Характерное распределение фактора, индуцируемого гипоксией-1, в культивируемых клетках почечных канальцев с гипоперфузией, смоделированной путем помещения покровного стекла

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Томоко Хонда¹| Ёсуке Хиракава¹ | Киити Мизуками²| Тошитада Йошихара²| Тецухиро Танака¹| Сэйдзи Тобита²| Масаоми Нангаку

Абстрактный

Хроническая гипоксия в почечном тубулоинтерстиции играет ключевую роль в прогрессировании хроническогопочкаболезнь(ЧКД). Поэтому важно исследовать канальцевую гипоксию и активность фактора, индуцируемого гипоксией (HIF) -1 в ответ на гипоксию. Разрежение перитубулярного капилляра вызывает гипоперфузию при ХБП; однако влияние гипоперфузии на HIF редко исследовалось. Мы индуцировали гипоперфузию, вызванную размещением покровного стекла у человека.почка-2 клеток и наблюдали кислородный градиент под покровным стеклом. Иммуноцитохимия HIF-1 показала образование в форме пончика на краю пимонидазол-позитивной области, которое мы назвали «HIF-кольцом». Напряжение кислорода в HIF-кольце оценивалось примерно между 4 мм рт.ст. и 20 мм рт.ст. Этот результат несовместим с результатами предыдущих исследований, показывающих накопление HIF-1 в бескислородном диапазоне с однородным напряжением кислорода. Кроме того, мы наблюдали наличие градиента pH под покровным стеклом, а также сдвиг кольца HIF из-за изменений pH культуральной среды, что позволяет предположить, что кольцо HIF образовалось путем подавления связанных с HIF -1 к низкому рН. Это исследование показало, что активация HIF-1 имитирует физиологическое состояние культивируемых клеток с гипоперфузией.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВАгипоперфузия, гипоксия, фактор, индуцирующий гипоксию, кислородный градиент, рН

Цистанхе травапредотвращает заболевание почек, нажмите здесь, чтобы получить образец

1|ВВЕДЕНИЕ

Заболеваемость хрон.почкаболезнь(ХБП) увеличивается во всем мире по мере старения общества (Tonelli & Riella, 2014). Прогрессирование ХБП становится необратимым, когда повреждение почек достигает определенной степени и в конечном итоге приводит к терминальной стадии почечной недостаточности (ТХПН), независимо от основного заболевания. Этот результат указывает на существование «последнего общего пути». Согласно прошлым патологическим анализам, снижение почечной функции более сильно коррелирует с тубулоинтерстициальным повреждением, чем с гломерулярным повреждением. Было несколько сообщений, демонстрирующих, что почечный фиброз вызывает хроническую гипоксию в тубулоинтерстиции, и эта тубулоинтерстициальная гипоксия усугубляет ХБП и приводит к терминальной стадии почечной недостаточности. Эти данные указывают на то, что тубулоинтерстициальная гипоксия играет роль в конечном общем пути ХБП (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006).почкаочень восприимчив к гипоксии из-за высокой потребности в кислороде и наличия кислородного шунта между внутрипочечными артериями и венами (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Поэтому мы считаем необходимым исследовать гипоксию и реакцию на гипоксию в почечном тубулоинтерстиции.

Первичный биологический ответ на гипоксию в живых организмах происходит через путь индуцируемого гипоксией фактора (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF состоит из - и -субъединиц. Хотя -субъединица конститутивно активна, -субъединица разлагается в присутствии кислорода. В нормоксических условиях HIF- гидроксилируется доменом пролилгидроксилазы (Ph.D.), что делает его распознаваемым опухолевым супрессором фон Хиппеля-Линдау (VHL). Это распознавание приводит к убиквитинированию и деградации гидроксилированного HIF- в протеасоме. В условиях гипоксии HIF- накапливается в цитозоле, так как негидроксилированный HIF- избегает деградации. Накопленный HIF- перемещается из цитозоля в ядро, где димеризуется с HIF- и действует как фактор транскрипции, стимулируя экспрессию нижестоящих генов. Известно, что из трех идентифицированных изоформ HIF-субъединиц — HIF-1, HIF-2 и HIF-3 — эпителиальные клетки почечных канальцев экспрессируют HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Предыдущие исследования показали временное или региональное накопление HIF впочкапри ХБП (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), и этот HIF активируется при пониженном напряжении кислорода в среде ХБП. Дезадаптация к гипоксии при ХБП может быть обусловлена ​​наличием факторов, подавляющих HIF-пути (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Защитные эффекты активации HIF были зарегистрированы на нескольких животных моделях, включая крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином, и крыс с нефрэктомией 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Кандидат наук. Ингибиторы недавно привлекли внимание в качестве новых терапевтических подходов к почечной анемии у пациентов с ХБП (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Однако подробности прогрессирования почечной гипоксии и того, как происходит накопление HIF впочкас ХБП остаются неясными. Кислородзависимое гидроксилирование HIF- происходит в цитозоле, поэтому важно измерять внутриклеточное и внеклеточное напряжение кислорода. Существует несколько методов измерения напряжения кислорода, включая использование микроэлектродов или магнитно-резонансную томографию, зависящую от уровня кислорода в крови (BOLD-MRI). Мы использовали микроскопию для визуализации фосфоресценции (PLIM) для количественного измерения внутриклеточного кислородного статуса (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 — фосфоресцирующий краситель на основе комплекса иридия (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=бензоат-пиридин, aac=ацетилацетон) с катионной диметиламиногруппой, которая пассивно распределены во внутриклеточных лизосомах. Он был синтезирован как фосфорный зонд для измерения внутриклеточного давления кислорода (Yoshihara et al., 2015). PLIM с BTPDM1 позволил получить изображения парциального давления кислорода в клетках почечных канальцев на поверхности почек нормальных мышей с высоким разрешением, предоставив данные, указывающие на наличие кислородного градиента даже в нормальных почках (Hirakawa et al., 2018). ).

В живых органах существуют кислородные градиенты, в т.ч.почки, даже в нормальных условиях (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), поэтому такие градиенты можно ожидать и при ХБП. Гипоперфузия обусловлена ​​разрежением микроциркуляторного русла при ХБП, при которой прогрессирующее поражение клубочков приводит к снижению перитубулярного капиллярного кровотока, усугубляющему интерстициальный фиброз. Интерстициальный фиброз нарушает диффузию и снабжение кислородом клеток канальцев и приводит к разрежению микроциркуляторного русла, что еще больше усугубляет тубулоинтерстициальную гипоксию (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Однако биологические эффекты гипоперфузии остаются неясными, поскольку в большинстве исследований изучалось влияние гипоксии и HIF-1 на культивируемые клетки в условиях гомогенной перфузии и напряжения кислорода (Rexius-Hall et al., 2017). Предыдущие исследования показали, что однослойные культивируемые клетки, покрытые покровным стеклом, представляют собой хорошую модель гипоперфузии, вызванной барьером для диффузии в культуральной среде. Смоделированная гипоперфузия связана с кислородным градиентом, поскольку покровное стекло предотвращает диффузию кислорода из верхней части среды к клеткам (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). В монослое культивируемых клеток, покрытых покровным стеклом, внутриклеточное напряжение кислорода падает по мере удаления от края покровного стекла из-за ограниченной диффузии кислорода в культивируемые клетки. В результате формируется кислородный градиент от края к центру покровного стекла, а внутриклеточное напряжение кислорода может падать до бескислородного диапазона в центре покровного стекла (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). . В текущем исследовании мы сосредоточились на активации HIF и исследовали, существует ли независимое от кислорода изменение экспрессии HIF в присутствии гипоперфузии с кислородным градиентом. Поскольку in vivo в почечных канальцах существует гипоперфузия с кислородным градиентом, наблюдение независимых от кислорода эффектов на экспрессию HIF в модели покровного стекла может пролить свет на механизм, лежащий в основе недостаточности накопления HIF при ХБП.

экстракт цистанхедля почек

2|МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Культура клеток

Культивируемые клетки инкубировали во влажном инкубаторе с 5% СО2. Гипоксическую инкубацию проводили в персональном CO2/мультигазовом инкубаторе APM-30D (Astec). Аноксию индуцировали с помощью мешка для аноксии, AnaeroPack и наборов для анаэробного культивирования #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Клетки HK-2 (Homo sapiens, человеческиепочка, самец, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), иммортализованную линию эпителиальных клеток проксимальных канальцев из нормальной почки взрослого человека, культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла/питательной смеси F{{2} } Ветчина (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich), содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) и раствор пенициллина-стрептомицина (15070063, Thermo Fisher Scientific) в культуральной чашке диаметром 10 см. Для пассажа клетки HK-2 диссоциировали трипсином (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и центрифугировали при 300 g в течение 5 мин.

Клетки рака шейки матки HeLa и эмбриональные клетки человекапочкаклетки 293 (HEK293) культивировали в среде DMEM с низким содержанием (1000 мг/л) глюкозы (D6046, Sigma Aldrich), содержащей 5% FBS, в культуральной чашке диаметром 10 см. Эти клетки пассировали как клетки HK-2.

Эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) поддерживали с помощью наборов RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Для пассажа RPTEC диссоциировали с помощью трипсина, нейтрализовали раствором для нейтрализации трипсина (CC-5002, Lonza Ltd.) и центрифугировали при 200 g в течение 5 мин.

2.2|Создание модели гипоперфузии путем помещения покровного стекла

Покровные стекла круглой формы диаметром 15 мм (C015001, Matsunami) очищали с помощью ультразвука и перед использованием хранили в 99,5-процентном этаноле. Были использованы два метода, основанные на наблюдении за клетками вне покровного стекла.

Монослойные культивируемые клетки помещали между покровным стеклом и дном чашки (рис. S1a,b) или альтернативным методом (рис. S1c), как описано ниже. Либо традиционный, либо альтернативный метод был выбран для создания нашей модели покровного стекла для визуализации в реальном времени, будь то визуализация кислорода или визуализация PH. Для иммуноцитохимии (ICC) был выбран альтернативный метод, поскольку при использовании традиционного метода большинство клеток часто отделялись от дна чашки во время снятия покровного стекла для фиксации клеток (рис. S2a).

2.2.1|Традиционный метод

В день 1 клетки помещали на дно стеклянной чашки диаметром 27 мм (3910-035, Iwaki) при слиянии 100 процентов * (приблизительно 5,0 × 105/чашку). Их культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, без раствора антибиотика в течение ночи. На 2-й день над культивируемыми клетками помещали покровное стекло на указанный период (рис. S1b).

2.2.2|Альтернативный метод

Клетки высевали на покровное стекло в культуральную чашку диаметром 35 мм при 1{4}}0-процентном слиянии (примерно 5,0 × 105/чашку) в день.

1. Их культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, без раствора антибиотика в течение ночи. На 2-й день покровное стекло переворачивали, чтобы прикрепить поверхность его клеток ко дну новой 27-мм стеклянной чашки на определенный период (рис. S1c).

Мы также создали модель покровного стекла с использованием покровных стекол круглой формы диаметром 10 мм (CS01005, Matsunami) (рис. S2b).

2.3|Визуализация кислорода в реальном времени с помощью BTPDM1

Культивируемые клетки готовили в день 1, как описано выше. На 2-й день клетки дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) и инкубировали с 500 нМ BTPDM1, катионным липофильным красителем на основе иридия, используемым в качестве внутриклеточного фосфоресцентного зонда (Yoshihara et al., 2015), в среде DMEM/F12 без фенолового красного (21041-025, Thermo Fisher Scientific) в течение 30 мин. После того как клетки дважды промывали HBSS, их помещали между покровным стеклом и дном чашки, как описано выше. Интенсивность фосфоресценции BTPDM1 в культивируемых клетках, покрытых покровным стеклом, наблюдали с помощью фильтра возбуждения и эмиссии, а фосфоресценцию BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) определяли с помощью флуоресцентного микроскопа BZ-X710 (Keyence Corporation). Изображения, полученные с инвертированного флуоресцентного микроскопа, корректировали по яркости и контрасту с помощью программного обеспечения для анализа BZ-X.

2.4|Иммуноцитохимия

Клетки на покровном стекле культивировали с 200 мкМ пимонидазола HCl (HP{1}}, Hypoxyprobe, Inc.) в среде DMEM/F12 без фенолового красного в течение 1 ч, после чего покровное стекло переворачивали и прикрепляли к чашке покровного стекла, как описано ранее. Затем клетки культивировали в среде DMEM/F12 без фенолового красного в течение заданного времени. Если контрастное окрашивание пимонидазолом не применялось, предварительная обработка пимонидазолом не проводилась.

После завершения периода культивирования каждое покровное стекло собирали и клетки немедленно фиксировали смесью метанол/ацетон (1:1) на льду, где они оставались в течение 30 мин. После двукратной промывки фосфатно-солевым буфером Дульбекко (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) клеточную мембрану подвергали пермеабилизации в течение 30 минут, инкубировали с 5-процентным бычьим сывороточным альбумином (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) в течение 30 минут, а затем с бессывороточным белковым блоком (X0909, DAKO) в течение 10 мин. Клетки окрашивали первым антителом, а затем вторым, флуоресцентным антителом. Список первых антител приведен в Таблице S1. FITC-свиной поликлональный антикроличий иммуноглобулин (F0205, разведение 1:20, DAKO) использовали в качестве первого антитела, если хозяином был кролик. Флуоресцентное антитело к стрептавидину Alexa Fluor 594 (S11227, разведение 1:500, Thermo Fisher Scientific) использовалось в качестве первого антитела, если хозяином была мышь, за которым следовали биотинилированные антимышиные IgG (H плюс L) (BA{{23} }, разведение 1:1000, Vector Laboratories), в качестве второго антитела. Окрашивание ядер выполняли с использованием тригидрохлорида бисбензимида H 33342 (B2261, Sigma Aldrich) для каждого образца.

Флуоресцентные сигналы наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа BZ-X710 (Keyence Corporation) со следующими фильтрами: Texas Red с длиной волны возбуждения (Ex) 560/40 нм, длиной волны испускания (Em) 630/75 нм, GFP ( Пример: 470/40 нм, Em: 525/50 нм) и DAPI (Пример: 360/40 нм, Em: 460/50 нм). Изображения были скорректированы по яркости и контрасту с помощью программного обеспечения для анализа BZ-X.

2,5|ICC HIF клеток HK-2, обработанных хлоридом кобальта

Альтернативный метод был изменен для получения модели покровного стекла клеток HK-2, обработанных хлоридом кобальта. Клетки HK-2 высевали при полуконфлюэнтной плотности (2,5 × 105/чашка) на покровное стекло в 1-й день и обрабатывали 300 мкМ гексагидрата хлорида кобальта (C8661, Sigma Aldrich) в течение 16 ч на 2-й день. На 3-й день покровное стекло переворачивали, чтобы прикрепить поверхности клеток ко дну новой 27-мм стеклянной чашки на 3 ч, и проводили ИКК HIF.

2,6|Вестерн-блоттинг

Для исследования накопления HIF{{0}} при различном напряжении кислорода и при различных уровнях pH, 1,0 × 106 клеток HK-2 на 10-сантиметровую чашку для культивирования. инкубировали в условиях нормоксии, 2% кислорода, 1% кислорода или аноксии в течение 5 часов или в среде DMEM/F12 при pH 7,4, pH 6,0 или pH 5,0 в течение 5 часов.

Эти клетки лизировали в RIPA-буфере, содержащем 50 мМ Трис-буфера (pH 8.0), 150 мМ NaCl, 0,5% масс./об. натрия. дезоксихолат, 0,1 мас./об.% SDS и 1,0 мас./об.% NP40.

Для вестерн-блоттинга буфер образца SDS, содержащий {{0}},35 М Трис-HCl (рН 6,8), 10% SDS, 36% глицерина, 0,012% бромфенолового синего и 0,1 М дитиотреитола. (DTT) добавляли к белкам. Белки, содержащие буфер образца SDS, элюировали кипячением при 95°С в течение 5 мин.

Белки разделяли электрофорезом в полиакриламидных гелях с 10% SDS. Затем белки переносили на мембрану AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) в буфере для переноса (48 мМ трис-базовый буфер, 39 мМ глицин, 0,04% додецилсульфата натрия и 20% по объему метанола) с использованием Trans-Blot®. Система переноса TurboTM (Bio-Rad). Мембраны инкубировали при комнатной температуре с первичными антителами, антителами к HIF1 (NB100-134, разведение 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) и антителами к актину (A2066). , разведение 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), а затем во вторичном антителе, поликлональный козий антикроличий иммуноглобулин/HRP (P0448, разведение 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). Для обнаружения использовали субстрат для вестерн-блоттинга PierceTM ECL Plus (32132, ThermoFisher Scientific). Хемилюминесценцию наблюдали с помощью анализатора Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Воспроизводимость была подтверждена проведением не менее трех независимых экспериментов. Интенсивность полос была количественно определена с использованием программного обеспечения Национального института здравоохранения ImageJ (Schneider et al., 2012).

2,7|Репортерный анализ люциферазы

Репортерный анализ люциферазы проводили для измерения накопления HIF1 при инкубации гомогенной гипоксической культуры. Ранее мы сконструировали меченый ген люциферазы, управляемый элементом, чувствительным к гипоксии (HRE), и разработали репортерный вектор, чувствительный к гипоксии (конструкция трансгена). Он был сконструирован из тандемных копий HRE из гена фактора роста эндотелия сосудов крысы, субклонированного в 5'-область транскрипционной единицы am CMV-промотор-люциферазы (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. др., 2004).

Клетки HK{{0}} в концентрации 1,0 × 105 на лунку готовили в культуральных планшетах с 12-лунками (150628, Thermo Fisher Scientific). Клетки котрансфицировали 500 нг векторов pGL3-Basic HRE-люциферазы и 30 нг контрольных векторов люциферазы pRL-SV40 Renilla (Promega) с использованием 2 мкл реагента для трансфекции FuGENE® HD (E2311, Promega) на Что ж. Клетки HK-2, совместно трансфицированные 500 нг основных векторов люциферазы pGL3- и 30 нг контрольных векторов люциферазы pRL-SV40 Renilla (Promega), использовали в качестве отрицательного контроля.

Трансфицированные клетки инкубировали в условиях нормоксии, 2-процентной гипоксии, 1-процентной гипоксии или аноксиального мешка в течение 5 часов. Затем клетки собирали, используя 100 мкл буфера для пассивного лизиса белка, для двойного анализа люциферазы. Для измерений использовали люминометр LB9507 (EG и Berthold). Чтобы скорректировать эффективность трансфекции, относительное значение световой единицы люциферазы светлячка делили на значение люциферазы Renilla.

Цистанхе для Эда

2,8|Анализ апоптоза

Культивируемые клетки покрывали покровным стеклом на 0 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч и 24 ч, а затем собирали с использованием трипсина. Клетки, обработанные 3-процентным раствором перекиси водорода (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в течение 30 мин, готовили в качестве контроля апоптоза. Количественный анализ апоптоза выполняли с использованием наборов Muse Annexin V и Dead Cell (MCH100105, Millipore) в анализаторе клеток Muse™ (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя.

2,9|Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Экстракцию тотальной РНК и синтез кДНК проводили в соответствии с инструкциями производителя для RNAiso Plus (9109, Takara) и PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) соответственно. ПЦР в реальном времени проводили с использованием THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) в системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Connect (Bio-Rad). Уровни транскриптов нормализовали по уровню экспрессии -актиновой мРНК. qRT-PCR проводили в трех экземплярах с использованием геноспецифических праймеров. HIF-1 амплифицировали с использованием прямого 5'-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3' и обратного 5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3' праймеров. -актин амплифицировали с использованием прямого, 5'-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3' и обратного 5'-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3' праймера.

2.10|Трансфекция миРНК

Для исследования индуцированного RNAi нокдауна HIF-1 в клетках HK-2 в шестилуночных планшетах готовили 5,0 × 104 клеток HK-2 на лунку. Два вида РНКи — HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] и siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) — использовали с липофектамином RNAiMAX. Реагент для трансфекции (Thermo Fisher Scientific). В качестве отрицательного контроля использовали Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Смешивали по 1,5 мкл каждой siRNA и 5 мкл RNAiMAX. Клетки, трансфицированные siRNA, инкубировали в условиях нормоксии или гипоксии (1% O2) в течение 48 ч и экстрагировали РНК. Эффективность нокдауна-HIF-1 исследовали с помощью qRT-PCR.

2.11|Живая визуализация эффектов градиента PH

Мы визуализировали внутриклеточный градиент рН живых клеток под покровным стеклом. Клетки обрабатывали внутриклеточным рН-индикатором pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя перед внедрением модели покровного стекла. Инвертированный флуоресцентный микроскоп BZ-X710 (Keyence Corporation) с фильтром GFP использовали для наблюдения временного перехода градиента интенсивности флуоресценции под покровным стеклом.

2.12|Количественный анализ кольца HIF

2.12.1|Сайт кольца HIF

Мы измерили расстояние колец HIF и областей, положительных по пимонидазолу, от краев покровного стекла с помощью ImageJ следующим образом. Определяли площади внешнего и внутреннего кругов HIF-кольца и пимонидазол-положительного круга и рассчитывали радиус каждого круга. Каждое значение было вычтено из 7,5 мм, что составляет радиус покровного стекла 15 мм, для расчета его расстояния от края покровного стекла. Было проведено три независимых эксперимента по ИКК HIF в каждом состоянии.

2.12.2|Определение кольца HIF

Мы использовали флуоресцентные изображения, полученные на модели покровного стекла, инкубированной в условиях нормоксии и нейтрального pH. Мы определили расположение кольца HIF и его снаружи и внутри как масштаб 2,5–3,0 (0,22–0,45 мм), 0,5 –1,0 шкала (1,12–1,35 мм) и 5,0–5,5 шкала (2,24–2,47 мм) от края покровного стекла, соответственно, с использованием ImageJ. Мы измерили пять участков сигналов HIF-1 на образец и рассчитали среднее значение. Было проведено три независимых эксперимента по ИКК HIF.

порошок экстракта цистанхе

2.13|Измерение давления кислорода по изображению PLIM

2.13.1|Строительство калибровочной линии для измерения давления кислорода

Калибровочная кривая клеток HK-2 была построена на основе метода, описанного в нашем предыдущем отчете (Yoshihara et al., 2015). Клетки HK-2, загруженные 500 нМ BTPDM1 в течение 30 минут, культивировали в мультигазовом инкубаторе с изменяемой концентрацией кислорода, оборудованном инвертированным флуоресцентным микроскопом, который был подключен к системе измерения продолжительности жизни. Калибровочная линия, основанная на анализе Штерна-Фольмера, была построена с использованием времени жизни фосфоресценции (PL) клеток HK-2 при нескольких различных напряжениях кислорода с использованием

Уравнение (1)

где τp представляет собой PL в pO2, τ0 представляет PL в дезоксигенации, kq представляет собой константу скорости тушения, а pO2 представляет собой парциальное давление кислорода. Используя эту калибровочную линию, можно рассчитать давление кислорода по PL.

2.13.2|PLIM-изображение модели покровного стекла

Готовили клетки HK-2, нагруженные 500 нМ BTPDM1 в течение 30 мин. Модель покровного стекла была сконструирована и культивирована в мультигазовом инкубаторе с изменяемой концентрацией O2, оснащенном инвертированным флуоресцентным микроскопом, подключенным к системе измерения продолжительности жизни.

Изображения микроскопии с изображением жизни фосфоресценции (PLIM) были записаны с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного системой конфокального сканирования (Hirakawa et al., 2018). Изображения PLIM были получены после 30-минутной инкубации в 21-процентном или 4-процентном O2. Были сделаны четыре PLIM-изображения на образец из верхней, нижней, левой и правой областей вблизи края покровного стекла, чтобы определить среднюю PL с учетом изменения PL в покровном стекле.

2.13.3|Идентификация кольца HIF на изображении PLIM

Пимонидазол был положительным при давлении кислорода ниже 10 мм рт.ст. ФЛ-эквивалент давления кислорода 10 мм рт. ст. составлял 4034,6 нс в соответствии с калибровочной линией, поэтому можно было идентифицировать внешнюю линию круга пимонидазола на PLIM-изображении. Впоследствии места внешнего и внутреннего колец HIF на изображении PLIM можно было найти с помощью количественного анализа расстояния. Мы измерили диапазон средних PL, эквивалентных кольцу HIF в 21% O2 и 4% O2.

2.13.4|Измерение давления кислорода в кольце HIF

Мы рассчитали диапазон давлений кислорода кольца HIF по PL, используя калибровочную линию. Изображения PLIM анализировали с помощью программы SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|статистический анализ

Критерий Даннета использовался для сравнения экспериментальных и контрольных групп, и значения <0,05 считались="" указывающими="" на="" статистически="" значимые="" различия.="" для="" сравнения="" трех="" или="" более="" групп="" использовались="" t-критерии="" стьюдента,="" и="" применялось="" скорректированное="" бонферрони="" p-значение.="" все="" статистические="" анализы="" проводились="" с="" использованием="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" предполагалось,="" что="" значения="" получены="" из="" нормально="" распределенной="" популяции="" и="" показаны="" как="" среднее="" значение="" ±="" стандартное="" отклонение="">

что такое цистанхе

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|Формирование кислородного градиента в модели гипоперфузии

Мы подтвердили существование градиента кислорода в модели гипоперфузии, вызванной помещением покровного стекла, путем прямой оценки напряжения кислорода с использованием фосфоресценции. Измерение интенсивности фосфоресценции может предсказать приблизительную тенденцию давления кислорода (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Мы наблюдали интенсивность фосфоресценции модели покровного стекла клеток HK-2, обработанных BTPDM1. Изображения интенсивности фосфоресценции показали гипоксию в большей части области внутри покровного стекла, но не гипоксию вблизи края, наблюдение, которое предполагает существование кислородного градиента вокруг края покровного стекла в клетках HK-2, покрытых покровным стеклом. покровное (рис. 1а). Поскольку интенсивность фосфоресценции зависит от концентрации зонда и времени возбуждения, измерение времени жизни фосфоресценции (PL) полезно для количественного анализа давления кислорода (Yoshihara et al., 2015). Таким образом, для количественного измерения напряжения кислорода культивируемых клеток вокруг края покровного стекла мы получили PLIM-изображения клеток HK-2, покрытых покровным стеклом в течение 30 минут (рис. 1b). PL удлинялся по мере увеличения расстояния от края покровного стекла. Мы подтвердили, что напряжение кислорода, рассчитанное с использованием калибровочной линии (рис. S3), уменьшалось по мере увеличения расстояния от края покровного стекла, что свидетельствует о существовании градиента кислорода вокруг края покровного стекла (рис. 1с). Изучение временного профиля интенсивности фосфоресценции показало, что кислородный градиент начал формироваться через 10 мин после помещения покровного стекла.

(Рисунок 1г).

3.2|Уникальное распределение HIF-1 в модели гипоперфузии, "кольцо HIF"

Мы исследовали распределение HIF-1 в модели гипоперфузии с кислородным градиентом. ICC HIF-1 в клетках HK-2 показал усиление в форме пончика на краю пимонидазол-положительной области, которую мы назвали «кольцом HIF» (рис. 2а). Интенсивность сигнала HIF-1 была значительно выше на кольце HIF, чем в его внутренней или внешней областях (рис. 2b). Это явление было подтверждено с помощью ICC с другим антителом HIF-1 (рис. S4a) или другими трубчатыми клеточными линиями (рис. S4b,c). Мы также провели ICC-анализ HIF-1 в других видах культивируемых клеток, таких как клетки рака шейки матки HeLa. Хотя слабая адгезия этих клеток к покровному стеклу затрудняла детальную оценку распределения HIF-1, мы наблюдали усиление HIF-1 в форме пончика в клетках HeLa (рис. S4d).

Кольцо HIF и пимонидазол-положительная область начали формироваться через несколько часов после помещения покровного стекла, а кольцо HIF стало статично через 3 часа (рис. 2c). Нокдаун HIF-1 привел к исчезновению сигнала HIF-1, включая кольцо HIF (рис. 2d, рис. S4e), что указывает на то, что кольцо HIF зависело от HIF-1.

Чтобы исследовать возможность того, что образование кольца HIF зависит от кислорода, мы исследовали распределение HIF-1 в модели покровного стекла при инкубации с различным давлением кислорода. Мы помещали чашку в гипоксические камеры с разным напряжением кислорода сразу после изготовления модели покровного стекла. Во время гипоксической инкубации мы наблюдали, что как кольцо HIF, так и пимонидазол-положительная область расширялись наружу (рис. 3а). Мы измерили расстояние каждого кольца HIF и области, положительной по пимонидазолу, от края покровного стекла в условиях инкубации с нормоксией, 4% O2 и 1% O2. И кольцо HIF, и пимонидазол-положительная область расширялись наружу по мере снижения окружающего напряжения кислорода (рис. 3b). Эти результаты показали, что кольцо HIF зависит от HIF-1 и напряжения кислорода.

Чтобы подтвердить, что накопление в форме пончика является специфическим явлением HIF, мы выполнили ICC с генами домашнего хозяйства в модели покровного стекла. Сигналы GAPDH и актина сохранялись на всей площади покровного стекла и были сопоставимы между областью кольца HIF и другими областями (рис. S5a,b).

3.3|Измерение диапазона давления кислорода кольца HIF

Мы подтвердили кольцеобразное усиление накопления HIF-1 в культивируемых клетках, покрытых покровным стеклом, явление, зависящее от напряжения кислорода. Чтобы определить диапазон вовлеченного напряжения кислорода, мы проанализировали давление кислорода в кольце HIF, используя метод времени жизни фосфоресценции. Мы получили PLIM-изображения модели покровного стекла после 30 мин инкубации в 21-процентном или 4-процентном O2 (рис. 4a). Кольцо HIF образовалось на краю круга пимонидазола в ICC HIF (рис. 3b). Мы идентифицировали сайт на изображении PLIM, который был эквивалентен пимонидазол-позитивной области в ICC HIF, а затем идентифицировали сайт, соответствующий кольцу HIF (рис. 4b), используя количественный анализ данных о расстоянии от кольца HIF и пимонидазол-положительная область (рис. 3b). Мы также измерили диапазон PL кольца HIF, а затем использовали калибровочную линию (рис. S3) для расчета давления кислорода кольца HIF в 21% O2 (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] мм рт. ст.) и 4 процента O2 (2,19 [0,21–4,32] ~ 20,4 [17,1–24,1] мм рт. ст.) (рис. 4c).

3.4|Накопление HIF-1 при однородном напряжении кислорода

В то время как слабые сигналы HIF-1 за пределами кольца HIF в модели покровного стекла можно отнести к недостаточной гипоксии, сигналы внутри кольца, где HIF-1 должны были более сильно активироваться из-за более низкого напряжения кислорода, должны контролироваться независимым от кислорода явлением. Чтобы изучить явления, которые вызывают отсутствие максимального накопления HIF-1 в аноксической области, происходящее только в модели гипоперфузии, мы исследовали, существует ли обратная связь между напряжением кислорода и накоплением HIF-1 при инкубации. при однородном напряжении кислорода. Вестерн-блот-анализ клеточных лизатов при различном однородном напряжении кислорода показал увеличение накопления HIF-1 во время инкубации в бескислородной среде (рис. 5а). Репортерный анализ HRE-люциферазы также показал, что накопление HIF-1 увеличивалось при более низком напряжении кислорода в условиях однородного напряжения кислорода (рис. 5b). Эти результаты показали, что накопление HIF-1 зависело от напряжения кислорода, при этом максимальное накопление наблюдалось в бескислородном диапазоне. Характеристики HIF-1 должны различаться между моделью гипоперфузии и моделью с однородным напряжением кислорода. Мы предположили, что уникальное явление накопления HIF-1 в этой модели гипоперфузии может быть обусловлено фактором, отличным от напряжения кислорода.

3,5|Образование кольца HIF не зависело от кандидата наук

Мы исследовали, активировалась ли деградация HIF-1, возможный механизм образования кольца HIF, внутри кольца HIF. Эта идея казалась несостоятельной, потому что гидроксилирование с помощью Ph.D., ограничивающий скорость процесс деградации HIF, требует кислорода в качестве субстрата. Хлорид кобальта широко используется в качестве химического стабилизатора HIF. Мы построили модель покровного стекла клеток HK-2, обработанных хлоридом кобальта, и провели ICC-анализ HIF. Сигнал HIF-1 не увеличивался внутри кольца HIF, что стало неясным из-за увеличения сигнала HIF-1 вне кольца (рис. 6c). ICC клеток HK-2 с нокдауном PHD2, которая, как полагают, является основной пролилгидроксилазой HIF в экспериментах с клеточными культурами (Strowitzki et al., 2019), дала аналогичные результаты (рис. S6). Эти результаты показали, что ось PHD-VHL деградации HIF не связана с образованием кольца HIF.

3.6|Влияние pH на накопление HIF-1

В предыдущем отчете описывалось использование модели покровного стекла сердечных миоцитов, у которых внутри покровного стекла наблюдалось падение pH (Pitts & Toombs, 2004). Мы исследовали рН под покровным стеклом и его влияние на образование кольца HIF. Мы обработали клетки HK-2 внутриклеточным индикатором рН, интенсивность флуоресценции которого позволяет оценить рН в клетках. Визуализация в режиме реального времени показала, что рН снизился на большей части внутренней области, но не у края покровного стекла, что свидетельствует о наличии градиента рН вокруг края в модели покровного стекла (рис. 6а). Количественный анализ корреляции между интенсивностью флуоресценции и расстоянием от края покровного стекла показал, что первая повышалась по мере увеличения расстояния, что подтверждает существование градиентов pH и кислорода вокруг края покровного стекла (рис. 6b). Вестерн-блот-анализ клеточных лизатов при однородных концентрациях кислорода показал, что инкубация в среде с pH 5,0 подавляла накопление HIF-1 в условиях гипоксии (рис. S7a-d). Мы также подтвердили, что накопление HIF-1 при гипоксии в различных условиях pH снижалось ниже pH 6,0 (рис. S8a-c).

В одном отчете подчеркивалась важность умеренно кислых условий при pH около 6.0. Согласно этому исследованию, реоксигенация после гипоксии подкисляла среду, что вызывало ядрышковую секвестрацию VHL. В свою очередь, деградация HIF была предотвращена в миотубах C2C12, нейронах PC12 и 786-0 раковых клетках почки (Mekhail et al., 2004). В нашем исследовании в модели покровного стекла при значениях рН от 5,0 до 7,4 не наблюдалось изменения распределения ВХЛ в тубулярных клетках между областями накопления HIF-1 и теми, в которых оно было подавлено. (Рисунок S9a–c). Тубулярные клетки подвергаются воздействию широкого диапазона значений рН (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), поэтому мы исследовали изменение HIF-кольца в средах с разным pH. значения от 5,0 до 8,5. Кольцо HIF отчетливо наблюдалось в средах с рН 8,5 и 7,4 (рис. 6в). Кольцо HIF также существовало при pH 6,5, но было затемнено (рис. 6c). Сигнал HIF-1 был ослаблен на всей площади покровного стекла при рН 5,0. (Рисунок 6с). Мы провели дальнейший количественный анализ позиционных отношений между кольцом HIF и краем пимонидазол-положительной области (рис. 7а) и обнаружили, что положение кольца варьировалось в зависимости от рН. Внутренний круг имеет тенденцию к расширению наружу при рН 6,5 по сравнению с рН 7,4, в то время как внешний круг значительно сужается внутрь при рН 8,5, исходя из края пимонидазол-положительной области (рис. 7b, c). Мы также подтвердили, что активность генов домашнего хозяйства сохранялась в модели покровного стекла при инкубации в кислой среде (рис. S10). Таким образом, рН, по-видимому, играет важную роль в механизме, лежащем в основе образования кольца HIF.

4|ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы определили уникальное распределение HIF-1 в клетках почечных канальцев, используя модель гипоперфузии, вызванной помещением покровного стекла. Мы обнаружили, что образование и поддержание кольца HIF регулируются давлением кислорода и рН, оба из которых существовали в градиенте на краю покровного стекла в модели покровного стекла. Основываясь на этих результатах, мы предлагаем возможный механизм образования кольца HIF, включающий накопление HIF-1 при снижении напряжения кислорода и подавление накопления из-за низкого pH на определенном расстоянии от края покровного стекла (рис. 8). ).

Гипоперфузия индуцируется разрежением микроциркуляторного русла при ХБП (Mimura & Nangaku, 2{{2{0}}10; Nangaku, 2006). В нашей предыдущей работе мы использовали визуализацию in vivo, чтобы продемонстрировать наличие градиента кислорода в клетках почечных канальцев нормальных почек мыши (Hirakawa et al., 2018). Также ожидается, что напряжение кислорода будет гетерогенным в канальцевых клетках при ХБП. Однако остается неясным, влияет ли наличие гипоперфузии с кислородным градиентом на систему защиты от гипоксии HIF. В этом исследовании мы исследовали распределение HIF в культивируемых клетках проксимальных канальцев в условиях гипоперфузии и обнаружили, что градиент кислорода в культивируемых клетках почечных канальцев успешно моделировался с использованием круглого покровного стекла. Данные экспериментов с использованием однородного напряжения кислорода показали, что HIF-1 , гидроксилирование и последующая деградация которого в основном зависят от кислорода, накапливаются. То есть количество HIF-1 увеличивается по мере уменьшения напряжения кислорода. Однако в нашей модели покровного стекла HIF-1 был подавлен в бескислородной области и имел наибольшее накопление на определенном расстоянии от края покровного стекла. Это скопление HIF в форме пончика никогда ранее не показывалось. Мы показали, что образование кольца HIF можно было наблюдать независимо от напряжения кислорода в атмосфере инкубации, но его местоположение зависело от напряжения кислорода. Диапазон напряжения кислорода на кольце HIF был измерен примерно на уровне 4–20 мм рт.ст. с использованием PLIM с BTPDM1. Большинство предыдущих исследований, которые были сосредоточены на культивировании клеток в атмосфере с однородным напряжением кислорода, обнаружили, что количество белка HIF-1 увеличивалось в гипоксическом или аноксическом диапазоне (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Таким образом, в нашей модели на образование колец HIF должен влиять фактор, отличный от напряжения кислорода; это не зависело от степени доктора философии, ограничивающего скорость процесса деградации HIF. Прорывом в выяснении механизма образования кольца HIF стало открытие нами роли градиента pH, а также градиента кислорода в модели покровной губы, что ограничивало приток среды подобно гипоперфузии in vivo. модель. В этой модели гипоперфузии внутриклеточный рН снижался по мере увеличения расстояния от края покровного стекла, а вокруг края покровного стекла наблюдался градиент рН. Мы показали, что накопление HIF-1 было подавлено при низком pH, около pH 5,0, по сравнению с инкубацией при pH около нейтрального при однородном давлении кислорода. Внешний край кольца HIF расширился наружу при pH 6,5, а внутренний край кольца HIF сжался внутрь при pH 8,5, исходя из края пимонидазол-положительной области. Кольцо HIF было затемнено в кислых условиях, а сигнал HIF-1 исчезал при pH 5,0. Таким образом, мы выяснили важность рН для образования кольца HIF в модели покровного стекла. Мы продемонстрировали возможность того, что кольцо HIF образовалось за счет подавления накопления HIF-1 низким pH внутри кольца.

В нескольких предыдущих исследованиях с использованием метода покровного стекла использовались раковые клетки. Согласно одному отчету с использованием клеточной линии гепатомы человека Hep3B, которая экспрессирует зависимое от кислорода красное смещение зеленого флуоресцентного белка (AcGFP1), живая визуализация клеток, покрытых прямоугольным покровным стеклом, показала красное смещение по мере увеличения расстояния от края покровного стекла (Takahashi & Сато, 2010). Спектр излучения клеток гепатомы смещался от длины волны флуоресценции зеленого флуоресцентного белка (GFP) к красной по мере снижения напряжения кислорода. В другом исследовании напряжение кислорода в клетках SCC-7 с круглым покровным стеклом 15- мм было измерено с использованием метода времени жизни фосфоресценции. Напряжение кислорода составляло 6,9 мм рт. ст. и 166 мм рт. ст., рассчитанное по PL, которое составляло 3,89 мкс и 893 мкс, 0–2 мм внутри и 0–1 мм снаружи от края покровного стекла соответственно (Yoshihara et al., 2015). Метод покровного стекла также использовался с сердечными миоцитами, система, которая привлекла внимание как многообещающая модель ишемии-реперфузии in vivo. Kelly et al показали, что миоциты, покрытые покровным стеклом, со временем претерпевают заметные морфологические изменения, сопровождающиеся изменениями потенциала митохондриальной мембраны и динамики плазматической мембраны, что в конечном итоге приводит к гибели миоцитов. Они также продемонстрировали, что внутриклеточный рН миоцитов, покрытых покровным стеклом, быстро падает примерно до рН 4 в центре покровного стекла (Pitts & Toombs, 2004). Модель покровного стекла, препятствующая диффузии кислорода или питательных веществ к культивируемым клеткам под покровным стеклом, может имитировать модель in vivo с ишемическими, нормальными и краевыми зонами в центре, снаружи и по краю покровного стекла соответственно. В нескольких исследованиях эта модель использовалась в качестве модели ишемии-реперфузии миоцитов in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Насколько нам известно, наше исследование является первым, в котором метод покровного стекла был применен к тубулярным клеткам. В нашей системе расстояние от края покровного стекла до области, эквивалентной 10 мм рт. . Этот результат может быть совместим с предыдущими отчетами с использованием покровного стекла толщиной около 15 мм, демонстрируя существование кислородного градиента по крайней мере в пределах 2 мм от края (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Мы исследовали скорость апоптоза клеток под покровным стеклом (рис. S11) и обнаружили, что GAPDH и актин сохранялись даже внутри кольца HIF, что указывает на то, что кольцо HIF не было вызвано только апоптозом или гибелью клеток внутри кольца HIF.

В нескольких исследованиях измерялось напряжение кислорода в почках с использованием различных методов. Вот несколько примеров измерения напряжения кислорода в нормальных почках: 50 мм рт. ст. и 30 мм рт. ст. в корковом и мозговом веществе с использованием микроэлектродов; 49 мм рт. ст. и 41 мм рт. ст. в сегментах S1 и S2 канальцевых клеток коры при использовании PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Напряжение кислорода больных почек будет ниже. Согласно предыдущему отчету об использовании кислородных микроэлектродов, диабетические крысы имели более низкое паренхиматозное напряжение кислорода в почках: 36 мм рт.ст. и 11 мм рт.ст. в коре и мозговом веществе соответственно (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Поскольку кислородные микроэлектроды измеряют среднее паренхиматозное напряжение кислорода, в больных почках ожидается более широкий диапазон. Внутриклеточное напряжение кислорода снижалось до нуля мм рт. ст. на модели ишемизированной почки с пережатием латеральной почечной артерии и вены (Hirakawa et al., 2015). Принимая во внимание эти результаты, диапазон напряжения кислорода на кольце HIF, примерно 4–20 мм рт.ст., казался правдоподобным in vivo.

Далее мы обнаружили, что pH влияет на образование кольца HIF, а также на напряжение кислорода. Поскольку эпителиальные клетки канальцев в почках постоянно подвергаются воздействию мочевой жидкости, рН клеток канальцев должен зависеть от рН мочи. Учитывая широкий диапазон рН мочи, мы решили исследовать клетки, инкубированные в диапазоне рН от 5,0 до 8,5. Были проведены исследования диапазона pH в нормальных почках. Одно исследование показало, что рН коры был 7,39 ± 0.{{1{0}}8, а рН мозгового вещества - 7,20 ± {{20. }}}.09, согласно измерению с помощью микроэлектродов (Burke et al., 1999). Другое исследование с использованием изображений рН на основе МРТ показало значения рН 7,3 ± 0,13 и 7,0 ± 0,29 соответственно (Raghunand et al., 2003). Сообщалось, что рН почек снизился с 6,5 до 6,32 и до 5,83 в тяжелых случаях на мышиной модели ХБП с ацидозом (Pavuluri et al., 2019). Эти наблюдения свидетельствуют о снижении и изменении рН при ХБП. Однако влияние рН на HIF-1, вызванное хронической гипоксией при ХБП, изучено недостаточно. В настоящем исследовании сдвиг кольца HIF наблюдался между pH 6,5 и pH 7,4, что является вероятным при ХБП. Этот результат подтвердил гипотезу о том, что умеренное снижение pH влияет на накопление HIF-1 при ХБП. На основании данных о снижении рН ниже 6,0 в тяжелых случаях ХБП также необходимо оценить физиологическое состояние HIF-1 при более низком рН. Хотя были сообщения о том, что кислая среда, даже при нормоксии, стабилизирует HIF-1, в большинстве этих отчетов исследовались условия умеренной кислотности, рН выше 6,0 (Филатова и др., 2016; Мехайл и др., 2004). . В этой работе мы показали подавление накопления HIF-1 в канальцевых клетках при pH 5,0 и ослабление сигналов HIF-1 в модели покровного стекла, инкубируемой при pH 5,0. Следовательно, снижение рН почек при ХБП in vivo может быть связано с недостаточной активацией HIF, а также с уремическими токсинами в гипоксической почке, усугубляющими прогрессирование ХБП (Tanaka et al., 2013).

Наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, в зоне гипоперфузии питательная среда должна быть с дефицитом питательных веществ, в дополнение к наличию дефицита кислорода и пониженного рН. Однако трудно определить влияние рН, напряжения кислорода и других факторов, вызванных гипоперфузией. В организме в органах и клетках возникает ишемия, патологическая гипоперфузия крови, обусловленная сочетанием низкого содержания кислорода и питательных веществ. Важно понимать разницу между ощущением гипоксии и ощущением ишемии. Несмотря на сложность объяснения биологического эффекта каждого фактора, наша модель гипоперфузии физиологически правдоподобна, имитируя патологический статус in vivo. Во-вторых, создание модели покровного стекла требует навыков и практики, поскольку большинство клеток иногда отделялись во время удаления покровного стекла, особенно при использовании традиционного метода (рис. S2a). Эта проблема зависела от используемой клеточной линии. Например, нам было трудно применить модель покровного стекла к клеткам НЕК 293, потому что их адгезия к покровному стеклу была относительно слабой. В-третьих, желательно минимизировать повреждение культивируемых клеток под покровным стеклом. Количество поврежденных клеток возрастало по мере увеличения периода, в течение которого они были покрыты, что показал анализ апоптоза. Мы определили, что 3 часа подходили для оценки кольца HIF, когда оно казалось статичным, и примерно всего 10 процентов клеток становились апоптотическими (рис. S11). Четвертым ограничением была сложность прикрепления культивируемых клеток к покровному стеклу одинаковым образом в каждом образце (рис. S2b, c). Разница в прикреплении между традиционным и альтернативным методом изготовления модели покровной губы также могла повлиять на исследование. Мы измерили диапазон напряжения кислорода, эквивалентный кольцу HIF, с помощью метода времени жизни фосфоресценции, в котором мы создали модель покровного стекла с использованием традиционного метода. Поскольку кольцо HIF во время иммуноцитохимии визуализировали альтернативным методом, истинное напряжение кислорода могло быть другим. Мы минимизировали эти ошибки, используя доказательства того, что пимонидазол был положительным при давлении кислорода 10 мм рт. ст. или ниже. Пятое ограничение заключается в том, что внутриклеточный рН не обязательно совпадает с рН культуральной среды. Несколько предыдущих отчетов показали, что внутриклеточный рН в определенной степени соответствует рН среды в культивируемых клетках (Michl et al., 2019), мы могли оценить только тенденцию внутриклеточного рН, изменив рН среды. In vivo взаимосвязь между pH внутриклеточных и внеклеточных областей, таких как моча или жидкость организма, более сложная, чем в культивируемых клетках. Таким образом, в будущем потребуются дальнейшие исследования того, как сдвиг pH регулирует накопление белка HIF-1 in vivo.

Польза Cistanche: улучшение почкафункция

Другое ограничение заключается в том, что рН должен влиять на маркер гипоксии пимонидазол. Мы сравнили расстояние края пимонидазол-положительной области от центра покровного стекла при различных условиях pH в нашей модели покровного стекла. Край пимонидазол-положительной области был сопоставим между pH 6,5, 7,4 и 8,5 (рис. S12a,b). Предыдущее исследование также продемонстрировало сохранение связывания пимонидазола при различных значениях pH (Kleiter et al., 2006). На основании этих данных мы пришли к выводу, что пимонидазол является подходящим маркером гипоксии для наших экспериментов с покровным стеклом. Последним ограничением является то, что при диапазоне напряжения кислорода примерно от 4 до 20 мм рт. кислородные зонды имеют преимущества для измерения очень низких концентраций кислорода из-за их значительно более длительного времени жизни фосфоресценции по сравнению с зондами, использующими комплексы Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Однако в целом количественное измерение содержания кислорода на основе фосфоресценции, рассчитанное по уравнению Штерна-Фольмера, лучше работает в диапазоне низких значений O2 (Папковский и Жданов, 2016). В нескольких предыдущих исследованиях было продемонстрировано измерение давления кислорода на основе комплекса Ir(III) на уровне примерно 10 мм рт. ст. (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Поэтому мы считаем, что диапазон напряжения кислорода в кольце HIF должен быть точным результатом.

5|ВЫВОДЫ

Таким образом, мы обнаружили, что понимание роли как кислорода, так и рН необходимо для понимания физиологического состояния HIF-1 при ХБП, и может быть получено путем исследования тубулярных клеток с гипоперфузией. Модель покровного стекла с ее ограничениями притока среды была хорошей моделью гипоперфузии in vivo, особенно в канальцах при ХБП, поскольку разрежение перитубулярных капилляров является основным признаком ХБП (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Эта модель гипоперфузии также может имитировать градиенты кислорода и pH in vivo, такие как опухоли и ишемические поражения. Модель обеспечивает многообещающий подход к выяснению этих биологических механизмов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

У всех авторов нет конфликтов интересов, о которых следует заявить.

ВКЛАД АВТОРОВ

Все авторы внесли свой вклад в формирование общей концепции. TH выполнил общие эксперименты. TH и YH проанализировали результаты и сделали цифры. TH написал оригинальную рукопись. KM, TY и ST провели эксперимент, используя метод времени жизни фосфоресценции, и отредактировали часть рукописи. YH, TT и MN редактировали всю рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

ССЫЛКА

Акияма Х., Такахаши И., Симода Ю., Мукаи Р., Йошихара Т. и Тобита С. (2018). Кислородная визуализация живых клеток и глазного дна на основе комплекса Ir(iii) с помощью закрытой камеры ICCD. Фотохимические и фотобиологические науки, 17(6), 846–853.

Акидзава Т., Нангаку М., Ямагути Т., Араи М., Коретомо Р., Маэда К., Миядзава Ю. и Хираката Х. (2019). Энародустат, конверсионная и поддерживающая терапия анемии у пациентов, находящихся на гемодиализе: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование фазы 2b с последующим долгосрочным исследованием. Нефрон, 143(2), 77–85.

Амери, К., Берк, Б., Льюис, К.Э., и Харрис, А.Л. (2002). Регуляция крысиного элемента VL30 в клетках рака молочной железы человека в условиях гипоксии и аноксии: роль HIF-1. Британский журнал рака, 87 (10), 1173–1181.

Асаи Х., Хирата Дж., Хирано А., Хираи К., Секи С. и Ватанабэ-Аканума М. (2016). Активация арилуглеводородного рецептора опосредует подавление гипоксически-индуцируемой фактор-зависимой экспрессии эритропоэтина индоксилсульфатом. Американский журнал физиологии. Клеточная физиология, 310 (2), C142–C150.

Берк, Т.Дж., Малхотра, Д., и Шапиро, Дж.И. (1999). Факторы, поддерживающие градиент рН в почках: роль сосудистой архитектуры. Kidney International, 56 (5), 1826–1837.

Каррера, С., Сенра, Дж., Акоста, М.И., Альтубити, М., Хаммонд, Э.М., де Вердье, П.Дж., и Масип, С. (2014). Роль фактора транскрипции HIF-1альфа в усилении клеточного деления при физиологическом напряжении кислорода. PLoS One, 9(5), e97938.

Чен Н., Хао С., Пэн С., Линь Х., Инь А., Хао Л., Тао Ю., Лян С., Лю З., Син С., Чен, Дж., Ло, Л., Цзо, Л., Ляо, Ю., Лю, до н.э., Леонг, Р., Ван, К., Лю, К., Нефф, Т., … Ю, КХП (2019 ).

Роксадастат при анемии у пациентов с заболеваниями почек, не получающих диализ. Медицинский журнал Новой Англии, 381(11), 1001–1010.

Чен Н., Цянь Дж., Чен Дж., Юй С., Мэй С., Хао С., Цзян Г., Линь Х., Чжан С., Цзо Л., Хе, К., Фу, П., Ли, Х., Ни, Д., Хеммерих, С., Лю, К., Щеч, Л., Бесараб, А., Нефф, Т.Б., … Валоне, Ф.

Х. (2017). Фаза 2 исследований перорального ингибитора индуцируемого гипоксией фактора пролилгидроксилазы FG-4592 для лечения анемии в Китае. Нефрология, диализ, трансплантация, 32 (8), 1373–1386.

Чанг, К.К., Танака, Т., Инаги, Р., Фудзита, Т., и Нангаку, М. (2011). Индоксилсульфат, типичный уремический токсин, подавляет выработку эритропоэтина зависимым от HIF образом. Лабораторные исследования, 91 (11), 1564–1571.

Чун, В.Дж., Нах, Д.Ю., Бэ, Дж.Х., Чанг, Дж.В., Ли, Х., и Мун, И.С. (2015). Раствор глюкозы, инсулина и калия защищает желудочковые миоциты новорожденных крыс в модели ишемии/реперфузии покровного стекла in vitro. Корейский тиражный журнал, 45 (3), 234–241.

Койн, Д. В., Голдсмит, Д., и Макдугал, И. С. (2017). Новые варианты анемии при хронической болезни почек. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. поцелуй.2017.09.002

Денг А., Арндт М.А., Сатриано Дж., Сингх П., Риг Т., Томсон С. и др. (2010). Почечная защита при хронической болезни почек: активация фактора, индуцируемого гипоксией, по сравнению с блокадой ангиотензина II. Американский журнал физиологии. Физиология почек, 299(6), F1365–F1373.

Филатова А., Зайдель С., Богурку Н., Граф С., Гарвалов Б.К. и Акер Т. (2016). Ацидоз действует через HSP90 независимо от Ph.D./VHL, способствуя функционированию HIF и поддержанию стволовых клеток при глиоме. Исследование рака, 76 (19), 5845–5856. МОЖЕТ-15-2630

Гольдфарб М., Розенбергер К., Абасси З., Шина А., Зильберсат Ф., Эккардт КУ, Розен С. и Хейман С.Н. (2006). Острая почечная недостаточность у крыс: функциональная компенсация и толерантность к гипоксии. Американский журнал нефрологии, 26 (1), 22–33.

Хейман, С.Н., Розенбергер, К., Розен, С., и Хамаиси, М. (2013). Почему сахарный диабет является фактором риска контраст-индуцированной нефропатии? BioMed Research International, 2013, 123589.

Хиракава Ю., Мизуками К., Йошихара Т., Такахаси И., Хулан П., Хонда Т., Мимура И., Танака Т., Тобита С. и Нангаку М. (2018). Прижизненная визуализация фосфоресценции коркового слоя почки точно измеряет почечную гипоксию. Kidney International, 93 (6), 1483–1489.

Хиракава Ю., Танака Т. и Нангаку М. (2017). Почечная гипоксия при ХБП; Патофизиология и методы диагностики. Границы физиологии, 8, 99.