Успехи в молекулярной идентификации цистанхе

Абстрактный:ЦистанхиHerba, редкий и ценный лекарственный материал в Китае, имеет высокую лечебную и экологическую ценность. По мере развития методов молекулярной биологии различные методы молекулярной идентификации на основе ДНК постепенно совершенствовались, и был достигнут значительный прогресс в исследованияхЦистанхиХерба. В этой статье рассматриваются методы молекулярной идентификации на основе ДНК дляЦистанхеи обсуждаются ограничения и перспективы применения, которые, как ожидается, послужат ориентиром для точной идентификации и оценки качества Cistanches Herba, защиты и рационального использования ресурсов, а также разнообразия селекции.

Ключевые слова:Цистанхе; молекулярная идентификация; метод молекулярных маркеров; идентификация и качество; сохранение ресурсов

Нажмите здесь, чтобы узнать больше о компонентах Cistanche

Цистанхе представляет собой сухой мясистый стебель с чешуйчатыми листьями Cistanche Deserticola YC Ma иЦистанхе трубчатая(Schenk) Wight, растение родаЦистанхев семье Цистанхе. Jiangyun, Cunyun, Cistanche и Chagangaoya (монгольский язык) известны как «пустынный женьшень» [2]. В последние годы, поскольку ресурсы дикой цистанхе находятся на грани истощения, а внутренний спрос растет день ото дня, большое количество контрафактной продукции цистанхе попало на рынок китайских растительных лекарственных средств, что вызвало огромные колебания рыночных цен. , а качество лекарственных материалов не может быть гарантировано, что серьезно угрожает безопасности клинических препаратов. пол [3]. Таким образом, сохранение, исследование и рациональное развитие и использование ресурсов зародышевой плазмы растений цистанхе являются неизбежными, и точная идентификация ресурсов зародышевой плазмы растений цистанхе особенно важна.

как важно. В издании «Фармакопеи Китайской Народной Республики» 2020 года (далее именуемой «Китайская фармакопея») записано только то, что высушенные чешуйчатые мясистые стебли Cistanche Deserticola используются в качестве настоящих лекарств. С точки зрения ситуации, помимо растений Cistanche и Cistanche tubehua, зарегистрированных в издании «Китайской фармакопеи» 2020 г., существуют также Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Ланьчжоу. Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang и др. [4], существует также большое количество поддельных явлений допинга. Благодаря развитию и постоянному совершенствованию технологии молекулярной биологии технология молекулярной идентификации имеет преимущества меньшего потребления образцов, высокой скорости и высокой точности и широко используется для идентификации видов животных и растений. Развитие исследований в области добычи полезных ископаемых также происходит относительно быстро [5]. В настоящее время достигнут некоторый прогресс в идентификации лекарственных материалов Цистанхе с помощью технологии молекулярной идентификации. В соответствии с классификацией технологии молекулярных маркеров, необходимой для молекулярной идентификации [6], в этой статье рассматривается идентификация гермоплазмы Cistanche Deserticola и другие аспекты, а также обсуждается существование идентификации гермоплазмы Cistanche Deserticola. Проанализируйте проблемы и предложите соответствующие решения, стремясь предоставить рекомендации по охране, рациональному использованию и выращиванию новых сортов растений цистанхе.

1 Применение технологии ДНК-штрихкодирования для идентификации растений цистанхе

1.1 Технология ДНК-штрихкодирования

В 2003 году профессор Пол Хеберт из Университета Гвельфа в Канаде ввел технологию штрих-кода в биологический мир и впервые предложил концепцию «ДНК-штрих-код» [7]. Технология ДНК-штрих-кодирования является эффективным методом идентификации традиционной китайской медицины и разнообразного сырья. Для соответствующей ДНК фрагменты-кандидаты амплифицировали с помощью общей полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, продукты амплификации ПЦР очищали, секвенировали и анализировали, искали целевую последовательность штрих-кода ДНК и конструировали систему распознавания штрих-кода ДНК [8]. ]. В заключение, идентификация ДНК-штрих-кода является методом биомолекулярной идентификации, который использует один или несколько относительно коротких стандартных фрагментов ДНК для идентификации видов [9].

В последние годы благодаря сочетанию технологии высокопроизводительного секвенирования и технологии идентификации штрих-кодов ДНК была разработана новая технология, которая может одновременно обнаруживать последовательности штрих-кодов нескольких видов в смешанных образцах — меташтрих-код ДНК, основной принцип которого заключается в применении высокопроизводительного секвенирования. Технология позволяет получить амплифицированную последовательность смешанного штрих-кода и определить видовой состав в смешанном образце с помощью биоинформатического анализа[10].

1.2 Выбор последовательностей штрих-кода ДНК

Последовательности штрих-кода, которые можно использовать в технологии штрих-кодирования ДНК, включают ДНК митохондриального кофермента Ⅰ (CO Ⅰ), 12S рРНК, последовательности 16S рРНК и рибосомную 18S рДНК для идентификации видов животных [11]; рибосомная 16S рДНК для идентификации бактерий [12], специфические для гена фрагменты рибосомного внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) и последовательности CO I для идентификации грибов [13]; из-за медленной скорости эволюции митохондриальных геномов у растений фрагменты штрих-кода в основном выбираются на геноме хлоропластов. Предлагаемые фрагменты генов в основном включают rpoB, rpoC1, matK, rbcL и UPA, а фрагменты некодирующей области включают atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI и

Нуклеированный ген ITS[14]. В 2006 году исследовательская группа Чена Шилиня проверила способность ITS2 к различению более чем на 6600 образцах растений и обнаружила, что эффективность идентификации ITS2 на уровне видов достигает 92,7%, что указывает на то, что последовательность ITS2 может идентифицировать стандартные штрих-коды ДНК растений. лекарственные растения и близкородственные виды. ITS2 использовался в качестве нового типа универсального ДНК-штрих-кода для лекарственных растений [15] и был признан международными экспертами [16].

В 2013 году Национальный комитет по фармакопее обсудил и одобрил включение руководства по молекулярной идентификации штрих-кодов ДНК для китайских лекарственных материалов в дополнительное издание «Китайской фармакопеи». ITS2 — это основная система идентификации штрих-кодов ДНК для растительных лекарственных материалов [17].

В настоящее время многие ученые провели исследования молекулярной идентификации растений цистанхе. Согласно исследованию Chen Shilin et al. [18], ITS2 подходит в качестве стандартной последовательности штрих-кода для идентификации лекарственных растений. Sun Zhiying et al [19] обнаружили, что последовательность ITS2 может быть использована в качестве основы для эффективной идентификации китайского растительного лекарственного средства Cistanche Deserticola и его поддельных продуктов в штрих-кодах ДНК. Wang Xiaoyue et al [20] использовали штрих-коды ITS2 для идентификации 4 распространенных запутанных продуктов Cynomorium, Cistanche, Liedang и Cistanche и успешно установили «молекулярную идентификационную карту» запутанных продуктов Cistanche. Метод идентификации лекарственных растений с помощью последовательностей ITS2 является относительно зрелым и имеет преимущества в скорости, точности и эффективности. Поэтому использование последовательности ITS2 для идентификации растений цистанхе стало наиболее часто используемым методом.

1.3 Рабочий процесс штрих-кодирования ДНК

Рабочий процесс штрих-кодирования ДНК похож на операцию молекулярно-филогенетического исследования, и основные этапы показаны на рисунке 1. Gu Xiuyan [21] получил базовую последовательность ITS и проанализировал различия между видами и обнаружил, что Cistanche тесно связан к Cistanche солевому раствору, и Cistanche в Ланьчжоу тесно связан с Cistanche, что также обеспечивает основу для разработки новых лекарственных источников Cistanche. основа. Li Zhenhua et al [22] провели исследование молекулярной идентификации ДНК Cynomorium, Cistanche и Huanghua Liedang и осуществили быструю и точную идентификацию Cistanche и поддельных Cynomorium, Cistanche и Huanghualiedang с помощью сайт-специфической ПЦР.

Короче говоря, уже существует относительно завершенный процесс идентификации видов растений с использованием штрих-кодов ДНК. Идентификация растений цистанхе путем анализа последовательностей ДНК и создания соответствующей базы данных может обеспечить дополнительную основу для идентификации и классификации растений цистанхе в будущем.

1.4 Анализ данных ДНК-штрихкодирования

Обработка и анализ полученных данных является очень важной задачей[18]. После завершения секвенирования выполняется сравнение последовательностей и ручная коррекция для удаления некачественных последовательностей и участков праймеров. Обычно используемое программное обеспечение включает Chromas, CExpress[23] и т. д.; Генетический анализ расстояний конечной последовательности обычно выполняется с помощью программного обеспечения MEGA [24] для анализа генетического расстояния между образцами разных видов растений, а модель K2P [25-26] используется для расчета внутривидового расстояния между видами. ; затем постройте дерево филогении с присоединением к соседям (NJ), используя онлайн-сайт iTol [27] для улучшения и украшения дерева развития (https://itol.embl.de/), и проверьте уровень поддержки каждой ветви в соответствии с бутстрап (1000 повторений).

Метод BLAST представляет собой поисковый алгоритм, основанный на BLAST. Необходимо создать или загрузить базу данных эталонных последовательностей для идентификации видов в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) для последующего анализа фрагментов генов и работы по идентификации видов [28]. Сюй Даньюн и др. [29] использовали 3 пары универсальных праймеров штрих-кода ДНК для идентификации 22 видов растений Lauraceae и успешно идентифицировали 20 видов растений. Адольфо и др. [30] успешно идентифицировали 3 вида растений Pueraria, используя штрих-коды ITS2 и matK. Приведенные выше исследования демонстрируют, что путем получения и анализа последовательностей ДНК лекарственных растений можно быстро и эффективно идентифицировать виды растений.

2 Применение других методов молекулярных маркеров для идентификации растений цистанхе

Для организмов их признаки выше молекулярного уровня в конечном итоге определяются молекулярными признаками. По сравнению с морфологическим анализом [31] и хромосомным анализом [32] молекулярные маркеры могут раскрыть истинное лицо биологического генетического разнообразия. Sarwat et al [33] использовали полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP), технологию селективно амплифицированного полиморфного микросателлитного локуса (SAMPL), простую амплификацию повторов между последовательностями (ISSR), случайную амплификацию полиморфной ДНК (RAPD) и другие методы молекулярных маркеров, обнаруживающие генетическое разнообразие. образцов Tribulus terrestris, собранных в разных местах Индии, и результаты показали, что эти четыре метода молекулярных маркеров могут получить разные ДНК-отпечатки пальцев, уникальные для каждого географического региона. Международный союз защиты прав на сорта растений (УПОВ) также использует идентификацию молекулярных маркеров ДНК в качестве вспомогательного средства для тестирования сортов сельскохозяйственных культур на ООС (однородность отличимости и стабильность) [34]. В настоящее время технологии молекулярных маркеров, такие как AFLP, RAPD и ISSR, являются относительно зрелыми и широко используются для идентификации растений цистанхе (таблица 1).

Поддерживать:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950