N-Гидроксициннамоилфеналкиламиды (36Н) проявляли как антиоксидантную, так и антитирозиназную способности. Соединение изучали на предмет его антиоксидантных свойств с использованием теста на поглощение 1,1-дифенил-2-пикрилгидразол- (DPPH-), оценки антиоксидантной способности, восстанавливающей ионы трехвалентного железа (FRAP), и анализа металл- анализ хелатирующей способности. Результаты показали, что 36H обладал антиоксидантными способностями в тестах на поглощение DPPH и восстановление железа, но анализ хелатирующей способности не продемонстрировал антиоксидантную способность. 36H также измеряли на тирозиназоингибирующую активность с использованием платформ различных видов, включая грибы in vitro, мышиную меланому B16F10 и клетки меланоцитов человека. В отношении подавления тирозиназы грибов in vitro 36Н сдерживал процессы меланогенеза. Предполагается, что 36H блокирует активный центр тирозиназы в качестве конкурентного ингибитора тирозиназы грибов, следовательно, не снижает жизнеспособность нормальных клеток меланоцитов человека. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR) и вестерн-блоттинг обнаружили, что 36H подавляет РНК и белки, связанные с меланогенезом, включая продукцию пигмента (MITF, тирозиназа, TRP-1 и TRP-2). , созревание меланосом (Rab27a) и транспорт меланосом (Myo5a, MLPH и Mreg). В целом, 36H проявлял биофункции антиоксидантной защиты и подавления меланина, поэтому существовала возможность его применения в качестве пищевой добавки или средства для отбеливания кожи.

Согласно соответствующим исследованиям,цистанхеэто обычная трава, которая известна как «чудотравачто продлевает жизнь». Его основным компонентом являетсяцистанозид, который имеет различные эффекты, такие какантиоксидант, противовоспалительное средство, ипродвижение иммунной функции. Механизм взаимодействия цистанхе икожаотбеливаниезаключается в антиоксидантном действиицистанхе гликозиды. Меланин в коже человека образуется в результате окислениятирозинкатализируетсятирозиназа, иокислениереакция требует участия кислорода, поэтому свободные радикалы кислорода в организме становятся важным фактором, влияющим на выработку меланина. Цистанхе содержитцистанозид, который является антиоксидантом и может уменьшить образование свободных радикалов в организме, таким образомингибирование выработки меланина.

Нажмите на добавку Cistanche Tubulosa.

Попросить больше:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Введение

Кожа человека — самый большой орган человеческого тела; он поддерживает функции организма и предотвращает потерю воды, электролитов и биомолекул. Кожа состоит из эпидермиса, дермы и гиподермы. Эпидермис далее делится на пять отдельных слоев: роговой слой, блестящий слой, зернистый слой, шиповатый слой и базальный слой [1]. Базальный слой эпидермиса, связанный с дермой, представляет собой базальный слой, содержащий меланоциты. Меланоциты имеют дендриты для переноса меланина в кератиноциты, которые определяют цвет поверхности кожи за счет содержания меланина в этих кератиноцитах [2].

Свободные радикалы состоят из атома или группы атомов, которые имеют один или несколько неспаренных электронов. Они участвуют в физиологических, метаболических и иммунных реакциях и функциях передачи сигналов. Хотя они являются частью нормальных здоровых биохимических процессов в организме, они также несут ответственность за ущерб. Активные формы кислорода (АФК) и различные свободные радикалы стимулируются образованием анионов супероксида или пероксидов водорода. Это может привести к запутанному обмену сообщениями, повреждению клеточных мембран и повреждению связи ионных клеток из-за перекисного окисления липидов. Это затрагивает внутриклеточные молекулы, содержащие SH-группы и действующие белки и ДНК [3]. Количество АФК контролируется системами самозащиты, которые в нормальном состоянии опосредованы антиоксидантами, такими как антиоксиданты. К ним относятся витамин С, витамин Е или глутатион [4], которые удаляют свободные радикалы, предотвращая повреждение клеток. Однако они нарушают баланс клеточной степени окисления, что приводит к слишком большому количеству АФК. Предыдущие исследования показали, что многие дегенеративные заболевания, такие как старение и рак, вызваны активными формами кислорода или свободными радикалами. Антиоксидантные свойства предполагают, что перекисное окисление липидов в мембранах меланоцитов увеличивает содержание внутриклеточного глутатиона, что может быть причиной депигментации [5, 6].

Потемнение кожи, глаз и волос вызвано синтезом меланина, пигментированного биополимера, который синтезируется в меланосомах меланоцитов. Меланин является защитным механизмом от повреждения УФ-светом [7]. Врожденные гены могут влиять на цвет кожи, но индукция ультрафиолетового излучения, воспаление и гормональные изменения заставляют меланоциты синтезировать больше меланина. Тем не менее перепроизводство меланина может вызывать нарушения пигментации, такие как меланодермия, сенильное лентиго, веснушки и гиперпигментация [8]. Их обычно лечат с помощью косметики или фармацевтических ингредиентов, содержащих отбеливающие кожу компоненты. Несмотря на то, что эти элементы происходят из природных источников, только некоторые вещества используются в косметике или лекарствах из соображений безопасности или эффективности отбеливания. Меланогенез включает связывание -меланоцитостимулирующего гормона с меланокортином -1, который увеличивает циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) и активирует факторы транскрипции, связанные с микрофтальмом (MITF) [9]. MITF активирует экспрессию меланогенного фермента тирозиназы, который выполняет важную функцию в гидроксилировании L-тирозина до дигидроксифенилаланина (L-DOPA) и окислении L-DOPA до допахинона [10]. В медицинских и косметических процедурах все чаще используются ингибиторы активности тирозиназы. Производство меланогенеза и перенос меланосом от меланоцитов к кератиноцитам необходимы для окраски кожи [11]. Меланосомы связаны с актиновым цитоскелетом на периферии меланоцитов через тройной комплекс, образованный Ras-родственным белком Rab-27 (Rab27a), меланофилином (MLPH) и миозином Va (Myo5a). Rab27a представляет собой связанный с мембраной белок, участвующий в транспорте белка и опосредованной малой ГТФазой передаче сигнала. Меланофилин образует тройной комплекс с Rab27a в месте связывания GTP с Myo5a, который является моторным белком. Видимая пигментация волос и кожи млекопитающих соответствует этому трехбелковому комплексу, связывающему органеллы, производящие пигмент. При недостатке комплексного белка нарушается связь между F-актином и меланосомой [12].

Сообщается, что в рамках положительного терапевтического потенциала соединений N-гидроксициннамоилфеналкиламиды (36H) оказывают ингибирующее действие на экспрессию матриксных металлопротеиназ- (MMP-) 9 в THP-1, моноцитарной клеточной линии лейкемии человека, которая стимулируется фактором некроза опухоли- (TNF-) [7]. Предыдущее исследование показало, что индуцированная TNF-экспрессия MMP-9 как для белков, так и для мРНК полностью ингибируется в зависимости от концентрации (1–20 мкМ). Было обнаружено, что 36H заметно подавлял энхансер гена полипептида ядерного фактора-κ light в передаче сигналов В-клеток (NF-κB), что было обнаружено с помощью анализа репортерного гена NF-κB, но не влиял на деградацию (ядерного фактора полипептида κ-light). энхансер гена в ингибиторе В-клеток (IκB) или транслокации NF-κB. Данные иммунопреципитации хроматина показали, что принадлежность между MMP-9 и промотором субъединицы p65 (p65) NF-κB полностью отрицалась 36H, а фосфорилирование p65 не подвергался влиянию. В общем, предыдущий отчет продемонстрировал, что 36H подавляет секрецию MMP-9 за счет направленного на ядро ​​подавления механизмов пути NF-κB в THP-1. 36H является аналогом кофеиновой кислоты фенетиловый эфир (CAPE), который является известным супрессором метастазирования и инвазии рака [14].Были изучены антиоксидантная активность и нейтрализация свободных радикалов некоторых аналогов CAPE, и результаты этих исследований побудили это исследование определить, снижает ли 36H активность тирозиназы и подавление РНК и белков, связанных с меланогенезом. Это исследование показало, что 36H является потенциальным и положительным антиоксидантом и средством для отбеливания кожи.

2. Материалы и методы

2.1. Реагенты и материалы.Диметилсульфоксид (ДМСО) и L-тирозин были получены от Sigma-Aldrich Chemical Inc. (Сент-Луис, Миссури, США). Модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) и фетальную бычью сыворотку (FBS) приобретали у Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Все реагенты и альтернативные буферы были получены с наивысшей коммерческой чистотой.

2.2. Химический синтез 36H.36H был предоставлен профессором Yueh-Hsiung Kuo, который использовал последующие методы связывания амида для получения соединений. Бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)-фосфония гексафторфосфат (ВОР) объединяли со смесью R2-NH2, R1-COOH и триэтиламина (Et3N) в диметилформамиде (ДМФА). Реакционный раствор перемешивали в течение 3{{1{{30}}}} мин при 0°С, а затем перемешивали при 25°С в течение 2 часов. Когда химическую жидкость выпаривали, остаток разделяли между H2O и этилацетатом (AcOEt). Затем остаток фильтровали и очищали с помощью колоночной хроматографии с элюирующим раствором (AcOEt–CH2Cl2, 1:1, об./об.) на силикагеле (70–230 и 230–400 меш, Merck 7734). Продукты были перекристаллизованы из AcOEt, чтобы получить наилучшую окислительную медицину и клеточное долголетие, а также самые идеальные кристаллы. Для масс-спектрометрии электронного удара (EIMS) использовали масс-спектрометр Finnigan TSQ-46C. Спектры ЯМР 1Н и 13С получали на спектрометре Bruker Avance 500. На спектрофотометре Nicolet Magna-IR 550 регистрировали ИК спектры. 36H первоначально растворяли в растворе ДМСО перед последующими исследованиями. Для каждого анализа использовали ДМСО с постоянной и конечной концентрацией 0,2% (об./об.). Это соединение не было известно как антиоксидант или отбеливатель кожи [7, 13], и его структура показана на рисунке 1. Образцы растворяли в ДМСО и готовили различные концентрации с конечной концентрацией ДМСО менее 0,5 процента.

2.3. Анализ способности DPPH поглощать радикалы.DPPH представляет собой 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил, который становится темно-фиолетовым при наличии свободного радикала. Когда антиоксидант удаляет радикал из DPPH˙, он восстанавливает DPPH˙ до стабильного DPPH, который имеет светло-желтый цвет [14]. Различные дозы 36H (2 мкл в общем объеме) объединяли в 98 мкл смеси DPPH (60 мкМ) и планшет исследовали с помощью спектроскопического ридера для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с длиной волны 517 нм. В качестве положительного контроля использовали L-аскорбиновую кислоту. Отношения остаточного DPPH были нанесены на карту рядом с образцом, чтобы определить количество антиоксиданта, которое снижает прежнюю концентрацию DPPH. Свойство очистки (в процентах) определяли как

2.4. Анализ снижения мощности.Анализ антиоксидантной способности, восстанавливающей ионы железа (FRAP), часто применяется для оценки антиоксидантной способности напитков, продуктов питания, фруктов и пищевых добавок, включая флавоноиды или полифенолы. Различные дозы 36H вводили в смесь 67 мМ фосфатного буфера (0.085 мл, pH 6,8) и 20% феррицианида калия [K3Fe(CN)6, 2,5 мкл). Раствор реагировал в течение 20 мин при 50°С, затем в раствор добавляли трихлоруксусную кислоту (10%, 0,16 мл) и центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин [14]. Супернатант раствора (75 мкл) смешивали с 2-процентным раствором FeCl3 (25 мкл), а затем с помощью спектроскопического ридера ELISA измеряли полученное поглощение при 700 нм для 96-луночного планшета. В качестве положительного контроля использовали бутилгидроксианизол (БГА). Чем больше восстановительная квалификация, тем сильнее поглощение.

2.5. Анализ металлохелатирующей активности.Потенциал хелатирования ионов железа хлорофилла измеряли с использованием методики Chen et al. [14]. Вкратце, определенные дозы образцов растворяли в ДМСО и вводили в смесь FeCl2·4H2O (2,0 мМ, 0,05 мл). Добавление феррозина (5 мМ, 0,2 мл) инициировало реакцию, когда раствор сильно встряхивали, а затем оставляли на 10 мин при 25°С. Когда реакция достигала равновесия, значения поглощения раствора определяли при 560 нм, используя пустой автомобиль. ЭДТА использовали в качестве положительного контроля. Формула расчета хелатирующей активности была идентична (1).

2.6. Анализ активности тирозиназы грибов.Как подавление активности тирозиназы грибов, так и ингибирование клеточной тирозиназы определяли спектрофотометрически с использованием предыдущего метода с небольшими изменениями [2]. Койевую кислоту использовали в качестве положительного контроля для анализа активности тирозиназы. Материалы сначала растворяли в водном ДМСО и культивировали в L-тирозине (2,5 мг/мл) с фосфатным буфером (50 мМ, рН 6,8). Во всех моделях использовали ДМСО, который не имеет отношения к активности тирозиназы, когда ДМСО представляет собой<0.5% of the total volume. Subsequently, 25 U/mL of mushroom tyrosinase with an identical buffer was then added, and the solution was incubated at 37° C for 30 min. An ELISA spectroscopic reader was used to conduct the absorbance measurements for the assays at 475 nm, using 96-well microplates (Molecular Devices, CA, USA).

2.7. Культуры клеток меланоцитов человека (HMC).Первичные эпидермальные меланоциты человека из крайней плоти новорожденных были приобретены у Cascade Biologics. Это также применялось Wang et al. [2]. Его культивировали в среде 254 (M-254- 500; Cascade Biologics, Портленд, штат Орегон, США) и усиливали добавкой для роста меланоцитов человека (HMGS, каталожный номер S-002-5). Среда 254 представляет собой базальную среду с некоторыми заменимыми и незаменимыми витаминами, органическими соединениями, аминокислотами, неорганическими солями и микроэлементами. Добавка для роста меланоцитов человека включала эмбриональную бычью сыворотку, бычий инсулин, экстракт бычьего гипофиза, бычий трансферрин, гидрокортизон, основной фактор роста фибробластов, форбол 12-миристат 13-ацетат и гепарин. Все клетки инкубировали при 37°С во влажном инкубаторе с 5-процентной атмосферой СО2.

2.8. Определение жизнеспособности клеток HMC.Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста [3]. Когда желтый тетразол соединяется с митохондриальной дегидрогеназой (убихиноном) в живых клетках, тетразолиевые кольца МТТ расщепляются и восстанавливаются до фиолетового формазана. Клетки высевали с плотностью 9 × 1{8}}3 клеток/лунку в 96-луночные планшеты. Когда клетки культивировали в течение суток, среду меняли и добавляли различные концентрации 36Н до конечного объема среды 100 мкл. После инкубации в течение 48 часов среду заменяли свежей средой (100 мкл), включающей МТТ (0,5 мг/мл). Затем планшет культивировали в инкубаторе при 37°C в течение 2 часов с 5% CO2. Затем в каждую лунку добавляли ДМСО (100 мкл) для растворения фиолетовых кристаллов формазана. Чтобы убедиться, что чашки достигли максимального растворения, чашки осторожно встряхивали и перемешивали в темноте в течение 10 минут и измеряли при 595 нм. Рост клеток рассчитывали как

2.9. Измерение активности тирозиназы из HMC.Для определения тирозиназной активности в клетках-меланоцитах человека (HMC) (5 × 104 клеток на лунку) их помещали в 12-луночные планшеты в 1000 мкл среды с различными дозами 36Н и культивировали в течение 48 ч [2]. . Буфер PBS использовали для промывания клеток, обработанных образцом, а затем их лизировали 1-процентным раствором Triton X-100/PBS. Экстракт фермента затем собирали из полученного клеточного лизата и объединяли с 50 мкл 2 мМ L-тирозина. Затем экстракты инкубировали в течение 3 часов при 37°С в темноте. Затем с помощью спектрофотометра определяли их оптическую плотность при 490 нм.

2.10. Определение содержания меланина в ГМК.С небольшими изменениями в этом эксперименте также использовалась предыдущая методика [2]. Осадок клеток растворяли в 2,0 н. NaOH с 10% ДМСО и нагревали до 90°С в течение 1 часа. Суспензии разделяли центрифугированием в течение 10 мин при 10,000g. Используя спектрофотометр, содержание меланина определяли по данным, полученным при уровне поглощения 475 нм.

2.11. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени.Для qRT-PCR 20 мкл реакционной смеси содержали 0,4 мл смеси двух обратных транскриптаз: 10 мкл 2 × QuantiTect SYBR Green Master Mix (QIAGEN, Valencia , Калифорния, США) с Taq-полимеразой горячего старта, 0,8 мл праймеров и 0,5 мл (10 нг/мл) матрицы. Последовательности праймеров перечислены в таблице 1. Система StepOnePlus™ использовалась для всех анализов ПЦР в реальном времени. Реакцию завершали проведением RT-реакции при 42°C в течение 20 мин и последующей активацией ДНК-полимеразы FastStart Taq при 95°C в течение 5 мин. Затем его амплифицировали в течение 40 или 50 циклов при 95°C в течение 5 секунд для денатурации, отжига и получения при 60°C в течение 5 секунд. Наконец, его удлиняли при 72°С в течение 15 секунд. Флуоресценцию также можно измерить после фазы удлинения, но в этом эксперименте ее измеряли после фазы отжига. С помощью 96-луночного планшета 9 мкл лизата добавляли к 11 мкл реакционной смеси, которая состояла из 10,6 мкл MasterMix из базового набора Eurogentec qPCR для SYBR Green I (1,4 мкл 50 мМ MgCl2, 2 мкл 10-кратного реакционного буфера, 0,8 мкл 5 мМ смеси dNTP, 0,6 мкл SYBR Green I, 5,7 мкл воды без нуклеаз и 0,1 мкл горячей полимеразы GoldStar Taq), 0,1 мкл РНК MS2, 0,1 мкл 10-кратно разведенного ингибитора РНКазы и 0,1 мкл праймера REV (100 мкМ), а также MS2 FWD для анализов SG-PERT на системе ABI 7300 qPCR. Для реакции qRTPCR, активации горячего фермента GoldStar Taq, 40-циклической амплификации, отжига и получения, денатурации при 95°C и удлинения при 72°C использовали прибор ABI 7300. Для подготовки анализа все реагенты хранили либо на охлаждающем блоке, либо на льду. Для каждого образца лизата проводили повторные реакции SGPERT. Используя программное обеспечение и инструменты для количественной ПЦР, ABI 7300 с его пороговым значением, определенным вручную, и LightCycler® 480 с его методом максимальной второй производной, сгенерировали значения цикла количественного определения (Cq). Используя одно и то же программное обеспечение для обоих приборов, были также автоматически рассчитаны пики плавления.

2.12. Вестерн-блоттинг.В общей сложности 1 × 105 клеток обрабатывали группами образцов или контрольным холостым носителем в течение двух дней. Клетки собирали и лизировали буфером для лизиса (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 137 мМ хлорида натрия, 50 мМ L-фторида натрия, 10 мМ пирофосфата натрия, 20 мМ-глицерофосфата, 1 мМ фенилметилсульфонил-L-фторида). , 1 мМ ЭДТА, 10 % глицерина, 1 % нонидет P-40, 2 мкМ лейпептина, 0,1 мМ ортованадата натрия и 2 мкг/мл апротинина) [14]. Лизаты центрифугировали при 20,000 × g в течение 30 минут, а концентрации белка в растворе супернатанта определяли с помощью набора для анализа белков с бицинхониновой кислотой (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA). Равные количества белка разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), а затем электропереносили на нитроцеллюлозную мембрану (PALL Life Science, Анн-Арбор, Мичиган, США). Мембрану блокировали на 1 час 5-процентным обезжиренным молоком в буфере PBS-T (PBS, содержащий 0,1 процента Tween 20). Пленка для переноса была осторожно удалена из резервуара для влажного переноса и прорези для полусухого переноса и помещена в коробку с 5-процентным обезжиренным молоком в 1x TBST на 1 час при комнатной температуре. Затем его осторожно промывали 1x TBST для удаления следов обезжиренного молока. Затем мембрану инкубировали с соответствующими первичными антителами. В каждом случае мембраны инкубировали с антикроличьим или мышиным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, а затем обрабатывали реагентами для обнаружения ECL (PerkinElmer, ECL1: ECL2=1: 1). Для обнаружения полос использовалась миниатюрная система хемилюминесцентной визуализации от Life Science [14].

2.13. Статистический анализ.Использовали три концентрации каждой концентрации для стандарта и образцов. Используя критерий Стьюдента, результаты статистически сравнивали и выражали с использованием среднего значения средних значений ± стандартное отклонение (SD).

3. Результаты

3.1. Активность по удалению свободных радикалов DPPH.АФК могут генерировать перекиси липидов, повреждение ДНК, экспрессию белков, старение тканей и возникновение рака, когда нарушается баланс между свободными радикалами и присущими им антиоксидантами. Свободнорадикальные цепные реакции блокируются путем нейтрализации донорства или акцепта электронов и хелатирования свободных неподеленных пар. Уменьшение окислительного стресса от внутренних и внешних аспектов — один из способов улучшить здоровье. В этом исследовании изучались антиоксидантные свойства путем определения способности восстанавливать железо, способности DPPH поглощать свободные радикалы и способности хелатирования металлов. Повышенное образование и накопление АФК вызывает окисление липидов в продуктах питания и косметике и естественную антиоксидантную активность. В частности, способность поглощать свободные радикалы жизненно важна для функциональных пищевых добавок и средств по уходу за кожей.

Первым тестом на ингибицию окисления был тест на поглощение свободных радикалов DPPH. Это простая и экономичная экспериментальная платформа, в которой антиоксиданты предотвращают образование продуктов окисления. Антиоксиданты изменяют цвет стабильного радикального реагента DPPH с фиолетового на светло-желтый дифенилпикрилгидразина. Чтобы определить антиоксидантные свойства 36H, применяли дозу 100 мкМ для определения способности к удалению. Таблица 2 показывает, что 36H проявляет превосходную способность поглощать свободные радикалы и поглощает 60 процентов свободных радикалов DPPH, а витамин С при той же концентрации (100 мкМ) поглощает 85,3 процента.

3.2. Железо, уменьшающее антиоксидантную силу.Второй тест на ингибицию окисления - это тест на способность восстанавливать железо, который является распространенным и надежным способом измерения синтеза комплекса Fe(III)-феррицианид. Функциональный агент восстанавливает комплексы Fe3 plus/феррицианид до двухвалентной формы. Эта комбинация имела синий цвет при 7{{10}}0 нм, потому что K4Fe(CN)6 прореагировал с Fe3 plus с образованием Fe[Fe(CN)6]3. В эксперименте цвет раствора менялся от светло-желтого до различных оттенков синего и зеленого в зависимости от восстановительной способности целевого соединения. В таблице 2 показано, что BHA при 100 мкМ имеет значение восстановительной способности 0,95, а 36H при 100 мкМ имеет значение восстановительной способности 0,85 по сравнению с BHA. Следовательно, было показано, что 36H обладает хорошей антиоксидантной способностью восстанавливать железо.

3.3. Способность к хелатированию ионов железа.Хелатирующая активность ионов двухвалентного железа 36H показана в таблице 2. ЭДТА (100 мкМ) использовали в качестве положительного контроля. Fe2 plus и феррозин количественно образуют комплексы. Образование комплексов реагентов часто нарушается из-за хелатирующих агентов, что приводит к уменьшению красной окраски комплекса. 36H в дозе 10 мкМ не оказывал значительного влияния на способность поглощать Fe2 плюс -, а в концентрации 100 мкМ он проявлял ингибирование на 43,2%. Положительный контроль, ЭДТА, имел приблизительно 80-процентную способность к хелатированию ионов при концентрации 100 мкМ.

3.4. Влияние 36H на активность тирозиназы грибов.Ингибирование активности тирозиназы было описано в многочисленных сообщениях, в большинстве из которых в качестве модели использовалась тирозиназа грибов. Преимущества хорошо изучены учеными, простые процедуры, низкая стоимость, быстрый процесс пигментации, сходные структурные и функциональные характеристики, как у млекопитающих, и удобство наблюдения за развитием меланина. Было изучено ингибирование активности тирозиназы грибов с помощью 36H, и ингибирующая способность имела положительную корреляцию с концентрацией 36H (рис. 2(а)). На пятнадцатой минуте было видно, что 36Н в различных концентрациях (1, 5 и 10 мМ) по сравнению с контролем снижает значения ОП. Активность фермента снижается примерно на 10 процентов при 1 мМ, 30 процентов при 5 мМ и 40 процентов при 10 мМ по сравнению с контрольным носителем (рис. 2(b)). Изучена зависимость между активностью тирозиназы и ее концентрацией в 36Н. Различные концентрации ингибитора дают группу линий, которые все проходят через начало координат. Ингибирование активности тирозиназы 36H не влияло на количество фермента, что свидетельствует о том, что 36H является обратимым ингибитором (рис. 2(c)). Тип ингибирования тирозиназы с помощью 36H был подтвержден с использованием двойного обратного графика Лайнуивера-Берка. Графики зависимости 1/v от 1/[s] давали семейство прямых линий, проходящих через начало координат, что свидетельствовало о том, что 36H был конкурентным комплексом. Кинетика фермента представлена ​​на рисунке 2(d).

3.5. Влияние жизнеспособности клеток, содержания клеточной тирозиназы и меланина на 36H в HMC.В качестве сильнодействующего средства для осветления кожи компонент должен быть безвредным, без нежелательных цитотоксических побочных эффектов. Есть некоторые хорошо известные ингибиторы синтеза меланина, включая койевую кислоту, арбутин, PTU или гидрохинон, которые в настоящее время используются во всем мире в качестве косметических ингредиентов. Мы также обнаружили, что эти ингибиторы меланогенеза могут вызывать онкогенность кожи человека при высоких концентрациях или частом использовании [2]. HMC культивировали в 36H в течение 48 часов при различных концентрациях 1, 5, 10 и 25 мкМ, и определяли жизнеспособность клеток, чтобы показать низкую клеточную токсичность на рисунке 3 (a). При рассмотрении агента для терапевтического или косметического применения у людей мы обнаружили, что цитотоксические последствия для жизнеспособности клеток кожи человека были незначительными. Чтобы понять ингибирующее действие 36H на меланогенез, мы оценили активность внутриклеточной тирозиназы в HMC. Результаты по активности тирозиназы в HMC показали, что при увеличении концентрации наблюдалось очевидное изменение, а активность тирозиназы снижалась при низкой клеточной токсичности. После лечения активность тирозиназы снизилась до 39 ± 2,2 процента при 25 мкМ дозозависимым образом (рис. 3(b)). Эти результаты показали, что 36H ингибирует активность внутриклеточной тирозиназы. Результаты анализа меланина ясно показали, что 36H снижает содержание меланина в HMC дозозависимым образом (рис. 3(c)). Процент контроля представляет собой содержание меланина. После обработки содержание меланина составляло 77 процентов при 25 мкМ, 84 процента при 10 мкМ, 88 процентов при 5 мкМ и 90 процентов при 1 мкМ. Эти результаты показали, что 36H оказывает значительное ингибирующее действие на синтез меланина в HMC при 25 мкМ.

3.6. мРНК и белки, связанные с биосинтезом меланина, находились под влиянием 36H в HMC.Биосинтез меланина происходит в меланосомах, а исходным аминокислотным субстратом является тирозин. Тирозин сначала катализируется до L-ДОФА с помощью тирозиназы, а с помощью того же фермента, тирозиназы, ДОФА катализируется до допахинона. Допахинон катализируется дофахромтаутомеразой (родственным тирозиназе белком - 2, TRP-2), TRP-1 и тирозиназой с образованием эумеланина. В HMC 36H подавлял клеточные РНК и белки, связанные с меланогенезом, как показано на рисунке 4.

3.7. Влияние 36H на созревание меланосом.Меланосома представляет собой органеллу, которая зависит от синтеза меланина внутри меланоцитов. Чем больше созревают меланосомы, тем больше образуется меланина. Таким образом, созревание меланосом играет важную роль в механизме отбеливания кожи. Премеланосомный белок 17 (Pmel17) нацелен на предшественников пигментных органелл, меланосом, где он протеолитически процессируется на несколько небольших фрагментов. Некоторые из этих фрагментов образуют непатологические амилоиды, которые собираются в листы и образуют полосатую структуру, лежащую в основе ультраструктуры меланомы. Это исследование показало, что 36H снижает экспрессию РНК и белка Pmel17 в HMC (рис. 5).

3.8. Влияние 36H на транспорт меланосом.Rab27a, MLPH и Myo5a образуют комплекс из трех белков для связывания меланосом на периферии меланоцитов. В процессе меланосомного транспорта тройной комплекс является связующим звеном между актиновым цитоскелетом и меланосомой. Недостаток этих белков влияет на транспорт, а меланорегулин (Mreg) управляет переносом меланосомы от меланоцитов к кератиноцитам посредством регулируемого механизма отщепления. Это исследование показало, что 36H снижает транспорт меланосом, воздействуя на эту родственную РНК и белки (рис. 6).

Запросите дополнительную информацию: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501