Абстрактный:Кверцетин широко изучался на предмет его действия против болезни Альцгеймера (БА) и омолаживающего действия. Наши предыдущие исследования показали, что кверцетин и его гликозидная форма, рутин, могут модулировать функцию протеасомы в клетках нейробластомы. Мы стремились изучить влияние кверцетина и рутина на внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз головного мозга (восстановленный глутатион / окисленный глутатион, GSH / GSSG), его корреляцию с активностью фермента 1, расщепляющего АРР-сайт (BACE1), и белка-предшественника амилоида (АРР). экспрессия у трансгенных мышей TgAPP (несущих человеческую шведскую мутацию APP transgene, APPswe). Основываясь на том, что белок BACE1 и процессинг АРР регулируются убиквитин-протеасомным путем и что добавление GSH защищает нейроны от ингибирования протеасом, мы исследовали, снижает ли диета, содержащая кверцетин или рутин (30 мг/кг/день, 4 недели), несколько ранние признаки БА. Генотипирование животных проводили методом ПЦР. Для определения внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза были приняты спектрофлуориметрические методы для количественного определения уровней GSH и GSSG с использованием о-фталевого альдегида, а также было установлено соотношение GSH/GSSG. Уровни TBARS определяли как маркер перекисного окисления липидов. Ферментативную активность СОД, КАТ, ГР и ГПО определяли в коре и гиппокампе. Активность BACE1 измеряли с помощью специфичного для секретазы субстрата, конъюгированного с двумя репортерными молекулами (EDANS и DABCYL). С помощью ОТ-ПЦР определяли экспрессию генов основных антиоксидантных ферментов: APP, BACE1, белка 10, содержащего домен дезинтегрина и металлопротеиназы (ADAM10), каспазы -3, каспазы -6 и воспалительных цитокинов. Во-первых, сверхэкспрессия APPswe у мышей TgAPP снижала соотношение GSH/GSSG, повышала уровни малонового альдегида (MDA) и в целом снижала активность основных антиоксидантных ферментов по сравнению с мышами дикого типа (WT). Лечение мышей TgAPP кверцетином или рутином увеличивало GSH/GSSG, снижало уровни MDA и способствовало антиоксидантной способности ферментов, особенно рутина. Во-вторых, как экспрессия APP, так и активность BACE1 снижались с помощью кверцетина или рутина у мышей TgAPP. Что касается ADAM10, то он имеет тенденцию к увеличению у мышей TgAPP при лечении рутином. Что касается экспрессии каспазы-3, TgAPP показал увеличение, которое было противоположным с рутином. Наконец, увеличение экспрессии маркеров воспаления IL-1 и IFN- у мышей TgAPP снижалось как кверцетином, так и рутином. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что из двух флавоноидов рутин может быть включен в ежедневный рацион в качестве формы адъювантной терапии при БА.

Нажмите на склад антиоксидантов Cistanche Chemistry

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ключевые слова:кверцетин; рутин; глутатион; APPswe; БАСЕ1; Болезнь Альцгеймера

1. Введение

Снижение когнитивной функции является фундаментальным клиническим симптомом нейродегенерации, строго связанным с возрастом [1]. Влияние питания на возрастное снижение когнитивных функций становится все более актуальной темой, поскольку это жизненно важный фактор, который можно легко изменить. Патологические изменения в головном мозге, наблюдаемые при снижении когнитивных функций, имеют место задолго до каких-либо клинических проявлений, которые чаще всего возникают в пожилом возрасте. Это обеспечивает более длительный период для разработки стратегий профилактики возрастного снижения когнитивных функций и деменции, что является серьезной проблемой общественного здравоохранения [2]. В течение многих лет проводились интенсивные исследования соединений природного происхождения, встречающихся в повседневном рационе, в области когнитивно-стимулирующей терапии [3].

Одним из наиболее распространенных возрастных нейродегенеративных заболеваний является болезнь Альцгеймера (БА), которая характеризуется двумя нейропатологическими признаками: амилоидными (А) бляшками и нейрофибриллярными клубками. Что касается исследований на животных, модели животных могут имитировать бессимптомную фазу БА, например, модифицируя белок-предшественник А (АРР) [4,5].

Примечательно, что несколько биоактивных фитохимических веществ, полученных из растений, связанных с различными преимуществами для здоровья и снижением риска многих заболеваний, были проверены на образование нековалентных комплексов с амилоидным (А) пептидом [3].

Хотя многочисленные традиционные лекарства и натуральные диетические продукты продемонстрировали значительный прогресс в смягчении патологии БА, мы полностью осознаем ограничения моделей БА на животных, поскольку многообещающие эффекты этих веществ не всегда воспроизводимы в исследованиях на людях [6]. Однако из-за сложности анализа мозговой ткани человека, особенно на очень ранних стадиях прогрессирования, необходимы исследования на моделях грызунов. В результате эти экспериментальные модели могут способствовать разработке пользовательских агентов из традиционных лекарств и безопасных природных соединений для замедления прогрессирования нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, приоритетной задачей должно стать тестирование природных соединений, присутствующих в повседневном рационе, для профилактики заболеваний и защиты от риска развития атопического дерматита.

Среди этих важных диетических натуральных веществ есть кверцетин, который является основным полифенольным флавоноидом в некоторых фруктах и ​​овощах [7]. Кверцетин в основном присутствует в форме гликозида, т.е. рутина. Со своей стороны, рутин (кверцетин-3-O-рутинозид) продемонстрировал сильное влияние на различные клеточные функции, лежащие в основе нескольких патологических состояний, а именно антимикробное, антиканцерогенное, антитромботическое, кардиопротекторное и нейропротекторное действие. Эти фармакологические эффекты в основном связаны с противовоспалительной и антиоксидантной активностью рутина. Было продемонстрировано, что благодаря его способности преодолевать гематоэнцефалический барьер и/или его метаболиты рутин может изменять как когнитивные, так и поведенческие симптомы нейродегенеративных заболеваний [8].

Наши предыдущие исследования показали, что как флавоноиды, так и кверцетин, и рутин влияют на различные сигнальные пути и молекулярные сети, связанные с модуляцией функций протеасом в клетках нейробластомы [9]. Кроме того, было продемонстрировано, что экспрессия BACE1 и процессинг APP регулируются убиквитин-протеасомным путем [10] и что добавление восстановленного глутатиона (GSH) защищает нейроны от ингибирования протеасом [11]. Истощение GSH в головном мозге является распространенным явлением у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями, такими как БА, и может вызвать нейродегенерацию до начала заболевания [12]. Убиквитинирование ВАСЕ1 и блокирование убиквитин-протеасомного пути ингибирует деградацию ВАСЕ1 и, следовательно, приводит к увеличению продукции ферментативной активности ВАСЕ1 [10].

Основываясь на этих выводах, а также на том, что пищевые привычки и добавки могут влиять на окислительно-восстановительный статус клеток, мы стремились изучить влияние диеты, содержащей кверцетин или рутин, на внутриклеточный окислительно-восстановительный гомеостаз головного мозга (GSH/GSSG), его корреляцию с активностью BACE1, и экспрессия АРР в моделях AD на мышах (несущих человеческую шведскую мутацию белка-предшественника амилоида в трансгене АРР, APPswe).

Наконец, поскольку имеются убедительные доказательства влияния добавок флавоноидов на улучшение определенных когнитивных областей и/или результаты МРТ [13], мы попытались имитировать на животных вмешательство, предоставив здоровую диету, содержащую умеренное количество определенного потенциально активного вещества. ингредиент (кверцетин или рутин) в качестве эффективной стратегии предотвращения экспрессии маркеров AD.

2. Результаты

2.1. Генотипирование мышей

Колония мышей TgAPP была получена в нашей лаборатории из гетерозиготных самцов Tg2576 и самок дикого типа. Генотипирование мышей проводили для выявления трансгенных особей. Было обнаружено, что из всех протестированных мышей примерно 40 процентов являются трансгенными (TgAPP).

Полученные продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1,5-процентных агарозных гелях в буфере 0.5X TBE (трис-борат-ЭДТА) при 70 В (постоянное напряжение) и затем визуализировали путем окрашивания с помощью GelRed (Millipore). Профиль амплификации как для трансгенных мышей, так и для мышей дикого типа показан на рисунке 1.

2.2. Глутатион

Для оценки внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза в нейронах у мышей TgAPP количественно определяли уровни GSH и GSSG, а отношение GSH/GSSG определяли как маркер клеточно-восстанавливающей способности как у самцов, так и у самок (рис. 2).

При оценке влияния трансгена на систему глутатиона у мышей TgAPP наблюдалось снижение способности восстанавливать клетки (GSH/GSSG) по отношению к животным дикого типа как у самцов, так и у самок, а также в обеих областях мозга (рис. 2C3, H3), особенно в гиппокампе. Как у мышей WT, так и у мышей TgAPP соотношение GSH/GSSG было значительно ниже у самцов, чем у самок (рис. 2C3, H3; p < 0,05). В то время как у самок TgAPP это снижение является результатом более низких уровней GSH (рис. 2C1, H1), у самцов TgAPP оно в основном связано с увеличением уровней GSSG (рис. 2C2, H2).

Изменения уровней GSH и GSSG у мышей TgAPP, соответственно, при лечении кверцетином или рутином, более заметны у самцов, чем у самок. Похоже, что кверцетин имеет тенденцию повышать уровни GSH (рис. 2C1, H1; p <0.05), а рутин — снижать уровни GSSG (рис. 2C2, H2; p <0,05).

Обработка кверцетином и рутином как у самцов, так и у самок смогла обратить вспять падение отношения GSH/GSSG в гиппокампе (рис. 2H3), где восстановление окислительно-восстановительной способности было значительным по сравнению с необработанными мышами TgAPP. У самцов этот индекс достиг значений, сходных с таковыми у мышей WT в гиппокампе (H3). У самок, хотя это соотношение не повышено до такового у мышей WT, лечение кверцетином и рутином значительно повышало его по сравнению с таковым у мышей TgAPP в их гиппокампе (H3: кверцетин, p < 0.{{ 6}}01, рутин, p < 0,05).

2.3. Вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (TBAR)

Уровни TBAR определяли как маркер перекисного окисления липидов. Используя калибровочные кривые, результаты выражали в виде концентрации малонового диальдегида (МДА) (рис. 3).

После сверхэкспрессии АРР значительное увеличение уровней MDA по сравнению с мышами дикого типа наблюдалось как в коре головного мозга (рис. 3C), так и в гиппокампе (рис. 3H), а также у самцов и самок (p < 0,001). .

У самок TgAPP лечение как кверцетином, так и рутином почти восстановило уровни MDA до уровня мышей WT (рис. 3C, H). Точно так же у самцов TgAPP лечение как кверцетином, так и рутином восстанавливает уровни MDA до тех же, что и у мышей WT в коре головного мозга (рис. 3C), и еще больше снижается в гиппокампе (рис. 3H). Как у мышей дикого типа, так и у мышей TgAPP, не получавших лечения и получавших флавоноидную диету, уровни MDA зависели от пола (рис. 3C, H; p < 0,05), за исключением мышей TgAPP, получавших кверцетин, в гиппокампе.

2.4. Ферментативная активность и экспрессия антиоксидантных ферментов

Чтобы выяснить, происходит ли регуляция ферментативной активности или экспрессии генов основных антиоксидантных ферментов, или того и другого при диете с кверцетином или рутином, было проведено определение ферментативной активности и уровней мРНК.

На рис. 4 показана ферментативная активность SOD, CAT, GR и GPx, определенная у самок и самцов мышей, в коре головного мозга (рис. 4а) и гиппокампе (рис. 4б).

Вследствие сверхэкспрессии АРР у мышей TgAPP по сравнению с мышами дикого типа наблюдалось только значительное снижение активности CAT как в коре головного мозга (рис. 4a(C2); p < 0.05), так и в гиппокамп (рис. 4b(H2); p <0,05).

Лечение кверцетином не приводило к каким-либо значительным изменениям в активности ферментов по сравнению с мышами TgAPP, у самцов или самок, в исследуемых областях мозга. Напротив, у животных, получавших рутин, наблюдалось увеличение активности CAT в коре (рис. 4a(C2)) и активности GR в гиппокампе (рис. 4b(H3)) как у самцов, так и у самок (p < 0). .05). Кроме того, рутин увеличивал активность CAT гиппокампа у самцов TgAPP (рис. 4b (H2)) и активность GPx у самок (рис. 4b (H4)).

На рис. 5 показана экспрессия генов основных антиоксидантных ферментов, SOD, CAT, GR и GPx, определенная у самок и самцов мышей, в коре головного мозга (рис. 5а) и гиппокампе (рис. 5б).

Никаких различий в экспрессии генов между мышами TgAPP и WT не наблюдается для основных антиоксидантных ферментов (рис. 5а, б). У самцов TgAPP, получавших рутин, наблюдалось значительное увеличение экспрессии CAT в гиппокампе (рис. 5b (H2)). Что касается GPx гиппокампа, наблюдалась картина, аналогичная CAT, хотя увеличение не было значительным (рис. 5b (H4)).

2.5. Обработка приложений: BACE1 и ADAM10

Результаты активности фермента BACE1 как в коре головного мозга, так и в гиппокампе у самцов и самок показаны на фигуре 6, выраженные в процентах активности по отношению к необработанным мышам TgAPP.

На рисунке 6 было обнаружено, что активность фермента BACE1 у мышей TgAPP увеличилась примерно на 1% по сравнению с мышами дикого типа как в исследуемых областях мозга, так и у представителей обоих полов, и было обнаружено, что она является статистически значимой (p < 0,05).

Повышение активности, наблюдаемое у трансгенных мышей, снижалось при лечении как кверцетином, так и рутином как в коре головного мозга, так и в гиппокампе. Тем не менее, все же можно было отметить, что эффект рутина был несколько выше, чем у кверцетина у самцов.

Как только активность BACE1 стала известна, мы решили провести исследование экспрессии генов APP, основной характеристики модели трансгенных животных, и ее основных ферментов процессинга: BACE1 и ADAM10. На рис. 7 показаны результаты, полученные у самок и самцов мышей, как в коре головного мозга, так и в гиппокампе.

У обоих полов наблюдалось значительное увеличение экспрессии АРР более чем на 85 процентов у мышей дикого типа, что свидетельствует о сверхэкспрессии гена как в коре головного мозга (рис. 7C1; p <0.05). и в гиппокампе (рис. 7H1; p < 0.05). Обработка кверцетином и рутином смогла снизить эту экспрессию более чем на 45 процентов (p < 0,05) как у самцов, так и у самок мышей в обеих исследуемых областях мозга (рис. 7C1, H1), при этом эффекты были более заметными в гиппокампе (рис. 7C1, H1). Рисунок 7H1).

Что касается экспрессии белка BACE1, хотя активность BACE1 была изменена, не было выявлено существенных различий между трансгенными и нетрансгенными мышами, независимо от пола и исследуемого лечения флавоноидами.

Таким образом, мы оценили экспрессию ADAM10, участвующую в неамилоидогенном процессинге APP. Хотя изменения в экспрессии ADAM10 у мышей TgAPP по сравнению с мышами WT не были статистически значимыми, наблюдалось небольшое снижение. Что касается лечения флавоноидами, рутин продемонстрировал тенденцию к увеличению экспрессии ADAM10 как у мужчин, так и у женщин, а также в обеих областях мозга (рис. 7C3, H3).

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】