13-недельное исследование субхронической токсичности 2-(l-ментокси)этанола на крысах F344

Введение

2-(1-ментокси)этанол (номер CAS 38618-23-4) представляет собой прозрачную бесцветную жидкость с характерным запахом и широко используется в качестве ароматизатора. Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) оценил 2-(l-метокси)этанол как ароматизатор, отнесенный к веществам, структурно родственным ментолу.1. В зависимости от структурного класса ароматизаторов 2-(l-метокси)этанол был отнесен к классу I. В США и Европе уровни потребления 2-(l-метокси)этанола для людей оценивается в 12 мкг/человек/день и 0,01 мкг/человек/день соответственно, что ниже порога класса I, равного 1800 мкг/человек/день. На основании этих оценок считается, что 2-(1-ментокси)этанол может не представлять проблем безопасности при обычном использовании в качестве ароматизатора.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 мг/кг массы тела [МТ])1. Несмотря на использование 2-(1-ментокси)этанола в качестве ароматизатора, доступны ограниченные данные о токсичности этого соединения при многократном приеме. Наша лаборатория исследовала токсичность нескольких пищевых добавок, включая типичные ароматизаторы из каждой категории, на моделях грызунов2–7. Чтобы уточнить токсикологический профиль и установить уровень, при котором не наблюдается побочных эффектов (NOAEL), мы провели 13-недельное исследование субхронической токсичности 2-(1-ментокси)этанола, которое перорально крысам F344 через зонд.

Материалы и методы

Испытательное химическое вещество

2-(1-ментокси)этанол (партия № 5I0002, чистота 99,9%) производства Takasago Int. Corp. (Токио, Япония) предоставлена ​​Отделом стандартов и оценки Департамента безопасности пищевых продуктов Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии при поддержке Японской ассоциации ароматизаторов и ароматизаторов (Токио, Япония). Хотя тестируемое вещество было предоставлено в виде смеси оптических изомеров (номер CAS 38618-23-4), производитель подтвердил, что оно является l-энантиомером (номер CAS 75443-64-0). Пероральный зонд с кукурузным маслом (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония) в качестве носителя был выбран в качестве пути введения из-за нерастворимости в воде и летучести 2-(1-ментокси)этанола. Растворы 2-(1-ментокси)этанола готовили ежедневно, непосредственно перед введением. После хранения в течение 2 часов при комнатной температуре остаточные соотношения 2-(1-ментокси)этанола в растворе 4, 40 и 400 мг/мл были подтверждены как 96,8%, 99,8% и 96,5%. соответственно, методом газовой хроматографии (Японская инспекционная ассоциация пищевой промышленности и окружающей среды пищевой промышленности, Токио, Япония).

Экспериментальные животные

В общей сложности 40 самцов и 40 самок крыс, свободных от специфических патогенов (F344/DuCrlCrlj, 5 недель), были приобретены у Charles River Laboratories Japan (Йокогама, Япония) и использованы после акклиматизации в течение одной недели. В ходе исследования животных содержали в клетках из поликарбоната с мягкой подстилкой из щепы, содержали в помещении с барьерной системой для контроля светового/темнового цикла (12 ч), вентиляции (скорость воздухообмена 18 раз/час), температуры ( 24 ± 1 градус) и относительной влажности (55 ± 5%). Клетки и подстилку для щепы заменяли два раза в неделю. Каждое животное имело свободный доступ к водопроводной воде и основному рациону (CRF-1; Oriental Yeast, Токио, Япония). В начале эксперимента животных случайным образом распределяли на четыре группы по 10 самцов и самок крыс в каждой на основании массы тела, измеренной непосредственно перед началом обработки тестируемым химическим веществом.

Дизайн исследования

В предварительном {{0}}дневном исследовании по оценке 2-(1-ментокси) этанола, вводившегося в дозах 0, 200, 400 и 800 мг/кг массы тела/ день абсолютная и относительная масса печени была значительно увеличена во всех обработанных группах обоих полов (данные не показаны). На основании этих результатов мы выбрали дозы 2-(1-ментокси) этанола 0, 15, 60 и 250 мг/кг массы тела/день для введения как самцам, так и самкам крыс в настоящем {{ 13}недельное исследование токсичности.

Общее состояние и смертность оценивали ежедневно. Массу тела, а также количество поступающего и остаточного рациона измеряли один раз в неделю в течение экспериментального периода. После завершения лечения всех крыс голодали в течение ночи, а образцы крови для гематологических и биохимических исследований сыворотки собирали из брюшной аорты под глубокой ингаляционной анестезией с использованием изофлюрана. Дизайн исследования был разработан в соответствии с «Руководством по назначению пищевых добавок и пересмотру стандартов использования пищевых добавок Японии» (1996 г.) и одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Национального института медицинских наук Японии.

Гематология и биохимия сыворотки

С помощью автоматических гематологических анализаторов ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Вестбрук, Мэн, США) анализировали следующие гематологические параметры: количество лейкоцитов (WBC), количество эритроцитов (RBC), концентрацию гемоглобина (HGB), гематокрит (HCT), средний корпускулярный объем (MCV), средний корпускулярный гемоглобин (MCH), средняя концентрация корпускулярного гемоглобина (MCHC), количество тромбоцитов (PLT) и дифференциальные лейкоцитарные клетки, включая нейтрофилы (Neut), лимфоциты (Лимфа), моноциты (Моно), эозинофилы (Эозино) и базофилы (Басо). Биохимический анализ сыворотки проводился с помощью восточных дрожжей по следующим параметрам: общий белок (TP), альбумин (Alb), соотношение альбумин/глобулин (A/G), общий билирубин (Bil), глюкоза, общий холестерин (T-Chol), триглицерид (TG), азот мочевины (BUN), креатинин (Cre), кальций (Ca), неорганический фосфор (IP), натрий (Na), калий (K), хлор (Cl), аспартатаминотрансфераза (AST), аланинаминотрансфераза (АЛТ), щелочная фосфатаза (АЛП) и -глутамилтранспептидаза (-ГТФ).

Вес органов и гистопатологическая оценка

У всех животных проводили полное вскрытие и взвешивали головной мозг, тимус, легкие, сердце, селезенку, печень, надпочечники, почки, семенники и яичники. Эти органы, а также ткани спинного мозга, тройничного нерва, гипофиза, полости носа, слюнных желез, языка, пищевода, трахеи, аорты, щитовидной железы, паращитовидной железы, поджелудочной железы, желудка, тонкой и толстой кишки, подчелюстной и брыжеечной кишки. лимфатические узлы, влагалище, матка, мочевой пузырь, предстательная железа, семенные пузырьки, придаток яичка, бедренная кость и грудина с костным мозгом, позвонки, скелетные мышцы, седалищный нерв, кожа и молочная железа фиксировались в 10% нейтрально-забуференном формалине; затем готовили залитые парафином срезы и окрашивали гематоксилином и эозином для гистопатологического исследования. Семенники и глаза с гардеровыми железами фиксировали в фиксаторе Буэна и растворе Дэвидсона соответственно. Костные ткани, включая полость носа, позвонки, грудину и бедренную кость, декальцинировали с помощью смеси 10% муравьиной кислоты и 10% забуференного формалина в течение 2 недель. Гистопатологическую оценку проводили для всех тканей, полученных от животных в контрольной группе и группе, которой вводили самую высокую дозу, за исключением случаев, когда наблюдались какие-либо поражения, связанные с лечением.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНИТЕТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Иммуногистохимия на 2u-глобулин

У самцов крыс накопление 2u-глобулина в почках исследовали с помощью иммуногистохимического анализа парафиновых срезов. Для извлечения антигена срезы, полученные от 5 крыс в каждой группе, инкубировали с протеиназой К (DAKO, Глоструп, Дания) в течение 1 мин при комнатной температуре. Все срезы погружали в 3% раствор H2O2/метанол на 10 мин при комнатной температуре для инактивации активности эндогенной пероксидазы. После блокирования неспецифических реакций с помощью 10% нормальной кроличьей сыворотки срезы инкубировали с первичным антителом к ​​2-углобулину (разведенным 1:400; антитело против крысиного 2u-глобулина; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) в течение ночи при температуре 4°С. Визуализацию связывания антител осуществляли с использованием набора VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Берлингейм, Калифорния, США) и 3,3'-диаминобензидина. Все срезы докрашивали гематоксилином.

статистический анализ

Отклонения в значениях данных по массе тела в течение экспериментального периода, а также по гематологии, биохимии сыворотки и массе органов оценивали на однородность с использованием критерия Бартлетта. Однофакторный дисперсионный анализ и критерий Краскела-Уоллиса соответственно применялись для однородных и гетерогенных данных. При определении статистически значимых различий использовался тест множественного сравнения Даннетта для сравнения контрольной и экспериментальной групп. Сравнение гистопатологической заболеваемости и степени тяжести анализировали с использованием критерия точной вероятности Фишера и U-критерия Манна-Уитни соответственно. P-значения<0.05 were considered statistically significant.

Полученные результаты

Прижизненные параметры, гематология и биохимия сыворотки

Никаких значимых клинических признаков на протяжении всего экспериментального периода отмечено не было, и все животные дожили до запланированного вскрытия. Кроме того, у самцов и самок крыс не наблюдалось существенных различий в массе тела и ежедневном потреблении пищи (рис. 1А и Б).

Данные гематологии и биохимии сыворотки представлены в таблицах 1 и 2 соответственно. Гематологические анализы выявили значительное снижение HGB, HCT, MCV и MCH и увеличение PLT у самцов крыс, которым вводили 250 мг/кг массы тела/день 2-(1-ментокси)этанола (таблица 1). В биохимических показателях сыворотки у самцов группы, получавшей 250 мг/кг, отмечалось значительное увеличение TP, T-Chol и Ca и снижение Bil и ALP (табл. 2). Значительное увеличение Cre и снижение A/G отмечено у самцов групп 60 и 250 мг/кг. У самок значительное увеличение Са и снижение ЩФ были зафиксированы в группах 60 и 250 мг/кг, тогда как повышенный Т-Хол и снижение А/Г, Бил, ТГ, АСТ и АЛТ были выявлены в группах 250 мг. /кг группа. Хотя значительное увеличение ТГ и снижение Cl наблюдалось у самцов, которым вводили 60 мг/кг, отсутствие какой-либо дозовой зависимости позволило предположить, что эти различия не были связаны с воздействием тестируемого вещества.

Вес органов

Данные по массе органов суммированы в Таблице 3. Абсолютная и относительная масса печени была значительно увеличена у обоих полов в группе, получавшей 250 мг/кг (Таблица 3). Значительное увеличение относительной массы печени наблюдалось у мужчин в группе, получавшей 60 мг/кг. У мужчин абсолютная и относительная масса почек была значительно увеличена в группах, принимавших 60 и 250 мг/кг. В группе мужчин, получавших дозу 250 мг/кг, было отмечено значительное увеличение абсолютной и относительной массы надпочечников, а также относительной массы селезенки и яичек.

Гистопатология и иммуногистохимия

Данные гистопатологических и иммуногистохимических исследований суммированы в таблицах 4 и 5 соответственно. Гистопатологические результаты показали, что частота накопления эозинофильных гранул (рис. 2A-D), базофильных канальцев и гиалиновых цилиндров, а также очагового интерстициального воспаления в почках была значительно увеличена в группах лечения, состоящих только из мужчин, по сравнению с контрольной группой. группа (табл. 4). По данным иммуногистохимического анализа, у крыс-самцов, получавших исследуемое вещество, отмечалось повышение иммунореактивности 2u-глобулина в эпителиальных клетках проксимальных канальцев, демонстрирующее четкую дозозависимость (рис. 2Д-З) (табл. 5).

При вскрытии у одного самца крысы из группы, получавшей дозу 250 мг/кг, было выявлено сильное увеличение правой почки вследствие гистологически характерной нефробластомы. Хотя нефробластома у большинства линий крыс встречается редко9, этот случай считался случайным, поскольку ни у одного другого животного не наблюдалось подобных поражений. Кроме того, в исследованиях канцерогенности при пероральном приеме частота возникновения спонтанной нефробластомы у самцов крыс F344/DuCrlCrlj колебалась в пределах 0–2,0%10. Хотя несколько поражений спорадически выявлялись и в других органах, никаких существенных изменений частоты этих поражений, зависящих от лечения, обнаружено не было.

Обсуждение

На сегодняшний день 24 ароматизатора, включая 2-(1-ментокси)этанол, были оценены JECFA как вещества, структурно родственные ментолу, и все они внесены в список «не представляющих угрозы для безопасности» при текущих расчетных уровнях. потребления1, 11. 2-(1-Ментокси)этанол классифицируется в подгруппе алициклических спиртов или простых эфиров и считается, что он в первую очередь конъюгируется с глюкуроновой кислотой с последующей экскрецией с мочой1. Хотя значения ЛД50 этих веществ при пероральном приеме у грызунов относительно высоки, данные исследований токсичности при повторных дозах остаются ограниченными. 13-Недельное исследование токсичности при повторных дозах показало, что ментилпирролидонкарбоксилат (номер CAS 68127-22-0), соединение, структурно родственное ментолу, может быть связано с увеличением относительной массы печени и почек у мужчин и женщин. Крысы Вистар. Накопление 2u-глобулина в проксимальных канальцах крыс-самцов наблюдалось также при дозе 1111 мг/кг массы тела/день, а NOAEL был определен как 109 мг/кг массы тела/день1.

В настоящем 13-недельном исследовании субхронической токсичности 2-(1-ментокси)этанола не наблюдалось токсикологических изменений в общем состоянии, массе тела и потреблении пищи. После гематологического обследования мы наблюдали снижение HGB (96,6% к контрольным средним значениям), HCT (96,3%), MCV (98,4%) и MCH (98,2%), а также увеличение PLT (111%) у мужчин. 250 мг/кг, что было расценено как токсикологическое воздействие обработки 2-(1-ментокси)этанолом. Как абсолютная (115% у обоих полов), так и относительная (119% у мужчин и 111% у женщин) масса печени была значительно увеличена у обоих полов в группах, получавших дозу 250 мг/кг. Хотя гистопатологических изменений в печени не было, повышенные уровни сывороточного Т-Хол (110% у мужчин и 121% у женщин) и ТП (105% у мужчин) и снижение ТГ (60,1% у женщин) у 250 группы мг/кг указывают на токсические изменения, связанные с липидным обменом и синтезом белка в печени. Также были обнаружены снижение HGB и MCH и повышение PLT, T-Chol и TP у мужчин, а также снижение TG и увеличение абсолютной и относительной массы печени у обоих полов со статистической значимостью в предварительном 28-дневном исследовании (данные не показаны). ), подтверждая, что эти измененные гематологические и биохимические параметры сыворотки, а также вес печени были не случайными, а эффектами, связанными с тестируемым веществом. Напротив, значительное увеличение относительного веса печени, обнаруженное в группе мужчин, получавших дозу 60 мг/кг в настоящем исследовании, не сопровождалось увеличением абсолютного веса или изменениями связанных с ним биохимических параметров, что позволяет предположить, что это увеличение было адаптивным изменением.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Считалось, что значительное увеличение абсолютной (120%) и относительной (118%) массы надпочечников в группе мужчин, получавших дозу 250 мг/кг, было связано с тестируемым химическим веществом. Кроме того, увеличение абсолютной и относительной массы надпочечников у обоих полов показало четкую зависимость от дозы в предварительном 28-дневном исследовании (данные не показаны), что указывает на связь с исследуемой химической обработкой. Хотя гипертрофия надпочечников может быть результатом стресса, ни в настоящем, ни в предварительных исследованиях не было обнаружено никаких данных, указывающих на стресс, таких как снижение прибавки массы тела или атрофия тимуса и других лимфоидных органов. Поскольку в случае ингибирования ферментов, связанных со стероидогенезом, гистопатологические изменения в надпочечниках могут отсутствовать даже при нарушении продукции глюкокортикоидов12, нельзя исключить возможность того, что увеличение массы надпочечников является токсическим признаком. Напротив, увеличение относительной массы селезенки и яичек в группе мужчин, получавших дозу 250 мг/кг, не наблюдавшееся в предварительном исследовании, считалось токсикологически незначительным из-за отсутствия гистопатологических поражений или значительного увеличения абсолютной массы. Аналогично, биохимия сыворотки выявила снижение A/G и увеличение Ca у обоих полов, что считалось не имеющим токсикологического значения, поскольку не было обнаружено никаких отклонений в соответствующих параметрах. Более того, снижение уровней Bil и ALP у обоих полов, а также снижение AST и ALT у женщин противоречили ожидаемым токсическим эффектам и считались незначимыми.

Хроническая нефропатия, характеризующаяся базофильными канальцами, гиалиновым цилиндром и очаговым интерстициальным воспалением, наблюдалась со статистической значимостью у мужчин во всех группах лечения. Кроме того, в группах самцов, получавших дозы 60 и 250 мг/кг, было обнаружено увеличение Cre в сыворотке, а также абсолютной и относительной массы почек; эти изменения не наблюдались в группах лечения женщин. В этих случаях степень накопления эозинофильных гранул в эпителиальных клетках проксимальных канальцев увеличивалась явно дозозависимым образом. Эти гранулы были подтверждены как 2u-глобулин с помощью иммуногистохимии, что указывает на возникновение 2u-глобулиновой нефропатии. 2u-глобулины, связанные с определенными химическими веществами, такими как d-лимонен, накапливаются в лизосомах и наблюдаются в проксимальных канальцах в виде эозинофильных или гиалиновых гранул9. Такое накопление может повредить эпителиальные клетки, что приведет к хронической прогрессирующей нефропатии и последующему образованию опухоли9. Таким образом, хотя NOAEL для 2-(1-ментокси)этанола, связанного с 2u-глобулиновой нефропатией в почках самцов крыс, не был идентифицирован, сообщается, что этот тип нефропатии специфичен для самцов крыс и, следовательно, не имеет отношения к человеку. оценка риска13. Повышенный риск почечной недостаточности, опосредованный механизмами, связанными с накоплением 2u-глобулина, маловероятен, поскольку этот белок отсутствует у людей14. Поэтому было признано целесообразным исключить из определения NOAEL изменения, связанные с хронической нефропатией, наблюдаемые у мужчин.

В заключение, настоящее 13-недельное исследование субхронической токсичности продемонстрировало, что лечение 250 мг/кг массы тела/день 2-(1-ментокси) этанолом вызывало токсические изменения в гематологии, биохимии сыворотки и массе органов. у самцов и самок крыс F344. На основании наблюдаемых результатов NOAEL 2-(1-ментокси)этанолаоценивалась как 60 мг/кг массы тела/день для обоих полов.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%