отличалась между повторными культурами прикрепленных клеток BHK179. По сравнению с суспензионными клеточными линиями меньшее количество клеток в культурах BHK179 было HS-положительными, даже несмотря на то, что разница не была значимой на заданном уровне значимости (рис. 2).

Окрашивание и микроскопический анализ выявили большие различия в расположении актинового цитоскелета между прикрепленными и суспензионными клетками (рис. 3). Актиновые филаменты в прикрепленных клетках BHK179 равномерно распределены по всей клетке в виде мелкой ретикулярной структуры (рис. 3а), тогда как клетки, растущие в суспензии, имели диффузное окрашивание актина (рис. 3б). Интересно, что количество филаментозного актина различалось между суспензионными клеточными линиями BHK-InV и BHK-2P. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) после окрашивания фаллоидином была значительно выше в клетках BHK-InV по сравнению с BHK-2P, что указывает на более высокое содержание филаментозного актина в этих клетках (рис. 3c).

3.3. Суспензионные клетки различаются по эффективности трансфекции, но не по способности экспонировать поверхностные белки.

Из-за различий в конформации актина между прикрепленными и суспензионными клетками клетки исследовали в отношении их переносимости и способности представлять белки на своей поверхности. В целом эффективность трансфекции, измеренная по экспрессии EGFP, снижается в суспензионных клетках (рис. 4а). При использовании низкой дозы реагента для трансфекции значительно более высокий процент прилипших клеток экспрессировал EGFP по сравнению с суспензионными клетками. Когда использовалась высокая доза реагента для трансфекции, более высокий процент суспензионных клеток был успешно трансфецирован, хотя разница между высокими и низкими дозами была незначительной. Чтобы ответить на вопрос, способны ли суспензионные клетки презентировать на своей поверхности белки, такие как клеточные рецепторы, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей белок G VSV (рис. 4b). Одну серию клеток пермеабилизировали перед окрашиванием, чтобы учесть возможность того, что G-белок экспрессируется, но не экспонируется на клеточной поверхности. Не было существенной разницы в способности экспрессировать и презентировать G-белок VSV между прикрепленными и суспензионными клетками ни при использовании низкой, ни при высокой дозе реагента для трансфекции.

3.4 Анализ транскриптома выявляет различия в экспрессии генов, связанных с внеклеточным матриксом, между суспензионными клетками.

Анализ транскриптома был проведен для дальнейшего изучения различий между адгезивно растущими клетками BHK и клетками BHK в суспензии, а также для выяснения того, почему суспензионные клетки различаются по своей восприимчивости к ящуру. Адгезивная клеточная линия BHK (BHK179), культивируемая в MEM с добавлением FBS, а также быстрорастущая клеточная линия, чувствительная к ящуру (BHK-InV), и быстрорастущая резистентная клеточная линия (BHK-2P), обе адаптированные к ACFM, были выбраны для анализа.

Анализ основных компонентов (PCA) выявил тесную связь между биологическими репликами отдельных клеточных линий (рис. 5а). Все реплики одной и той же клеточной линии расположены близко друг к другу на графике с небольшим указанием эффектов от партии к партии. Первый главный компонент (составляющий 81 процент дисперсии в нормализованном наборе данных) был интерпретирован как транскрипционное различие между клетками, растущими в суспензии, и клетками, растущими в адгезии, в то время как второй главный компонент (15 процентов дисперсии) представлял собой различие между суспензионные клеточные линии BHK-2P и BHK-InV, возможно связанные с восприимчивостью к ящурной инфекции. Вместе первые два основных компонента смогли объяснить 96 процентов дисперсии, обнаруженной в наборе данных, что указывает на то, что анализ транскриптома выявил соответствующие различия между тремя клеточными линиями.

Наименьшее количество дифференциально экспрессируемых генов было обнаружено при сравнении BHK-InV с BHK-2P (590 с повышенной экспрессией; 304 с пониженной регуляцией). Аналогичные числа были замечены при сравнении либо BHK-2P, либо BHK-InV по отдельности с BHK179 (1527 и 1519 с повышенной регуляцией; 1308 и 943 с пониженной регуляцией соответственно) (рис. 5b). Когда две суспензионные клеточные линии (BHK-InV и BHK-2P) объединяли и сравнивали с адгезивной клеточной линией BHK179, 1814 генов экспрессировались по-разному. В то время как 411 генов исключительно по-разному экспрессируются при сравнении BHK179 с BHK-InV, почти вдвое больше (701 ген) исключительно по-разному экспрессируются между BHK179 и BHK-2P. Между двумя суспензионными клеточными линиями только 104 гена экспрессировались исключительно по-разному.

При сравнении набора дифференциально экспрессируемых генов восприимчивых к ящуру клеточных линий BHK179 и BHK-InV с устойчивой к ящуру клеточной линии BHK-2P было обнаружено, что подмножество из 553 генов по-разному экспрессируется в обоих сравнениях ( Рис 5с). Поскольку эти гены могут быть вовлечены в восприимчивость к ящуру, был проведен анализ обогащения терминов GO, который показал, что многие из этих генов связаны с клеточными компонентами внеклеточного матрикса (ECM), клеточными мембранами и межклеточными соединениями (рис. 5d). .

Поскольку мы наблюдали различия между клеточными линиями, связанные с взаимодействием ECM, транскриптом был повторно проанализирован с акцентом на экспрессию интегринов v 1, v 3, v 6, v 8, а также актина, все потенциально важные для восприимчивости к инфекции ящура. (рис. 5е). За исключением ACTA2, не было существенной разницы в экспрессии связанных с актином генов между клетками BHK-InV и BHK-2P на уровне мРНК. Нормализованное количество генов для всех исследованных генов, связанных с актином, было значительно выше в адгезивной клеточной линии BHK179, чем в суспензионных клеточных линиях (S1 Fig).

Все три клеточные линии экспрессировали одинаковое количество транскриптов ITGAV, кодирующих субъединицу интегрина v, но демонстрировали дифференциальную экспрессию субъединиц интегрина. В частности, суспензионные клеточные линии BHK-2P и BHK-InV экспрессировали значительно меньше ITGB1, ITGB3 и ITGB6 по сравнению с адгезивной клеточной линией BHK179. ITGB3 и ITGB8 значительно различались экспрессией между суспензионными клеточными линиями BHK-2P и BHK-InV. Интересно, что ITGB8 был единственным геном, кодирующим субъединицу интегрина, который был сильно сверхэкспрессирован в обеих восприимчивых к ящуру клеточных линиях BHK179 и BHK-InV по сравнению с устойчивой к ящуру клеточной линией BHK-2P (рис. 5e).

цистанхе может питать почки и улучшать функцию почек

4. Дискуссия

Адаптация клеток к росту в суспензии и в бессывороточных средах — трудоемкий и постепенный, но необходимый в биотехнологии процесс для создания высокопродуктивных клеточных линий, используемых для продукции антител, вакцинных антигенов или других белков [1, 8]. ]. Действительно, этот процесс всегда сопряжен с риском приобретения клетками нежелательных свойств по сравнению с исходным клеточным материалом [7]. В случае производства вакцинного антигена большое значение имеет восприимчивость клеточной линии к целевому вирусу. Для вируса ящура (FMDV) хорошо известно, что определенные линии клеток BHK устойчивы к инфекции или теряют свою восприимчивость при повторном субкультивировании [20-22]. Кроме того, антигенные свойства вируса могут варьировать в зависимости от клетки-хозяина [9].

Суспензионные клетки растут независимо от поверхности и поглощаются богатой кислородом питательной средой, что позволяет им быстро расти. Быстрое размножение клеток является необходимой функцией для простого и быстрого масштабирования культуры до больших объемов. Удаление сыворотки из среды необходимо для снижения затрат, риска контаминации и упрощения процессов в масштабе [23, 24].

Анализ периодического роста различных суспензионных клеточных линий BHK был предназначен для определения того, вреден ли отбор в отношении быстрорастущей клеточной популяции в бессывороточных условиях для размножения ящура. Фактически, две из трех восприимчивых клеточных линий росли медленно, но было обнаружено, что их восприимчивость к ящуру не зависит от их ростового метаболизма. Более вероятно, что восприимчивость к ящуру уже утрачена (или сохранена) при начальной адаптации к росту в суспензии. Отрыв клеток от поверхности и удаление сыворотки на следующих этапах адаптации к суспензионному росту приводит к изменению уровня экспрессии поверхностных белков и белков, участвующих в цитоскелете [7].

Интегрины представляют собой важное семейство рецепторов клеточной поверхности, которые интегрированы в клеточную мембрану и опосредуют передачу сигналов между клетками, а также прочную связь между клеткой и поверхностью посредством связывания компонентов внеклеточного матрикса (ECM) [10, 25]. ]. Регуляция клеточного цикла, организация цитоскелета и транслокация зарождающихся молекул рецепторов к клеточной мембране зависят от интегринов [25]. Для многих интегринов связывание ВКМ, а также связывание лигандов, поступающих в клетки за счет добавления сыворотки в культуральную среду, опосредовано RGD-мотивом [6, 25] и, вероятно, изменяется при изменении клетки переключаются с адгезивного на суспензионный рост. Распознавание мотива RGD интегринами также используется вирусом ящура для инициации рецептор-опосредованного эндоцитоза вирусной частицы [26]. Мотив RGD в VP1 вируса ящура высококонсервативен [27], а интегрины v1, v3, v6 и v8 являются известными рецепторами, используемыми вирусом ящура in vivo и in vitro [28–31]. Поскольку предполагаемые различия в протеоме клеточной поверхности между прикрепленными и суспензионными клетками также могут иметь решающее значение для различий в восприимчивости к инфекции ящуром, антитела, связывающиеся с интегрином v 3 и v 8, были использованы для окрашивания прикрепленной клеточной линии BHK, а также восприимчивая и резистентная суспензионная клеточная линия ВНК. Окрашивание v6 не проводилось, поскольку ранее было показано, что этот интегрин не экспрессируется на поверхности клеток BHK [32], хотя мРНК ITGB6 обнаруживается. Точно так же, несмотря на высокий уровень экспрессии мРНК ITGB8, обнаруженный в клетках BHK179 и BHK-InV, интегрин v 8, по-видимому, не представлен на поверхности клеток BHK в целом. Интегрин v 3 был обнаружен в незначительной степени на адгезивных клеточных линиях, но не на суспензионных клеточных линиях.

Помимо интегринов, связывание лиганда, события интернализации и внутриклеточная передача сигналов могут быть опосредованы протеогликанами гепарансульфата (HS) [33], а приобретение HS в качестве вторичного рецептора часто наблюдается после повторного пассирования вируса ящура в культуре [34]. Окрашивание специфическим антителом выявило большое количество HS на обеих суспензионных клеточных линиях и, в меньшей степени, также на прикрепленных клетках BHK. Известно, что мутации в геноме вируса ящура, приводящие к изменениям белков вирусного капсида, позволяющим использовать HS в качестве рецептора, аттенуируют вирус в естественном хозяине [35]. Таким образом, доступность HS может быть решающим фактором для изменения антигенности вируса ящура независимо от клеточной линии, к которой был адаптирован вирус.

Поскольку отслоение клеток связано с изменениями в актин-миозиновом сократительном механизме [7], а культивирование клеток в суспензии предъявляет различные требования к выживанию, например устойчивость к высокому напряжению сдвига из-за перемешивания культуральной жидкости [6], актиновый скелет был представляет большой интерес в данном исследовании. Микроскопический анализ выявил конформационную перестройку цитоскелета от ретикулярного распределения в прикрепленных растущих клетках до плотной сферической структуры в суспензионных условиях. Это может быть механизмом приспособления к вышеупомянутому высокому напряжению сдвига, и также известно, что оно происходит в клетках CHO в тех же условиях [6]. Но также следует отметить, что, хотя не было существенной разницы в экспрессии большинства генов актина между клетками BHK-InV и BHK-2P на уровне мРНК, значительно больше белка нитевидного актина было обнаружено в восприимчивых к ящуру BHK. -InV, чем у устойчивых к ящуру BHK-2P. Это может быть связано с различной скоростью полимеризации глобулярного актина в филаментозный актин.

По крайней мере, в прикрепленных клетках проникновение вируса ящура зависит от динамики актина. Проникновение вируса индуцирует актиновые взъерошенности, и на ранней стадии инфекции было описано нарушение сети актиновых филаментов путем превращения филаментозного актина в глобулярный актин [36-38]. Судя по цитопатическому эффекту (ЦПЭ), проявляющемуся в адгезированных клетках ВНК при заражении вирусом ящура, в цитоскелете происходят интенсивные перестройки многих его компонентов [38]. Такой CPE не наблюдается в суспензионных клетках из-за их уже сферической формы, но повышенное содержание актина может дать некоторое преимущество вирусу. Из-за различий в актиновом цитоскелете были проведены эксперименты по трансфекции, чтобы сравнить эффективность трансфекции между суспензией и прикрепленными BHK и определить, препятствует ли плотный цитоскелет суспензионных клеток представлению белков на клеточной поверхности. Общеизвестно, что суспензионные клеточные линии очень трудно трансфицировать, что вызвано снижением прикрепления трансфекционного комплекса к клеточной мембране и, как следствие, снижением поглощения полезной нагрузки ДНК [39]. Это подтвердили и наши эксперименты. Но хотя эффективность трансфекции была снижена в клетках BHK-2P по сравнению с адгезивной клеточной линией BHK, не было никакой разницы в способности отображать трансфицированный белок G VSV на клеточной поверхности. Разница в проценте окрашенных клеток наблюдалась между экспрессионными плазмидами pEGFP-N1 и pVSV-G в клетках BHK-2P. Это больше не исследовалось, но это может быть вызвано разным пределом обнаружения между иммунофлуоресцентным окрашиванием, используемым для визуализации VSV-G, и врожденной флуоресценцией EGFP.

Наконец, был проведен анализ транскриптома, чтобы получить больше информации о различиях в транскрипции между прикрепленными и суспензионными клетками BHK, с одной стороны, и между чувствительными к ящуру и устойчивыми к ящуру клеточными линиями BHK, с другой стороны. Наши результаты согласуются с другими исследованиями транскриптомных изменений в клетках CHO, MDCK или HEK во время перехода от прикрепленного к суспензионному росту. В целом, большинство изменений связаны со структурой цитоскелета, клеточным метаболизмом и взаимодействием компонентов ВКМ и усиливаются для суспензионных клеток [7, 40, 41]. Удивительно, но суспензионная клетка BHK-2P, устойчивая к ящуру, показала подавление этих наборов генов, что также может объяснить пониженный уровень актина в клетках BHK-2P по сравнению с клетками BHK-InV. Специфический анализ экспрессии субъединицы интегрина выявил сходные уровни транскриптов субъединицы V интегрина во всех трех клеточных линиях. Самая высокая экспрессия во всех клеточных линиях была обнаружена для субъединицы интегрина 1. Важно отметить, что интегрин 1 может образовывать гетеродимеры с десятью различными цепями и конститутивно экспрессируется большинством клеток млекопитающих [6, 42]. Точно так же субъединица V способна образовывать гетеродимер с пятью различными цепями, но 6 и 8 представлены на поверхности клетки только в сочетании с V [42]. Это точно отражает наблюдаемое обилие транскриптов отдельных субъединиц интегрина. Повышенная транскрипция 3 в прикрепленных клетках также хорошо коррелирует с более высоким сигналом для интегрина v 3 в экспериментах по окрашиванию антител. С другой стороны, наблюдаемые различия в уровнях мРНК ITGB3 и ITGB8 между BHK-2P и BHK-InV не отражались в поверхностном окрашивании. Мы не смогли решить, было ли это просто из-за разной чувствительности между методами количественной оценки мРНК и белка или свидетельствовало о посттранскрипционном блоке экспрессии белка или презентации на поверхности [43]. В целом линии суспензионных клеток BHK-2P и BHK-InV экспрессировали значительно меньше мРНК ITGB1, ITGB3 и ITGB6 по сравнению с линией прикрепленных клеток.

5. Выводы

В заключение, при приготовлении суспензионных клеток крайне важно использовать клон родительских клеток с хорошо известными характеристиками и тщательно проверять полученную клеточную популяцию в процессе адаптации, чтобы убедиться, что клеточная линия сохраняет основные характеристики, в данном случае , восприимчивость к ящуру. Кроме того, современные методы, такие как анализ FACS и транскриптомика, должны использоваться для дальнейшей характеристики производственных клеточных линий.

цистанхе может питать почки и улучшать функцию почек

Благодарности

Мы благодарим Патрика Зитцова за его отличную техническую поддержку.

Вклад автора

Концептуализация:Вероника Дилл, Майкл Эшбаумер.

Формальный анализ:Вероника Дилл, Флориан Пфафф.

Получение финансирования:Элин Циммер, Мартин Бир.

Расследование:Вероника Дилл.

Методология:Вероника Дилл, Флориан Пфафф, Михаэль Эшбаумер.

Администрация проекта:Мартин Бир. Ресурсы: Алин Циммер.

Надзор:Майкл Эшбаумер.

Визуализация:Вероника Дилл, Флориан Пфафф, Михаэль Эшбаумер.

Письмо – первоначальный вариант:Вероника Дилл.

Написание – просмотр и редактирование:Вероника Дилл, Флориан Пфафф, Алин Циммер, Мартин Бир, Михаэль Эшбаумер.

использованная литература

1. Мертен О.В. Достижения в культуре клеток: зависимость от якоря. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Дингерманн Т. Рекомбинантные терапевтические белки: производственные платформы и проблемы. Биотехнология J.2008; 3(1):90–7.

3. Эрнандес Р., Браун Д.Т. Рост и поддержание клеток почек детенышей хомячка (BHK). Курр ProtocMicrobiol. 2010 г.; Глава 4: Приложение 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, et al. Адаптация клеток ВНК, продуцирующих рекомбинантный белок, к бессывороточной и бесбелковой средам. Цитотехнология. 1998 год; 26(1):59–64.

5. Гаски Л.Э., Дженкин Х.М. Адаптация клеток BHK-21 к росту в шейкерной культуре и последующему заражению вирусом японского энцефалита. Приложение микробиол. 1975 год; 30 (3): 433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Вальтер К.Г., Уитфилд Р., Джеймс Д.С. Значение взаимодействия между интегрином и актиновым цитоскелетом в суспензионной адаптации клеток СНО. Заявл. Биохим Биотехнолог. 2016; 178 (7): 1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Мониторинг изменений в протеоме во время поэтапной адаптации клеточной линии MDCK от прилипания к росту в суспензии. вакцина. 2015 г.; 33 (35): 4269–80.

8. Коста А.Р., Уизерс Дж., Родригес М.Е., Маклафлин Н., Энрикес М., Оливейра Р. и др. Влияние адаптации клеток к бессывороточным условиям на профиль гликозилирования моноклонального антитела, продуцируемого клетками яичника китайского хомячка. Н Биотехнолог. 2013; 30 (5): 563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. Селекция клеток-хозяев антигенных вариантов вируса ящура. Джей Ген Вирол. 1989 год; 70 (часть 1): 45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Интегрин-актиновые взаимодействия. Cell Mol Life Sci. 2005 г.; 62 (10): 1081–99.

11. О'Доннелл В., Пачеко Дж. М., Грегг Д., Бакст Б. Анализ экспрессии рецептора интегрина вируса ящура в тканях наивного и инфицированного крупного рогатого скота. J Комп Патол. 2009 г.; 141 (2–3): 98–112. PMID: 19515380

12. Дилл В., Хоффманн Б., Циммер А., Бир М., Эшбаумер М. Адаптация вируса ящура Азии-1 к суспензионной культуре: устойчивость клеток преодолевается за счет изменений вирусного капсида. Вирусы. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID: 28820470

13. Макферсон И., Стокер М. Полиома-трансформация клонов клеток хомячка — исследование генетических факторов, влияющих на компетентность клеток. Вирусология. 1962 год; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Процесс культивирования клеток-микроносителей для размножения вируса бешенства в клетках Vero, выращенных в биореакторе с мешалкой в ​​условиях полного отсутствия компонентов животного происхождения. вакцина. 2007 г.; 25 (19): 3879–89.

15. Martin M. Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из считываний высокопроизводительного секвенирования. EMBnetjournal. 2011 г.; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon обеспечивает быструю количественную оценку экспрессии транскриптов с учетом смещения. Нат Методы. 2017; 14(4):417–9.

17. Шривастава А., Малик Л., Саркар Х., Закери М., Альмодареси Ф., Сонесон С. и др. Методология выравнивания и картирования влияет на оценку распространенности транскриптов. Геном биол. 2020; 21(1):239.

18. Лав М.И., Хубер В., Андерс С. Модерированная оценка изменения кратности и дисперсии для данных секвенирования РНК с помощью DESeq2. Геном биол. 2014; 15(12):550.

19. Чжу А., Ибрагим Дж.Г., Любовь М.И. Априорные распределения с тяжелыми хвостами для данных подсчета последовательностей: удаление шума и сохранение больших различий. Биоинформатика. 2019; 35 (12): 2084–92.

20. Кларк Дж.Б., Спир Р.Э. Различия в восприимчивости популяций ВНК и клонированных клеточных линий к трем штаммам вируса ящура. Арх Вирол. 1980 г.; 63(1):1–9.