Достижения в дерматологии с использованием ДНК-аптамера «Аптамин С». Инновация: предотвращение окислительного стресса и максимизация эффекта витамина С за счет антиоксидантной защиты.

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Сухо Чой PhD1|Чонмин Хан, доктор философии. Кандидат2|Джи Хён Ким MS Candidate1|А-Ру Ким, доктор философии. Кандидат3|Санг-Хон Ким, доктор философии. Кандидат3|Weontae Lee Ph.D., профессор2|Moon-Young Yoon Ph.D., профессор3|Гююп Ким PhD1|Юн-Сон Ким Ph.D., профессор1

Абстрактный

Фон:Витамин C(также известная как L-аскорбиновая кислота) играет решающую роль в восстановлении активных форм кислорода (АФК) и регенерации клеток, защищая клетки от окислительного стресса. Хотя витамин С широко используется в косметических и терапевтических целях, имеются убедительные доказательства того, что витамин С легко подвергаетсяокислениевоздухом, pH, температурой и УФ-светом при хранении. Этот дефицит витамина С снижает его эффективность в качестве антиоксиданта и сокращает срок годности продуктов, содержащих витамин С в качестве ингредиента. Чтобы восполнить дефицит витамина С, мы разработали Aptamin C, инновационный ДНК-аптамер, максимизирующий антиоксидантную эффективность витамина C за счет связывания с восстановленной формой витамина C и задержки его высвобождения.окисление.

Методы:Связывание аптамина С с витамином С определяли с помощью анализа ITC. Эксперимент ITC был проведен с 0,2 ммоль/л.витамин Cкоторый вводили 25 раз аликвотами по 2 мкл в ячейку для образца объемом 1,8 мл, содержащую аптамин С в концентрации 0.02 ммоль/л. Данные были подогнаны под изотерму связывания с одним сайтом с использованием программы with origin для ITC v.5.0.

Полученные результаты:Для изучения действия аптамина С ивитамин Cкомплекса в коже человека, были проведены как in vitro, так и клинические испытания. Мы заметили, что комплекс аптамина С и витамина С был значительно эффективен в уменьшении морщин, отбеливающем эффекте и увеличении гидратации. В клинических испытаниях у испытуемых, получавших комплекс, наблюдалось резкое уменьшение раздражения кожи и зуда. Комплекс аптамина С не продемонстрировал побочных реакций в тесте.

Вывод:В совокупности эти результаты показали, что Aptamin C, инновационное новое соединение, потенциально может использоваться в качестве ключевого космецевтического ингредиента при ряде кожных заболеваний.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВАантиоксидант, аптамин С (аптамер, связывающий витамин С),окисление, окислительный стресс,витамин C(L-аскорбиновая кислота)

цистанхеобладают сильной способностью антиокисления

1|ВВЕДЕНИЕ

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой химически активные химические соединения, содержащие кислород, который играет важную роль в передаче сигналов клетками и гомеостазе.1-3 К ним относятся не только положительные эффекты, такие как индукция генов защиты хозяина и мобилизация систем транспорта ионов, но и также играет роль в апоптозе (запрограммированной гибели клеток).4,5Уровни АФК могут повышаться под воздействием стресса окружающей среды, что приводит к повреждению клеточных структур.3 Это явление называется «окислительным стрессом». Окислительный стресс является одной из основных причин различных заболеваний, включая нейродегенеративные заболевания, болезнь Лу Герига, аутизм, рассеянный склероз и кожные заболевания.6-15 Кроме того, окислительный стресс оказывает непосредственное влияние на процесс старения кожи16; белки, липиды и ДНК чутко реагируют на окислительный стресс, вызванный АФК.17 Антиоксиданты очень эффективны для защиты кожи, поскольку они реагируют непосредственно на АФК, предотвращая их достижение биологических молекул-мишеней.18,19 Антиоксиданты, такие каквитамин C, витамин Е, коэнзим Q10 и полифенольные соединения защищают кожу от повреждений, вызванных АФК. Таким образом, антиоксиданты помогают предотвращать и лечить различные кожные заболевания и замедляют процесс старения кожи.20 Использование витамина С в промышленности в первую очередь связано с его антиоксидантными свойствами, которые являются результатомвитамин Cспособность нейтрализовать свободные кислородные радикалы посредством процесса, называемого удалением радикалов.окисление. Чтобы решить эту проблему, мы разработали Aptamin C, аптамер ДНК, который специфически связывается с витамином C и ингибирует окисление витамина C. Аптамеры представляют собой одноцепочечные олигонуклеотиды на основе ДНК или РНК, способные избирательно связывать широкий спектр молекул. Аптамеры обычно идентифицируют с помощью метода селекции in vitro, называемого систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения или «SELEX». Мы установили, что аптамин С ингибируетокислениевитамина С от нескольких окислителей и сохраняет антиоксидантную активность при длительном хранении. Для подтверждения оценки безопасности аптамина С были проведены эксперименты на клеточном уровне и непосредственно применены к людям, при этом токсичности не наблюдалось. Кожные заболевания, такие как атопический дерматит, псориаз и акне, связаны с иммунным ответом и АФК.23Витамин Cобладает способностью удалять АФК и оказывает противовоспалительное действие.24 Аптамин С предотвращаетокислениевитамина С и максимизирует его эффективность за счет медленного высвобождения. Поэтому мы ожидаем, что комплекс аптамин С-витамин С проявит синергетический эффект.

2|МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Скрининг аптамера против витамина С с помощью восстановленного оксида графена

Этот метод был реализован путем модификации метода предыдущего исследования.25 Кандидаты одноцепочечной ДНК, которые могут специфически связываться свитамин Cбыли созданы из случайной библиотеки одноцепочечной ДНК, состоящей примерно из 1×1018 различных последовательностей. Для библиотеки одноцепочечной ДНК мы использовали заказную последовательность размером 60 мер, содержащую 30 случайно сгенерированных нуклеотидных последовательностей и праймерный сайт для амплификации (5'-ATGCGGATCCCGCGC-(N)30-GCGCGAAGCTTGGCGC-3'). Мы выполнили в общей сложности пять раундов, изменяя условия эксперимента, чтобы выбрать более конкретную последовательность. Общий объем для реакции составлял 200 мкл. Около 20 мкл 10-кратного буфера для связывания (10-кратный PBS с добавлением 10 ммоль/л MgCl2), 80 мкл rGO (5 мг/мл, разбавленный водой) и 200 пикомолей библиотеки одноцепочечной ДНК (20 мкл исходного раствора 100 мкмоль/л). ) добавляли и хранили dH2O до 200 мкл. Реакция продолжалась в течение 30 минут для связывания библиотеки оцДНК с rGO, а затем смесь центрифугировали при 20 000 g в течение 20 минут для удаления супернатанта. Осадок rGO промывали 1 раз 200 мкл буфера для связывания, который имеет ту же концентрацию, что и целевые условия связывания в каждом раунде. Для элюирования кандидатов 200 наномолейвитамин Cразбавленных в 200 мкл буфера для связывания, добавляли к осадку rGO, а этап элюирования выполняли в течение 1 часа. Элюированную оцДНК разделяли центрифугированием при 20 000g в течение 20 минут и амплифицировали. Мы провели осаждение EtOH для удаления примесей, за исключением одноцепочечной ДНК, перед амплификации. Мы провели асимметричную ПЦР для получения амплифицированной одноцепочечной ДНК. Отношение прямого праймера к обратному праймеру асимметричной ПЦР составляло 10:1. Мы провели электрофорез на 2,5-процентном агарозном геле, чтобы подтвердить продукт ПЦР несколькими микролитрами. Асимметричная ПЦР не может давать только одноцепочечную ДНК. Итак, мы использовали метод раздавливания и замачивания, чтобы изолировать кандидатов оцДНК. Для этого метода мы провели электрофорез на 12-процентном нативном геле полиакриламида и окрасили гель бромистым этидием (EtBr). Для разделения двухцепочечной ДНК (дцДНК) и одноцепочечной ДНК часть геля, окрашенную одноцепочечной ДНК, вырезали, измельчали ​​и экстрагировали одноцепочечной ДНК буфером для измельчения и замачивания (500 ммоль/л NH4OAc, 0,1% SDS, 0,1 ммоль/л ЭДТА). с ночевкой. Измельченный гель отделяли центрифугированием. Супернатант, содержащий одноцепочечную ДНК, концентрируют и очищают путем преципитации EtOH. Высушенную одноцепочечную ДНК собирали со стерилизованной dH2O и использовали для следующего раунда в качестве библиотеки.

натуральные ингридиентыЦистанче Амазонка

2.2|Эксперимент изотермической титрационной калориметрии (ITC)

Эксперимент по изотермической титрационной калориметрии проводили с использованием системы VP-ITC (MicroCal Inc Northampton) при 25 градусах в фосфатно-солевом буфере, состоящем из 1 ммоль/л хлорида магния (pH 7,4). Перед каждым экспериментом по титрованию аптамин С 2 мл ивитамин CОбразцы объемом 600 мкл дегазировали в течение 30 минут в вакууме, без перемешивания, при температуре на несколько градусов ниже температуры эксперимента. Мы подготовили 0,2 ммоль/л витамина С, который вводили 25 раз аликвотами по 2 мкл в ячейку для образцов объемом 1,8 мл, содержащую аптамин С в концентрации 0,02 ммоль/л. Данные были приспособлены к изотерме связывания с одним сайтом с использованием программы с исходным кодом для ITC v.5.0 (MicroCal Inc).

2.3|Флуоресцентные микропланшетные анализы окисления витамина С

Окислениеизвитамин Cбыл измерен путем обнаружения окисленного продукта дегидроаскорбата (DHA) с использованием модифицированной версии метода, описанного Vislisel et al. 7 В этом методе DHA обнаруживается путем реакции с о-фенилендиамином (OPDA) с образованием продукта флуоресцентной конденсации 3-( дигидроксиэтил)фуро[3,4-b]хиноксалин-1-он. Анализ проводили следующим образом в черных 384-луночных планшетах (Greiner Bio-One). Аптамеры сначала растворяли в фосфатно-солевом буфере, рН 7,2, содержащем 1 мМ MgCl2, в концентрации 200 мкмоль/л, затем складывали путем нагревания до 95 градусов и медленно охлаждали до комнатной температуры в течение 15 минут. Затем свернутые аптамеры разводили 1:1 (об:об) в свежеприготовленном растворе с концентрацией 5 ммоль/л.витамин Cв буфере для анализа [50 ммоль/л ацетата натрия, 1 процент (масса/объем) BSA, 0,05 процента (объем/объем) Tween 20, 1 мМ MgCl2 (Sigma, все компоненты), доведенный до pH 5,5], и смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы позволить аптамерам связать перед добавлением окислителя. Затем к растворам витамина С/аптамера добавляли окислители в концентрациях (EM)H2O2 (Sigma). Окислители были предварительно разбавлены до рабочих концентраций в буфере для анализа. Затем образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут перед добавлением OPDA (Sigma) в концентрации 5,5 ммоль/л в буфере для анализа. Сразу после добавления OPDA определяли флуоресценцию образцов при 425 нм с использованием планшет-ридера SpectraMax® i3X (Molecular Devices) с возбуждением при 345 нм в течение 45 минут с измерениями каждые 60 секунд. Все образцы и сосуды с реагентами были завернуты в фольгу для защиты от света во время всех инкубаций, проводимых для флуоресцентных анализов.

2.4|Измерение снижения содержания витамина С с использованием DCPIP (2,6-дихлорфенолиндофенола)

Для определения снижениявитамин C, мы провели эксперименты с использованием реакции DCPIP. Витамин С реагирует с DCPIP, изменяя цвет с синего на бесцветный. Подготовленный витамин С обрабатывали 5-процентным раствором Aptamin CTM, а необработанный витамин С инкубировали при комнатной температуре в течение 8 недель. Образец измеряли через 2, 4 и 8 недель. В коническую колбу с помощью пипетки добавляли около 2 мл DCPIP и добавляли первый необработанный витамин С до тех пор, пока раствор не становился бесцветным. Количествовитамин Cдобавленных образцов измеряли и повторяли с другими образцами. По этим данным рассчитывали степень восстановления каждого образца.

2,5|Исследование in vitro действия дермальных фибробластов человека против морщин

Для оценки жизнеспособности клеток в дермальных фибробластах человека клетки обрабатывали различными конечными концентрациями аптамина С свитамин C(аптамин С мкг плюс витамин С мкг/мл) {{0}}.01 плюс 0,5 мкг/мл, 0,1 плюс 5 мкг/мл, 0,5 плюс 25 мкг /мл, 1 плюс 50 мкг/мл и 2 плюс 100 мкг/мл. Затем клетки обрабатывали концентрациями аптамина С с витамином С для обнаружения внутриклеточного коллагена, внутриклеточной коллагеназы (ММП-1) и активности эластазы.

Дермальные фибробласты человека (HDF) были отобраны на основе «Руководства по оценке эффективности функциональной косметики (II)» MFDS. HDF культивировали в смеси DMEM/F12 3:1 с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10 процентами FBS и 1 процентом антибиотика-антимикотика, во влажной атмосфере с 5 процентами CO2 при 37°C.

HDF (5 × 104 клеток/лунку) высевали в 24-луночные планшеты, инкубировали в течение 24 часов и обрабатывали различными концентрациями аптамина С свитамин Cи инкубировали в течение 24 часов. Через 24 часа собирали надосадочную жидкость и измеряли количество высвобожденного в среду проколлагена при 450 нм с использованием набора ELISA Procollagen Type IC-Peptide (PIP). Степень выработки коллагена калибровали по общему содержанию белка и сравнивали с TGF-1 в качестве положительного контроля. Среду без тестируемых материалов использовали в качестве контроля растворителя.

HDF (5 × 104 клеток/лунку) высевали в 24-луночные планшеты, инкубировали в течение 24 часов и обрабатывали различными концентрациями аптамина С свитамин Cи инкубировали 48 часов. Через 48 часов активность коллагеназы измеряли при 450 нм с использованием набора MMP-1 Human ELISA. Активность MMP-1 оценивали по общему содержанию белка и сравнивали с TGF-1 в качестве положительного контроля. Среду без тестируемых материалов использовали в качестве контроля растворителя.

Все данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение и получены из 3 независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с помощью t-теста для независимых выборок с использованием программного обеспечения SPSS® (IBM) при уровне значимости P <>

2,6|Измерение морщин кожи с помощью системы анализа 3D-изображений

В этом исследовании приняли участие 22 женщины (средний возраст: 50,05 ± 2,94 года). Морщины кожи в области гусиных лапок оценивали с помощью системы анализа трехмерных изображений на исходном уровне, через 4 и 8 недель. Увлажнение кожи оценивали емкостным методом, ТЭПВ методом поверхностной диффузии воды и эластичность кожи методом всасывания оценивали исходно, через 2, 4 и 8 недель после лечения. Кроме того, через 2, 4 и 8 недель испытуемые заполняли анкеты, касающиеся эффективности, а через 8 недель после лечения испытуемые заполняли анкеты по удобству использования. Все полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью программного обеспечения SPSS®. Параметры морщин «гусиных лапок» оценивали с помощью PRIMOS® Premium (GFMesstechnik GmbH). Эта система позволяла проводить количественный анализ шероховатости, глубины, площади и объема выступающих на коже морщин. Изображение было проанализировано в той же области с точки зрения параметров морщин кожи (1, средняя глубина морщин; 2, средняя глубина самой большой морщины; 3, максимальная глубина самой большой морщины; 4, общая площадь морщин; 5, общий объем морщин; 6). , общий фактор формы морщин; 7, общая длина морщин; 8, Ra; 9, Ry и 10, Rz) в начале исследования, через 4 и 8 недель после лечения Primos 5.8 E ver. Программного обеспечения.

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|Для успешного выполнения rGO-SELEX с нестабильной мишенью требовался строгий подход к подготовке буфера.

Библиотека одноцепочечной ДНК, которая была связана с rGO посредством π-π-стекинговых взаимодействий между ароматическими кольцами поверхности графена и основаниями ДНК 26,27 и несвязанной одноцепочечной ДНК на rGO, была отделена и удалена центрифугированием. оцДНК, адсорбированные на поверхности rGO, элюировали обработкой целевым соединением. Согласно литературным данным, конформация аптамера изменяется после связывания с мишенью и за счет ослабления π-π-стекинговых взаимодействий с rGO. 28-31 Этот процесс повторялся в течение пяти раундов. Каждый последующий раунд проходил с более жесткими буферными условиями и более коротким временем элюирования. Эта производительность позволила нам поддерживать одноцепочечную ДНК с большей специфичностью к целевым соединениям.

Данные NGS обогащенной библиотеки, созданной с помощью процесса rGO-SELEX, дали 404071 последовательность. Мы выбрали 119 последовательностей из этих данных, отсортировали их в 11 групп на основе сходства структуры и выбрали репрезентативные последовательности для кандидатов в аптамеры (рис. 1А).

3.2|Выбор аптамина С

Вторичные структуры кандидатов на аптамин С были предсказаны с помощью бесплатного программного обеспечения M-Fold.32,33 Кандидаты были сгруппированы по их положению, длине, форме и количеству ствола и петли в самой потенциальной структуре (рис. 1В). ДГК, оксидвитамин C, определяется его реакцией с о-фенилендиамином (OPDA), который играет роль индикатора.34 Если аптамер связывается и предотвращает егоокисление, к витамину С и предотвращает его окисление, сигнал флуоресценции от 3-(дигидроксиэтил)-фуро-[3,4-b]хиноксалин-1-она, продукта конденсации витамина С и OPDA, будет ниже, чем у отсутствие аптамерного контроля. График каждого аптамера-кандидата, смешанного с витамином С и окислителем, с положительным контролем,витамин Cплюс последовательности окислителя и скремблирования, смешанные с витамином С и окислителем (рис. 1С). Было показано, что пять аптамеров, Aptamin Cb, Cc, Cf, Cg и Ck, обладают антиоксидантным действием.

3.3|Ингибирование окисления витамина С аптамином С

Аптамин С обладает высокой аффинностью связывания свитамин C. Связывание аптамина С с витамином С определяли с помощью анализа ITC. Из изотермы связывания можно получить энтальпию (ΔH), энтропию (ΔS) и стехиометрию (n) реакции связывания. Экзотермическое связывание аптамина Cb было обнаружено из измерения ITC, и энтальпия (ΔH) была рассчитана как 302,5 ± 3,788, энтропия (ΔS) была рассчитана как 18,9, стехиометрия (n) была рассчитана как 56,7 ± {{21 }}.426, а константы диссоциации (Kd) были рассчитаны как 2,13 мкМ для витамина С. Экзотермическое связывание аптамина Cf было обнаружено из измерения ITC, а энтальпия (ΔH) была рассчитана как 279,2 ± 2,992, энтропия (ΔS) была рассчитана как как 18,4, стехиометрия (n) была рассчитана как 167 ± 1,15, а константы диссоциации (Kd) были рассчитаны как 0,89 мкм для витамина С. Экзотермическое связывание аптамина Ck было обнаружено из измерения ITC, а энтальпия (ΔH ) был рассчитан как 250,4 ± 3,742, энтропия (ΔS) была рассчитана как 19,8, стехиометрия (n) была рассчитана как 82,2 ± 0,732, а константы диссоциации (Kd) были рассчитаны как 0,90 мкмоль/л для витамин С (рис. 2А). Измерения ITC показывают, что изменение энтропии при взаимодействии с аптамином С является основной движущей силой длявитамин C. Предотвращатьокислениевитамина С в жидком состоянии, все растворы готовили на деионизированной воде, обработанной азотом. Флуоресценция была выражена и количественно проанализирована, когда OPDA (о-фенилендиамин) связывался с DHA, генерируемымокислениевитамина С. Степень окисления витамина С по концентрации аптамина С (125, 250, 500 и 1000 нмоль/л) сравнивали и подтверждали анализом OPDA. Результаты продемонстрировали, чтовитамин Cпревращение в дегидроаскорбиновую кислоту происходило медленнее, когда концентрация аптамина С была выше. (Рисунок 2Б). Эти данные доказывают, что аптамин С является дозозависимым ингибитором окисления витамина С.

Мы провели эксперименты, чтобы определить, может ли Aptamin C предотвратитьокислениевитамина С в течение длительного периода времени. Совместное лечение аптамином Свитамин Cи необработанный витамин С подвергали воздействию света и оставляли при комнатной температуре на 8 недель. В результате, когда необработанный витамин С оставался в покое, степень восстановления снижалась менее чем наполовину через 2 недели, а почти все они окислялись через 4 недели. В присутствии аптамина С содержание витамина С снижалось примерно вдвое по сравнению с 8 неделями (рис. 2С). Это говорит о том, что аптамин С предотвращает окисление витамина С в течение длительного периода времени.

бодибилдинг

3.4|Анализ активности внутриклеточной коллагеназы (ММП-1) и коллагена

При анализе активности коллагеназы продукция матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) значительно снижалась дозозависимым образом, на 7,06%, 9,29% и 31,81% при концентрациях {{1{ {12}}}}.01 плюс 0,5 мкг/мл, 0,1 плюс 5 мкг/мл и 0,5 плюс 25 мкг/мл мл соответственно (рис. 3А). При анализе синтеза коллагена содержание карбоксиконцевого пептида проколлагена типа Ι (PIP) было значительно увеличено в зависимости от дозы, с увеличением на 25,{{20}} процентов при 0,01 плюс 0,5 мкг/мл. , 41,99 процента при 0,1 плюс 5 мкг/мл и 71,18 процента при 0,5 плюс 25 мкг/мл (фиг. 3B).

3,5|Клиническое исследование влияния уменьшения морщин на кожу человека

Статистический анализ параметров морщин был выполнен с помощью системы анализа 3D-изображений, чтобы оценить эффекты уменьшения морщин на коже тестируемого продукта на коже человека. По сравнению с контрольной группой параметр «Средняя глубина морщин» уменьшился на 4,77% через 4 недели и на 4,25% через 8 недель, параметр «Средняя глубина самой большой морщины» уменьшился на 3,37% через 4 недели и 4,53% через 8 недель. Параметр «Максимальная глубина самой большой морщины» уменьшился на 4,36% через 4 недели и 7,19% через 8 недель, параметр «Общая длина морщин» уменьшился на 1,61% через 4 недели и 2,67% через 8 недель, параметр «Ra» уменьшился на 4,22%. через 4 недели и на 3,90% через 8 недель, показатель «Ry» снизился на 2,66% через 4 недели и на 7,11% через 8 недель, параметр «Rz» уменьшился на 3,69% через 4 недели и на 6,22% через 8 недель, декремент составил 3,69. процентов -7,11 процента (рис. 4).

4|ВЫВОД

Витамин Cпредставляет собой коммерчески важную, но нестабильную молекулу, поэтому повышение ее стабильности представляет интерес для различных секторов рынка. Наша работа показывает, что аптамин С, ДНК-аптамеры, потенциально продлевает срок годности и повышает эффективность таких продуктов, задерживаявитамин C окислениев растворе. Мы продемонстрировали клиническую эффективность комплекса Aptamin C в разглаживании морщин и увлажнении кожи. Комплекс Aptamin C также может помочь облегчить раздражение кожи.

улучшить отбеливание кожи