Ацилированные фенилэтаноидные олигогликозиды с гепатопротекторной активностью из пустынного растения Cistanche Tubulosa

для получения дополнительной информации:Ali.ma@wecistanche.com

Тошио Морикава и др.

Абстрактный

Метанольный экстракт из свежих стеблейЦистанхе трубчатая(Orobanchaceae) проявляет гепатопротекторное действие против индуцированного D-галактозамином (D-GalN)/липополисахаридом (LPS) повреждения печени у мышей. Из выписки три новыхфенилэтаноидолигогликозиды, канканозиды H1 (1), H2 (2) и I(3) были выделены вместе с 16фенилэтаноидные гликозиды(4–19) и два ацилированных олигосахара (20,21). Структуры 1–3 были определены на основе спектроскопических свойств, а также химических данных. Среди изолятов эхинакозид (4, IC50=10,2 мкМ), актеозид (5, 4,6 мкМ), изоактеозид (6,5,3 мкМ), 20-ацетилактеозид (8, 4,8 мкМ) и тубулозид А (10, 8,6 мкМ) ингибировал D-GalN-индуцированную гибель гепатоцитов. Эти пять изолятов, 4 (31,1 мкМ), 5 (17,8 мкМ), 6 (22,7 мкМ), 8 (25,7 мкМ) и 10 (23,2 мкМ), а также цистантубулозид В1 (11, 21,4 мкМ) также уменьшали TNF-α-. индуцированная цитотоксичность в клетках L929. Более того, основные компоненты (4–6) проявляли гепатопротекторное действие in vivo в дозах 25–100 мг/кг перорально.

Нажмите, чтобы узнать о побочных эффектах цистанхе и продуктах цистанхе

1. Введение

Цистанхе трубчатая(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) – многолетнее паразитическое растение, растущее на корнях видов Salvadora или Calotropiss и распространенное в Северной Африке, Аравии и странах Азии.2СтеблиЦистанхе трубчатаяа также вспомогательная сальса и цистанхе пустынная традиционно использовались для лечения импотенции, бесплодия, люмбаго и слабости тела, а также в качестве стимулятора кровообращения.фенилэтаноидs, иридоиды, монотерпены и лигнаны были выделены из Китая и Пакистана.Цистанхе трубчатая.2,4–9 В ходе наших исследований по характеристике биологически активных компонентов в этом натуральном лекарственном средстве мы ранее сообщали, что пять иридоидов, канканозиды A–D и канканол, монотерпенгликозид, канканозид E, двафенилэтаноидиз метанольного экстракта высушенных стеблейЦистанхе трубчатая.10,11 Кроме того, было обнаружено, что метанольный экстракт и несколько изолятов, таких как эхинакозид (4), актеозид (5), цистанозид F (20), 21 и канканозид F, проявляют сосудорасширяющие эффекты, то есть ингибирующие эффекты против вызванных сокращений. норадреналином в изолированной грудной аорте крысы.11 В наших продолжающихся исследованиях компонентов растения метанольный экстракт свежих стеблейЦистанхе канальцы былиБыло обнаружено, что он оказывает защитное действие на повреждение печени, вызванное D-галактозамином (D-GalN)/липополисахаридом (LPS) у мышей. Из метанольного экстракта мы выделили три новыхфенилэтаноидолигогликозиды, названные канканозидами H1 (1), H2 (2) и I (3), а также 16 фенилэтаноидных гликозидов (4–19) и два ацилированных олигосахара (20, 21). Эта статья посвящена выделению и структурному разъяснению этих новыхфенилэтаноидолигогликозиды (1–3). Также обсуждаются структурные требования фенилэтаноидных гликозидов к гепатопротекторной активности (рис. 1).

2. Результаты и обсуждение

2.1. Защитное действие метанольного экстракта из стеблейЦистанхе трубчатаяна повреждение печени, вызванное D-GalN/LPS у мышей

Свежие стеблиЦистанхе трубчатая(выращивается в Урумчи, провинция Синьцзян, Китай) экстрагировали метанолом при кипячении с получением метанольного экстракта (8,36% от свежих стеблей). Как показано в таблице 1, метанольный экстракт в дозах 250–500 мг/кг перорально оказывает ингибирующее действие на повышение уровня аспартатаминотрансаминазы (sAST) и аланинаминотрансаминазы (sALT) в сыворотке крови, маркеров повреждения печени, индуцированного D- GalN/LPS у мышей.

2.2. Химические составляющие стеблейЦистанхе трубчатая

Метанольный экстракт из свежих стеблейЦистанхе трубчатаяподвергали колоночной хроматографии Diaion HP-20 (H2O?MeOH) с получением фракций, элюированных H2O и MeOH (5,63% и 2,73% соответственно). Фракцию, элюированную MeOH, подвергали колоночной хроматографии с SiO2 и ODS и, наконец, ВЭЖХ для получения трех новыхфенилэтаноидолигогликозиды, канканозиды H1 (1, 0.0008 процентов), H2 (2, 0,0001 процента) и I (3, 0,0007 процента) вместе с 16фенилэтаноидные гликозиды, эхинакозид 2,11 (4, 0,45%), актеозид 2,11 (5, 0,28%), изоактеозид 2,11 (6, 0.0 41 процент), цис-актеозид12,13 (7, 0.0007 процентов), 20-ацетилактеозид2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 процентов), декафеоилактеозид14 (9, 0.0002 процента ), тубулосайд А2,11 (10, 0,013 %), цистантубулозиды В19 (11, 0,0020 %), В29 (12,0,0003 %), аренариозид 15 (13, 0,0006 %), видеманнинозид C16 (14,0,0008 %), цистантубулозид A9 (15, 0,0009 %), сирингалид A 30-OaL рамнопиранозид 4 (16, 0,0017 %), камнеозиды I17,18 (17,0,015 %) и II17,18 (18 , 0,0005 процента), и салидрозид11 (19, 0,0027 процента), а также два ацилированных олигосахара, цистанозид F11 (20, 0,0004 процента) и канканоза11 (21, 0,0004 процента).

2.3. Структуры канканозидов H1 (1), H2 (2) и I (3)

Канканозид H1 (1) был получен в виде белого порошка с отрицательным оптическим вращением (½a-24D-45.3 в MeOH). Его ИК-спектр показал полосы поглощения при 3416, 1736, 1638, 16{87}}5, 1518, 1{{107}}70 и 1040 см-1, приписываемые гидроксилам, карбонилам сложных эфиров, эфирным функциональным группам, и ароматические кольца. FABMS-спектры положительных и отрицательных ионов соединения 1 показали пики квазимолекулярных ионов при m/z 835 (M плюс Na) плюс и m/z 811 (MH) соответственно, а молекулярная формула была определена как C37H48O20 с помощью положительно-высокого разрешения. измерение ионов FABMS. В спектрах ЯМР 1Н и 13С соединения 1 (CD3OD, табл. 2 и 3), которые были отнесены различными ЯМР-экспериментами,19 обнаружены сигналы, соответствующие двум метиленам [d 2.70(2H, м, H2-7), 3.66 , 4,07 (по 1H, оба m, H2-8)], орто- и мета-сопряженные ароматические протоны ABC-типа [d 6,52 (1H, dd, J=1,8, 7,8 Гц, H{ {50}}), 6,65 (1H, д, J=1,8 Гц, H-2), 6,67 (1H, д, J=7,8 Гц, H{{62 }})], два bD-глюкопиранозильных фрагмента [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Гц, концевой-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }},2 Гц, внутренний-Glc-H-1)] и аа-L-рамнопиранозил [d 1,06 (3H, d, J=6,0 Гц, Rha-H{{89 }}), 4,80 (1H, шир.с, Rha-H-1)] вместе с ацетильной группой [d 1,98(3H, s)] и транс-п-кумароильной группой {транс-олефином [d 6,34, 7,67 (1H каждый, оба d, J=16,0 Гц, H-8 и 7)] и орто-связанные ароматические протоны типа A2B2- [d 6,80, 7,46 (2H каждый , оба d,J=8,7 Гц, H-3,5 и 2,6)]}. Связи между олигогликозидной и ацильной частями в 1 были охарактеризованы экспериментом HMBC, который показал дальние корреляции между следующими парами протона и углерода: внутренний-Glc-H-1 и C-8 (dC71,9 ); внутренний-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-подобный)] и ацетилкарбонилуглерод (dC 171,4); внутренний-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9,6, 9,6 Гц)] и п-кумароилкарбонилуглерод (dC 168,2); Rha-H-1 и inner-Glc-C-3 (dC 80,5); и терминальный-Glc-H-1 и внутренний-Glc-C-6 (dC69.3) (рис. 2). Наконец, щелочной гидролиз 1 с 5-процентным раствором гидроксида калия (KOH) высвободил транс-п-кумаровую кислоту, которая была идентифицирована анализом ВЭЖХ, вместе с деацилированным продуктом. Деацилированный продукт последовательно обрабатывали 1,0 М соляной кислотой (HCl) для высвобождения L-рамнозы и D-глюкозы, которые идентифицировали с помощью анализа ВЭЖХ с использованием оптического вращательного детектора. }}(3,4-дигидроксифенил)этил OaL-рамнопиранозил-(1- 3)-[bD-глюкопиранозил-(1-6)]-2-O-ацетил{{196 }}О-транс-п-кумароил-bD-глюкопиранозид (1).

Канканозид H2 (2) был выделен в виде белого порошка с отрицательным оптическим вращением (½a 25D 52,4 в МеОН). Его молекулярная формула C37H48O20 оказалась такой же, как у 1, с помощью измерения FABMS с положительными ионами с высоким разрешением. Спектроскопические свойства 2 были очень похожи на свойства 1, за исключением сигналов, обусловленных цис-п-кумароильной группой [d 5,79, 6,95 (1H каждый, оба d, J=12,8 Гц, H{{ 22}} и 7), 6,76, 7,73 (2H каждый, оба d, J=8,7 Гц, H-3,5 и 2,6)]. Кроме того, эксперимент HMBC на 2 также выявил подобные типы дальних корреляций, обнаруженные для 1, между следующими парами протона и углерода: внутренний-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44 }},8 Гц)] и C-8 (dC 72,0); внутренний-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, м)] и ацетилкарбонилуглерод (dC 171,4); внутренний-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Гц)] и п-кумароилкарбонилуглерод (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Гц, Rha-H-1)] и inner-Glc-C-3 (dC 80,7 ); и терминальный-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Гц)] и внутренний-Glc-C-6 (dC 69,4) (рис. 2) . В результате исследования разложения соединение 2 дало цис-п-кумаровую кислоту и два тех же сахара, что и в случае соединения 1. Следовательно, структура канканозида H2 была установлена ​​следующим образом: 2-(3,4- дигидроксифенил)этил OaL-рамнопиранозил-(1-3)-[bD-глюкопиранозил-(1-6)]-2-O-ацетил-4-O-цис-п-кумароил- bD-глюкопиранозид (2).

Канканозид I (3) также был выделен в виде белого порошка с отрицательным оптическим вращением (½a- 25D-62.2 в MeOH). Его молекулярная формула C35H46O18 была определена с помощью положительных и отрицательных измерений FABMS и HRFABMS. Спектроскопические свойства 3(CD3OD, таблицы 2 и 3) накладывались на свойства эхинакозида (4), за исключением сигналов, обусловленных агликоновой частью {{два метилена {d 2,95 (2H, dd, J=7}. 3, 7,8 Гц, H2-7), [3,79 (1H, м), 4,10 (1H, дт, J=16.9, 7,3 Гц), H{{32} }]}, монозамещенные ароматические протоны [d7,18 (1Н, м, Н-4), 7,26–7,28 (4Н, м, Н-2,6, 3,5)]}}. Щелочной гидролиз соединения 3 с 5% КОН высвобождает транс-кофейную кислоту, и деацилированный продукт последовательно обрабатывают 1,0 М HCl для высвобождения L-рамнозы и D-глюкозы. Наконец, связи ацильной группы и фрагментов сахара в 3 были выяснены с помощью эксперимента HMBC, как показано на рисунке 2. На основании вышеупомянутых данных было установлено, что структура канканозида I представляет собой 2-фенилэтил OaL- рамнопиранозил-(1-3)-[bD-глюкопирано-сил-(1-6)]-4-O-транс-кофеоил-bD-глюкопиранозид (3)

2.4. Влияние химических компонентов стеблей Cistanche tubulosa на D-GalN-индуцированную цитотоксичность в первичных культурах гепатоцитов мыши

Известно, что индуцированное D-GalN/ЛПС повреждение печени развивается посредством иммунологических реакций. 19 Сообщается, что этот тип повреждения печени встречается в двух формах. Во-первых, D-GalN увеличивает чувствительность к TNF-α за счет истощения урадинтрифосфата в гепатоцитах. Во-вторых, провоспалительные медиаторы, такие как NO и TNF-α, высвобождаются из активированных ЛПС макрофагов (клеток Купфера). Сообщается, что апоптоз гепатоцитов с помощью TNF-α играет важную роль в повреждении печени, вызванном D-GalN/LPS.20

В наших предыдущих исследованиях гепатозащитных соединений из натуральных лекарственных средств мы сообщали, что некоторые компоненты из Hovenia Dulcis21, Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,32 Anastatica hierochuntica, 33 Panax notoginseng, 34 Cyperus longus, 35 Erycibe expansa, 36 Camellia sinensis, 37 Sedum sarmentosum, 38, 39 Sinocrassula indica, 40 Hedychium coronarium, 41 и Piper chaba 42, 43 показали гепатопротекторное действие на повреждение печени, вызванное D-GalN/LPS. у мышей и/или platyphylla var. japonica,29 Ингибирующее действие Pisum на D-GalN-индуцированную цитотоксичность в первичных культурах гепатоцитов. Так как метанольный экстракт из стеблейЦистанхе трубчатаяпоказали гепатопротекторное действие на D-GalN/ЛПС-индуцированное повреждение печени у мышей (см. ante), ингибирующее действие компонентов на D-GalN-индуцированную цитотоксичность в первично культивируемых гепатоцитах мышей исследовали с использованием 3-(4,{ Анализ {6}}диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Как показано в таблице 4, эхинакозид (4, IC50=10,2 мкМ), актеозид (5, 4,6 мкМ), изоацетеозид (6, 5,3 мкМ), 20-ацетилактеозид (8, 4,8 мкМ), тубулозиды А (10,8,6 мкМ) и В11 (22, 14,6 мкМ) и канканозид G11 (23, 14,8 мкМ) показали сильную активность. Их активность была выше, чем у коммерческого силибина (38,8 мкМ)33–43 в качестве положительного контроля.44,45 Структурные требованияфенилэтаноидные гликозиды for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 лМ)]; (2) агликон, имеющий 3,4-дигидроксигруппу, показал более сильную активность, чем агликон, имеющий 4-гидроксигруппу (6 > 23); (3) 60-ObD-глюкопиранозильная часть снижала активность (4 < 5,="" 10="">< 8);="" (4)="" 8-obd-глюкопиранозильная="" часть,="" имеющая="" 40-o-кофеоильную="" группу,="" проявляла="" более="" сильную="" активность,="" чем="" та,="" которая="" имела="" 60-o-кофеоильную="" группу="" (5="6," 8=""> 22 ); и (5) введение 20-O-ацетильной части снижало активность (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 мкМ, данные не представлены). Таким образом, было обнаружено, что эти соединения не влияют на сверхпродукцию NO и TNF-α макрофагами, активированными LPS.

2.5. Влияние химических компонентов на TNF-α-индуцированную цитотоксичность в клетках L929

Для выяснения влияния компонентов на чувствительность гепатоцитов к ФНО-а, индуцированное ФНО-а снижение жизнеспособности клеток L929, чувствительную к ФНО-а клеточную линию 48 исследовали с использованием анализа МТТ. Без испытуемых образцов жизнеспособность клеток снижалась до прибл. 60 процентов после инкубации клеток с 20 нг/мл TNF-a в течение 44 часов по сравнению со случаем без TNF-a. Как показано в таблице 5, эхинакозид (4, IC50=31,1 мкМ), актеозид (5, 17,8 мкМ), изоацетеозид (6, 22,7 мкМ), 20-ацетилактеозид (8, 25,7 мкМ), тубулозид А (10,23,2 мкМ) и цистантубулозид В1 (11, 21,4 мкМ) ингибировали снижение жизнеспособности клеток, и их активность была выше, чем у пиперина42,43 и силибина. Структурные требованияфенилэтаноидные гликозиды for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 мкМ)] и (5) введение 20-O-ацетильного фрагмента снижало активность (8 < 5,="" 22="">< 6).="" было="" обнаружено,="" что="" эти="" требования="" аналогичны="" тем,="" которые="" наблюдались="" в="" предыдущей="" главе="" в="" отношении="" ингибирующего="" действия="" на="" d-galn-индуцированную="" цитотоксичность="" в="" первично="" культивируемых="" мышиных="">

Эти данные in vitro позволяют предположить следующие возможные механизмы гепатопротекторного действия компонентов стеблейЦистанхе трубчатая: (i) снижение цитотоксичности, индуцированной D-GalN (4–6, 8, 10, 22 и 23), и (ii) снижение цитотоксичности, индуцированной TNF-α (4–6, 8, 10 и 11) .

2.6. Защитные эффекты эхинакозида (4), актеозида (5) и изоактеозида (6) против повреждения печени, вызванного D-GalN/LPS у мышей, и механизм их действия

Наконец, мы рассмотрели влияние принципалафенилэтаноидные гликозиды, эхинакозид (4), актеозид (5) и изоактеозид (6) на D-GalN/LPS-индуцированное повреждение печени у мышей. Как показано в таблицах 6 и 4–6, значительно ингибировалось повышение уровня sAST и sALT, индуцированное D-GalN/LPS у мышей в дозах 25–100 мг/кг перорально. С другой стороны, 4–6 не влияли на сверхпродукцию TNF-α из активированных LPS макрофагов. Кроме того, 4–6 значительно ингибировали гибель клеток L929, вызванную TNF-α, что указывает на снижение чувствительности клеток L929 к TNF-α (см. ante). Эти данные свидетельствуют о том, что 4–6 снижают чувствительность этих клеток к цитотоксичности, индуцированной TNF-α. Сообщалось о многих соединениях, которые ингибируют гибель клеток, индуцированную D-GalN, и продукцию TNF-a,24,26,32, но сообщалось о нескольких соединениях, которые избирательно снижают чувствительность гепатоцитов к TNF-a.42,43,49,50

В заключение из свежих стеблейЦистанхе трубчатая, три новыхфенилэтаноидные гликозиды, канканозиды H1 (1), H2 (2) и I (3) вместе с 16 известнымифенилэтаноидные гликозиды(4–19) и два ацилированных олигосахара (20, 21). Структурные требования к их защитному действию на повреждение гепатоцитов, вызванное D-GalN, и цитопротективное действие на клетки L929, вызванное TNF-α, были следующими; (1) агликоновая часть необходима для активности; (2) агликон, имеющий 3,4-дигидроксильные группы, проявлял более сильную активность, чем агликон, имеющий 4-гидроксильную группу; (3) 60-ObD-глюкопиранозильный фрагмент снижал активность; (4) 8-ObD-глюкопиранозильная часть, имеющая 40-O-кофеоильную группу, показала более сильную активность, чем та, которая имеет 60-O-кофеоильную группу; и (5) введение {{27 }}О-ацетильная группа снижала активность.фенилэтаноидные гликозиды, эхинакозид (4), актеозид (5) и изоактеозид (6) ингибировали увеличение sAST и sALT в дозах 25-100 мг/кг перорально у мышей, получавших D-GalN/LPS, и предполагалось, что эти ингибирующие эффекты зависит от сниженной чувствительности гепатоцитов к ФНО-а. Подробные механизмы действияфенилэтаноидные гликозидыследует изучать дальше.

3. Экспериментальный

3.1. Общий

Для получения спектральных и физических данных использовались следующие приборы: удельные вращения, цифровой поляриметр Horiba SEPA-300 (l=5 см); УФ-спектры, спектрометр Shimadzu UV-1600; ИК-спектры, спектрометр Shimadzu FTIR-8100; Спектры ЯМР 1Н и 13С, спектрометры JEOLJNM-ECA600 (600 и 150 МГц) и JEOL JNM-ECS400 (400 и 100 МГц) с тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта; FABMS и FABMS высокого разрешения, масс-спектрометр JEOL JMS-SX 102A; Детектор ВЭЖХ, показатель преломления Shimadzu RID-10A, Shimadzu SPD-10A UV-vis и детектор оптического вращения Shodex OR-2. Колонки ВЭЖХ, колонки Cosmosil 5C18-MS-II и pNAP (Nacalai TesqueInc., 250, внутренний диаметр 4,6 мм) и (250 - 20 мм внутренний диаметр) использовали для аналитических и препаративных целей соответственно.

Для хроматографии использовали следующие экспериментальные условия: колоночная хроматография с нормальной фазой на силикагеле (CC), силикагель 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 меш, сферическая, нейтральная ); обращенно-фазовый силикагель CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) и Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 меш); нормально-фазовая ТСХ, предварительно покрытые силикагелем пластины ТСХ 60F254 (Merck, 0,25 мм); обращенно-фазовая ТСХ, предварительно покрытые пластины ТСХ силикагелем RP-18 F254S (Merck, 0,25 мм); ВЭТСХ с обращенной фазой, предварительно покрытые пластины для ТСХ силикагелем RP-18 WF254S (Merck, 0,25 мм), детектирование достигалось распылением 1% Ce(SO4)2–10% водного H2SO4 с последующим нагреванием .

3.2. Растительный материал

Свежие стеблиЦистанхе трубчатаявыращенные в Урумчи, провинция Синьцзян, Китай, были собраны в сентябре 2007 г. Растительный материал был идентифицирован одним из авторов (MY). Ваучер на растительный материал хранится в нашей лаборатории.

3.3. Извлечение и изоляция

Свежие стеблиЦистанхе трубчатая(2,98 кг) тонко нарезали и трижды экстрагировали метанолом с обратным холодильником в течение 3 часов. Выпаривание растворителя при пониженном давлении дает метанольный экстракт (249,1 г, 8,36%). Метанольный экстракт подвергали обработке Diaion HP 20 CC (5,0 кг, H2O?MeOH) с получением фракций, элюированных H2O и MeOH (167,84 г, 5,63% и 81,21 г, 2,73%). , соответственно). Элюированную MeOH фракцию (61,00 г) обрабатывали силикагелем с нормальной фазой CC [1,8 кг, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0,4?1{{48}). }:3:0.5~6:4:1, об./об./об.)?MeOH] с получением семи фракций [Fr. 1 (1,12 г), 2 (9,56 г), 3 (0,89 г), 4 (10,69 г), 5 (8,84 г), 6 (12,52 г) и 7 (4,60 г)]. Фракцию 2 (9,56 г) разделяли на обращенно-фазовом силикагеле СС [400 г, MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?ацетон] с получением пяти фракций [Fr. 2–1 (55,9 мг), 2–2 (4,48 г), 2–3 (3,42 г), 2–4 (1,16 г) и 2–5 (31,9 мг)]. Фракции 2–3 (1,00 г) подвергали ВЭЖХ [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1%-ный водный раствор AcOH (7:93, об/мин). v)] дать семь фракций [фр. 2–3–1 (66,5 мг), 2–3–2 (2{286}},4 мг), 2–3–3 (26,0 мг), 2–3–4 (136,6 мг), 2–3–5 (38{{300}},6 мг), 2–3–7 (84,9 мг)]. Фракция 2–3–4 (106,6 мг) была дополнительно очищена с помощью ВЭЖХ [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (5:95, об./об.)] с получением салидрозида (19, 13,7 мг, {{340}}.0{{409}}27 процентов ). Фракция 4 (1{439}},69 г) была разделена на обращенно-фазовом силикагеле СС [500 г, МеОН–Н2О (30:7 0, об./об.)?MeOH?ацетон] с получением четырех фракций [Fr. 4–1 (878,2 мг), 4–2 (7,06 г), 4–3 (1,57 г) и 4–4 (792,8 мг)]. Фракцию 4–2 (1,5{{560}} г) подвергали ВЭЖХ [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1%-ный водный раствор AcOH (2{{570 }}}:80, v/v)], чтобы получить пять дробей {Fr. 4–2–1 (42,9 мг), 4–2–2 [= камнеозид I (17, 67,0 мг, 0,014 процента)], 4–2– 3 [= актеозид (5, 1,21 г, 0,26 процента)], 4–2–4 (41,6 мг) и 4–2–5 (181,3 мг)}. Фракция 4–2–4 (41,6 мг) была дополнительно очищена с помощью ВЭЖХ [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (18:82, об./об.)] с получением изоактеозида (6, 19,1 мг, 0,0040%) и цис-актеозида. (7,3,4 мг, 0,0007%). Фракцию 4–3 (1,57 г) очищали с помощью ВЭЖХ [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% водный раствор AcOH (20:80, об./об.)] с получением 11 фракций [Fr. 4–3–1 (30,4 мг), 4–3–2 (55,2 мг), 4–3–3 (= 17, 22,1 мг, 0,0010 %), 4–3–4 (= 5 , 224,6 мг, 0,010 %), 4–3–5 (27,4 мг), 4–3–6 (43,6 мг), 4–3–7 (= 6, 825,0 мг, 0,037 %), 4–3 –8 [= сирингалид A 30-OaL-рамнопиранозид (16, 37,6 мг, 0,0017%)], 4–3–9 (39,8 мг), 4–3–10 [{{310} }ацетилактеозид (8, 85,4 мг, 0,0038 процента)] и 4–3–11 (64,6 мг)]. Фракция 4–3–6 (43,6 мг) дополнительно очищалась с помощью ВЭЖХ [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (18:82, об./об.)] с получением канканозидов H1 (1, 17,0 мг, 0,0008%). и Н2 (2,3,3 мг, 0,0001%). Фракция 4–3–9 (39,8 мг) была дополнительно очищена с помощью ВЭЖХ [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (18:82, об./об.)] с получением канканозида I (3, 15,4 мг, 0,0007%) и 6 ( 3,1 мг, 0,0001%. Фракцию 5 (8,84 г) разделяли на обращенно-фазовом силикагеле CC [400 г, MeOH–H2O (20:80-30:70, об./об.)?MeOH?ацетон] с получением семь дробей [фр. 5–1 (870,2 мг), 5–2 (478,9 мг), 5–3 (3,72 г), 5–4 (979,9 мг), 5–5 (1,19 г), 5–6 (1,27 г) и 5 –7(130,1 мг)]. Фракцию 5–1 (870,2 мг) очищали с помощью ВЭЖХ [CosmosilpNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (5:95, об./об.)] с получением декофеиллактеозида (9, 5,1 мг, 0,0002%) и цистанозида F ( 20, 8,1 мг, 0,0004%). Фракцию 5–3 (3,72 г) очищали с помощью ВЭЖХ [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1% водный раствор AcOH (15:85, об./об.)] с получением шести фракций [Fr. 5–3–1 (128,6 мг), 5–3–2 [= канканоза (21, 9,4 мг, 0,0004%)], 5–3–3 (64,6 мг), 5–3–4 (72,3 мг), 5–3–5 [= эхинакозид (4, 2,54 г, 0,11 процента) и 5–3–6 (318,5 мг)]. Фракция 5–3–4 (72,3 мг) дополнительно очищалась с помощью ВЭЖХ [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (10:90, об./об.)] с получением камнеозида II (18, 10,6 мг, 0,0005%). Фракцию 5–4 (979,9 мг) очищали с помощью ВЭЖХ [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% водный раствор AcOH (15:85, об./об.)] до фракций гиденина [Fr. 5–4–1 (28,6 мг), 5–4–2 (90,5 мг), 5–4–3 (99,7 мг), 5–4–4 (= 4, 25,7 мг, 0,0012%), 5 –4–5 (16,4 мг), 5–4–6 (318,5 мг), 5–4–7 (21,6 мг), 5–4–8 (= 5, 204,4 мг, 0,0091 процента) и 5– 4–9 (134,7 мг)]. Фракции 5–4–6 (318,5 мг) очищали с помощью ВЭЖХ [Cosmosil pNAP, CH3CN–1% водный раствор AcOH (15:85, объем/объем)] с получением цистантубулозидов B1 (11, 44,9 мг, 0,0020%), B2 (12 , 7,6 мг, 0,0003 процента) и А (15, 21,1 мг, 0,0009 процента) и видеманнинозид С (14, 17,2 мг, 0,0008 процента). Фракцию 5–5 (1,19 г) очищали с помощью ВЭЖХ [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% водный раствор AcOH (18:82, об./об.)] с получением тубулозида А (10, 300,3 мг, 0,013% ) и аренариозид (13,5,8 мг, 0,0006%). Фракцию 6 (12,52 г) разделяли на обращенно-фазовом силикагеле CC [600 г, MeOH–H2O (20:80–30:70, об./об.)?MeOH?ацетон] с получением четырех фракций [Fr. 6–1 (553,8 мг), 6–2 (10,69 г), 6–3 (1,40 г) и 6–4 (17,8 мг)]. Фракцию 6–2 (500,0 мг) очищали с помощью ВЭЖХ [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% водный раствор AcOH (25:75, об./об.)] с получением 4 (353,1 мг, 0,34% ).

3.3.1. Канканозид H1 (1)

Белый порошок, ½a- 24D-45,3 (c 1,06, MeOH). FABMS с положительными ионами высокого разрешения: рассчитано для C37H48O20Na (M плюс Na) плюс: 835,2637. Найдено: 835,2633. УФ [MeOH, нм (log e)]: 226 (4,33), 293 (ш, 4,36), 317 (4,52). ИК (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070, 1044 см-1. 1H ЯМР (600 МГц, CD3OD) d: приведен в таблице 2. 13CNMR (150 МГц, CD3OD) dC: приведен в таблице 3. FABMS с положительными ионами: m/z 835 (M плюс Na) плюс . FABMS с отрицательными ионами: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Канканозид

H2 (2) Белый порошок, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS с положительными ионами высокого разрешения: рассчитано для C37H48O20Na (M плюс Na) плюс: 835,2637. Найдено: 835.2644. УФ [MeOH, нм (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). ИК (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 см-1. 1H ЯМР (600 МГц, CD3OD) d: приведен в таблице 2. 13C ЯМР (150 МГц, CD3OD) dC: приведен в таблице 3. FABMS с положительными ионами: m/z 835 (M плюс Na) плюс FABMS с отрицательными ионами : м/з 811 (МН)-.

3.3.3. Канканосайд я (3)

Белый порошок, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS с положительными ионами высокого разрешения: рассчитано для C35H46O18Na (M плюс Na) плюс: 777,2581. Найдено: 777,2585. УФ [MeOH, нм (log e)]: 246 (3,97), 295 (ш, 4,04), 334 (4,23). ИК (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070, 1046 см-1. 1H ЯМР (600 МГц, CD3OD) d: приведен в таблице 2. 13CNMR (150 МГц, CD3OD) dC: приведен в таблице 3. FABMS с положительными ионами: m/z 777 (M плюс Na) плюс . FABMS с отрицательными ионами: m/z 753 (MH)-.

3.4. Щелочной и кислотный гидролиз 1–3

Растворы 1, 2 и 3 (каждый по 1,5 мг) в 5-процентном водном растворе гидроксида калия (КОН, 0,5 мл) перемешивали при 40 градусах в течение 1 часа. Каждый раствор нейтрализовали Dowex HCR W2 (форма H plus) и смолы удаляли фильтрованием. Выпаривание растворителя при пониженном давлении давало соответствующие деацилированные продукты, которые подвергали анализу ВЭЖХ [колонка: Cosmosil pNAP, 250 - 4,6 мм внутр. диаметра; подвижная фаза: CH3CN–1% водный раствор AcOH (15:85, об./об.); обнаружение: УФ (254 нм); скорость потока: 1,0 мл/мин], идентифицированная как транс-кофеиновая кислота (tR 9,9 мин от 3), транс-п-кумаровая кислота (tR 17,1 мин от 1) и цис-п-кумаровая кислота (tR17,8 мин из 2) соответственно. Затем каждую растворяли в 1,0 MHCl (1,0 мл) и нагревали при 80°C в течение 3 часов. После охлаждения реакционную смесь нейтрализовали амберлитом IRA-400 (форма ОН) и смолы удаляли фильтрованием. После удаления растворителя при пониженном давлении остаток разделяли на картриджной колонке Sep-Pak C18 (H2O?MeOH). Фракцию, элюированную водой, подвергали анализу ВЭЖХ в следующих условиях: колонка ВЭЖХ, Kaseisorb LC NH2-60-5, внутренний диаметр 4,6 мм - 250 мм (Tokyo Kasei Co., Ltd, Токио, Япония); обнаружение, оптическое вращение[Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Токио, Япония); подвижная фаза, CH3CN–H2O (85:15, об./об.); скорость потока 0,8 мл/мин]. Идентификацию L-рамнозы (i) и D-глюкозы (ii), высвобождаемых из 1, 2 или 3 во фракции, элюированной водой, проводили путем сравнения их времен удерживания и оптического вращения с таковыми для аутентичных образцов [i,tR 9,9 мин. (отрицательный)] и [ii, tR 17,9 мин (положительный)].

3.5. Биоанализ

3.5.1. Реагенты

LPS (из Salmonella enteritidis), минимальная основная среда (MEM) и среда William's E были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical (Сент-Луис, Миссури, США); эмбриональную бычью сыворотку (FBS) получали от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США); и другие химикаты были получены от Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Осака, Япония). 96-Микропланшеты с лунками были приобретены у Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Токио, Япония).

3.5.2. Животные

Самцов мышей ddY приобретали у Kiwa Laboratory Animal Co., Ltd (Вакаяма, Япония). Животных содержали при постоянной температуре 23 ± 2°C и кормили стандартным лабораторным кормом (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Токио, Япония). Все эксперименты проводились на мышах, находящихся в сознании, если не указано иное. Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по исследованию экспериментальных животных Университета Кинки.

3.5.3. Защитное действие на D-GalN/LPS-индуцированное повреждение печени у мышей

Метод, описанный Tiegs et al.51, был модифицирован и использован для этого эксперимента. Вкратце, самцы мышей ddY весом около 25–30 г перед экспериментом голодали в течение 20 ч. D-GalN (350 мг/кг) и LPS (10 мкг/кг), растворенные в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно, чтобы вызвать повреждение печени. Каждый тестируемый образец вводили перорально за 1 ч до инъекции D-GalN/LPS. Образцы крови собирали из подглазничного венозного сплетения через 10 ч после инъекции D-GalN/LPS. Уровни sAST и sALT определяли с использованием метода Рейтмана-Франкеля (коммерческий набор, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd). В качестве эталонного соединения использовали гидрокортизон. Исследуемые образцы суспендировали в 5-процентном растворе аравийской камеди, и раствор вводили перорально в дозе 10 мл/кг в каждом эксперименте, тогда как носитель вводили перорально в дозе 10 мл/кг в соответствующей контрольной группе.

3.5.4. Защитное действие на цитотоксичность, индуцированную D-GalN в первично культивируемых мышиных гепатоцитах

Гепатопротекторное действие компонентов определяли бромидом {{0}}(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ ) колориметрический анализ с использованием первично культивированных мышиных гепатоцитов.33–43 Гепатоциты выделяли из мышей maleddY (30–35 г) методом перфузии коллагеназой. Клеточную суспензию 4 - 104 клеток в 100 мкл среды William's E, содержащей FBS (10 процентов), пенициллин G (100 единиц/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), инокулировали в 96-луночный микропланшет и предварительно культивировали в течение 4 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2. В среду добавляли 100 мкл свежей среды, содержащей D-GalN (2 мМ) с тестируемым образцом или без него, и гепатоциты культивировали в течение 44 часов. Среду заменяли 100 мкл свежей среды и к среде добавляли 10 мкл МТТ [5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS)]. После 4 ч инкубации среду удаляли и добавляли 100 мкл изопропанола, содержащего 0,04 М HCl, для растворения образующегося в клетках формазана. Оптическую плотность (OD) раствора формазана измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов при 570 нм (эталонное значение: 655 нм). Ингибирование (в процентах) получали по следующей формуле.

Ингибирование (в процентах)= [(ОП(образец) - ОП(контроль))/(ОП(норма)-ОП(контроль))] x 100

3.5.5. Влияние на выработку NO в перитонеальных макрофагах мышей, стимулированных липополисахаридом.

Скрининговый тест на продукцию NO с использованием TGC-индуцированных перитонеальных макрофагов мышей проводили, как описано ранее.43,46,

3.5.6. Влияние на продукцию TNF-a в LPS-стимулированных мышиных перитонеальных макрофагах

TNF-α, высвобождаемый в среде, определяли, как описано ранее28, с небольшой модификацией. Вкратце, TGC-индуцированные мышиные перитонеальные макрофаги ({3}} клеток/лунку) собирали из брюшной полости самцов мышей ddY, суспендировали в 100 мкл RPMI 1640 с добавлением 5% FBS, пенициллина (100 единиц/лунку). мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) и предварительно культивировали в 96-луночных микропланшетах при 37°С в 5% СО2 на воздухе в течение 1 часа. Неадгезивные клетки удаляли промыванием PBS и добавляли 100 мкл свежей среды, содержащей различные концентрации тестируемого соединения. Через 10 мин добавляли 100 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл LPS, и инкубировали в течение 4 часов. Продукцию TNF-α в каждой лунке определяли с использованием набора ELISA (набор ELISA для мышиного TNF-α, Invitrogen). Каждое испытуемое соединение растворяли в ДМСО и раствор добавляли к среде (конечная концентрация ДМСО 0,5%).

3.5.7. Ингибирующее действие на TNF-α-индуцированную гибель клеток L929

Клетки L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Осака, Япония) поддерживали в минимальной незаменимой среде Игла (MEM, Sigma-Aldrich), содержащей 1% FBS, 1% заменимых аминокислот MEM (Invitrogen), пенициллин G (100 ед. /мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Клетки инокулировали в 96-луночный планшет для тканевых культур [3 -104 клеток/лунку в 100 мкл/лунку в MEM]. После 44 ч инкубации в среде TNF-a (20 нг/мл) с тестируемым образцом или без него жизнеспособность клеток оценивали с помощью колориметрического анализа МТТ (видео)49, 50. Каждое тестируемое соединение растворяли в ДМСО и раствор добавляли к среде (конечная концентрация в ДМСО 0,5%).

3.6. Статистика

Значения выражены в виде средних значений ± SEM. Для статистического анализа использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим критерием Даннета. Значения вероятности (p) менее 0,05 считались значимыми.

Благодарности

TM, KN и OM были поддержаны грантом на научные исследования от проекта «Центр высокотехнологичных исследований» для частных университетов: субсидия соответствующего фонда из гранта на научные исследования от Министерства образования, культуры , спорт, наука и технологии (MEXT) Японии, 2007–2011 гг., а также при поддержке гранта на научные исследования от MEXT. MY и HM были поддержаны 21-й программой COE, проектом Academic Frontier и грантом на научные исследования от MEX.

Откуда: ацилированныйфенилэтаноидолигогликозиды с гепатопротекторной активностью из пустынного растенияЦистанхе трубчатая' поТошио Морикава и др.

---Биоорганическая и медицинская химия 18 (2010) 1882–1890.