Благоприятное/неблагоприятное влияние кверцетина на мембраны клеток нейробластомы SK-N-SH Часть 2

Пожалуйста, нажмитеoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

2.2.2. Антиоксидантная активность кверцетина

Чтобы проверить эффективность кверцетина в защите мембран от окислительного стресса, были проведены эксперименты, в которых липидные модели мембран подвергались воздействию озона в отсутствие (рис. 4а) и в присутствии кверцетина в концентрации 6,25 мкМ (рис. 4b).

Под действием озона изменяется ход обеих зависимостей, т. е. π{{0}}f(A) и Cs-1=f(rn). Изотермы, полученные для монослойного растекания по озонсодержащей субфазе, характеризовались меньшим наклоном и сдвигом в сторону меньших значений А. Кроме того, значения Cs-1 уменьшались под влиянием озона. Эти изменения были наибольшими при концентрации озона около 0,4 ppm.синтаншДальнейшее увеличение концентрации озона не приводило к изменению характеристик монослоя (вставка к рис. 4а).

Рис. 4. Изотермы поверхностного давления и соответствующий модуль сжимаемости (врезка) липидной модели слоев нейробластомы, нанесенных на субфазу, содержащую указанные концентрации озона, растворенного в буфере. Изотермы: (а) в отсутствие антиоксидантов; (б) в присутствии кверцетина (6,25 мкМ), добавленного к озонсодержащему буферу.

При введении в субфазу кверцетина в концентрации 6,25 мкМ озон не оказывал существенного влияния на ход изотермы r(A), т.е. однако значения модуля сжатия изменялись в присутствии озона так же, как и в случае отсутствия кверцетина (вставка к рис. 4б).

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Численные значения параметров, характеризующих монослои, определенные по полученным изотермам, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Поверхностные параметры монослоев Алим и Cs-I, рассчитанные для монослоев модели распространения мембраны нейробластомы на субфазе, содержащей указанные концентрации озона, растворенного в буфере в отсутствие и в присутствии кверцетина (6,25 мкМ). Данные представляют собой среднее из трех экспериментов ± стандартное отклонение. Разные буквы указывают на существенные различия (р меньше или равно 0,05).

В присутствии озона наблюдается небольшое уменьшение площади поверхности на молекулу (Alim) в плотно упакованном монослое. Максимальное снижение этого показателя составляет 3,2% по сравнению с контролем (монослой на чистом буфере). Параметр Cs-I также снижается, достигая значений плато при концентрациях озона выше 0,6 ppm O. Максимальное снижение этого параметра достигает 24 процентов по отношению к контролю.

Когда в субфазе присутствует кверцетин в концентрации 6,25 мкМ, значения Alim (1-2 процентов) немного снижаются, в то время как уменьшение значения Cs-1 составляет около 27 процентов.

Характер алимных изменений в присутствии озона и озона в сочетании с кверцетином имеет различное течение. При концентрации озона около 0,3 частей на миллион в отсутствие кверцетина Aim резко снижается примерно до 88,3 A2. Затем он достигает минимального значения плато, придавая характерную S-образную зависимость (рис. 5а, красные точки). В присутствии кверцетина наблюдается небольшое плавное монотонное снижение Alim, достигающее при более высокой концентрации озона плато около 93,5 А2 (рис. 5а, зеленые точки).

Рис. 5. Зависимость площади, приходящейся на молекулу, от концентрации озона (а) и зависимости модуля сжатия от концентрации озона (б) для мембраны нейробластомы на субфазе: без кверцетин-красных точек; с кверцетиново-зелеными точками. Линии не представляют собой никакой физической модели, были математически подогнаны и нарисованы для удобства отслеживания изменений параметров. Значения максимального модуля сжатия слоя изменяются одинаково с концентрацией озона как в отсутствие, так и в присутствии кверцетина (рис. 5б).

3. Обсуждение

Механизм действия кверцетина интенсивно изучается в течение многих лет, однако результаты опытов часто противоречивы и свидетельствуют о том, что в одних условиях это соединение полезно, а в других неблагоприятно для клеток. Анализ имеющихся исследований показывает, что действие этого соединения на клетки связано с двумя аспектами: его взаимодействием с мембранами и антиоксидантной активностью. Однако в клетках невозможно различить эти два режима действия кверцетина и оценить пригодность этого соединения в качестве потенциального вещества, например, обладающего противоопухолевой активностью. По этой причине эксперименты были спланированы таким образом, чтобы качественно и количественно оценить влияние этого соединения на механические свойства мембран, а также его антиоксидантную активность в модельной системе, что исключает влияние активность других метаболических путей.

На основании проведенных экспериментов было подтверждено, что даже в самых низких концентрациях (6,25 мкМ) кверцетин модифицирует (на что указывает увеличение Алимвеличины) модельные монослои, имитируя липидную часть мембраны клеток нейробластомы. Это указывает на возможность взаимодействия кверцетина с мембранами этих клеток при попадании в головной мозг даже в низких концентрациях. Это особенно важно для нервных клеток, мембраны которых содержат относительно большое количество липидов.

Цистанхе может улучшить иммунитет

Примерное липидно-белковое соотношение для нервных клеток составляет 80:20%, а, например, для мембраны эритроцитов это соотношение составляет 50:50% [29]. Такой уровень липидов в мембранах нервных клеток связан с ролью этих клеток в передаче электрических сигналов. В то же время даже малозаметные изменения физико-химических свойств, таких как гибкость и жесткость клеточной мембраны, могут существенно нарушать эту функцию.

Потенциал действия переносится по мембране нервной клетки благодаря работе ионных каналов, а затем, благодаря действию ионных насосов, восстанавливается потенциал покоя. Надлежащее функционирование этих белков (в частности, определяемое их формой) тесно зависит от липидного окружения. Кроме того, изменение механических свойств мембраны может нарушать работу каналов, запорный механизм которых зависит именно от механических свойств мембраны.

Эти тезисы подтверждаются исследованиями, показавшими, что действие кверцетина на клеточную мембрану связано, в частности, с транспортом ионов Са2+ и/или метаболизмом Са2++ [30,31]. Таким образом, введение молекул кверцетина в среду мембран (особенно нервных клеток) может иметь существенные последствия для их функционирования.

Чтобы проверить, играет ли действие кверцетина, определенное в модельных системах, полезную или неблагоприятную роль в клетках, результаты, полученные для модельных мембран, сравнивали с действием этого соединения на целых клетках нейробластомы. Для клеток SK-N-SH был проведен тест МТТ,Экстракт цистанхе против болезни Альцгеймерадавая информацию о клеточной жизнеспособности клеток, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна ферментам митохондриальной дегидрогеназы.

Полученные результаты показали, что присутствие кверцетина в концентрациях 100 и 200 мкМ увеличивало количество жизнеспособных клеток. Аналогичные результаты были получены Bao et al. [32], исследуя влияние кверцетина на клетки PC-12. Утечку ЛДГ во внеклеточную среду, которая дает информацию о разрушении клеточной мембраны, также исследовали при тех же уровнях кверцетина. Полученные результаты свидетельствовали о том, что мембраны тестируемых клеток в таких условиях не повреждались. Бутс и др. [2], изучая действие кверцетина на эпителиальные клетки легких, наблюдали аналогичные результаты. Следовательно, можно сделать вывод, что в этих концентрациях кверцетин оказывает положительное влияние на клетки, повышая их жизнеспособность.

Второй важный аспект механизма действия кверцетина связан с его антиоксидантными свойствами. Для оценки попутного действия исследуемого полифенола были проведены эксперименты, в которых проверяли, играет ли кверцетин защитную роль в клетках, подвергшихся окислительному стрессу. Окислительный стресс вызывали введением H, O2 в клеточную среду.Цистанхе для улучшения памятиКак показано в этом исследовании, перекись водорода вызывает значительную гибель клеток, выражающуюся в повреждении митохондрий.

Когда клетки SK-N-SH культивировали в течение 3 ч в среде, содержащей 3 и 5 мМ H2O2, жизнеспособность клеток снижалась примерно до 44% по сравнению с необработанными клетками (анализ МТТ). Исследования показали, что предобработка клеток кверцетином в течение 24 ч вызывает увеличение числа живых клеток по сравнению с клетками, обработанными Н2О2. Суэмацу и др. [13] сообщили об аналогичных эффектах.

Мы также измерили уровень MDA, который является биомаркером окислительного стресса как конечного продукта перекисного окисления липидов [33]. Предварительная обработка клеток высокими концентрациями кверцетина с последующим добавлением перекиси водорода приводила к небольшому увеличению содержания МДА по сравнению с клетками, подвергнутыми воздействию только HO. Это может быть связано с тем, что кверцетин (при более высоких концентрациях) также может подвергаться оксидоредуктивной активации и подвергаться окислительно-восстановительному циклу, генерируя внутриклеточные реактивные формы кислорода [34].

Не было выявлено существенных изменений в разрушении мембран (на что указывает неизменный уровень ЛДГ) клеток, обработанных кверцетином и Н2О2, по сравнению со случаем, когда клетки подвергались только окислительному стрессу. Следовательно, можно сделать вывод, что, несмотря на усиление перекисного окисления липидов (при высоких концентрациях кверцетина), оно было недостаточно значительным для разрушения мембран и нарушения их непрерывности.

Наблюдения, полученные для нативной системы, были сопоставлены с наблюдениями, полученными для модельной системы, где можно точно контролировать как концентрацию кверцетина, так и уровень стресса. Проверяли, насколько липидная часть мембраны нейробластомы устойчива к окислительному стрессу. Стрессовые условия создавались путем введения озона в буфер, при этом озон водной среды подвергается реакциям разложения с образованием окислительных радикалов, в том числе гидроксильных радикалов и супероксидных анион-радикалов [35]. Полученная смесь активных форм кислорода соответствует естественно встречающимся в клетках из-за дисбаланса нарушения окислительно-восстановительного статуса [36-38].

Под влиянием стресса вид изотерм изменился, что свидетельствует о значительном уменьшении площади, приходящейся на одну молекулу в плотноупакованном монослое. Такие изменения происходили за счет окисления ненасыщенных связей в цепях жирных кислот. Этот эффект усиливался с увеличением концентрации озона примерно до {{0}}.3 ppm, а затем этот параметр изотермы оставался на том же уровне, несмотря на увеличение АФК. Это означает, что при концентрации озона около 0,3 ppm все ненасыщенные жирные кислоты, присутствующие в монослое, окислялись (в модели нейробластомы общее количество ненасыщенных жирных кислот составляло 52 процента).

Окисленные монослои обладают значительной жесткостью,цистанхе на китайскомкак представлено значением Cs-1 (чем выше значение этого параметра, тем больше жесткость слоя). В присутствии кверцетина даже в низкой концентрации (6,25 мкМ) модификации мембраны под действием озона, о чем свидетельствует изменение значения Alim, значительно снижались (рис. 5а), что доказывает антиоксидантную активность этого соединения. . Однако стоит отметить, что, хотя кверцетин поглощал радикалы, защищая ненасыщенные жирные кислоты от окисления, он не обращал изменений в жесткость мембраны (рис. 5b).

Так, было показано, что кверцетин проявляет антиоксидантное действие, но само его присутствие между липидными молекулами влияет (определяет) на параметры водорослей, т.е., несмотря на защиту цепей жирных кислот от окисления, жесткость мембран значительно снижается (Cs- Я оцениваю примерно на 25 процентов ниже по сравнению с контролем).

Эти результаты показывают, что именно мембранные изменения являются основным фактором клеточных эффектов, возникающих в результате присутствия кверцетина. Однако последствия этого изменения (модификация сигнализации, транспорта) различаются в зависимости от количества молекул полифенолов, исходного состава мембраны и функции клетки. Это объясняет, почему в разных обстоятельствах и в разных исследованиях кверцетин проявляет защитный эффект, а в других — прямо противоположный.

В ситуации сильного окислительного стресса антиоксидантный эффект помогает клетке, защищая ее компоненты от повреждения. Однако, если мембраны значительно модифицированы за счет локализации этого соединения в их окружении, что приводит к распределению сигнальных или транспортных путей за счет изменения жесткости мембраны, это может привести к неблагоприятным эффектам. Следует также помнить, что в клетке одновременно протекают многие процессы, как связанные с мембранами, так и те, которые генерируют окислительный стресс. Эффект, который можно наблюдать и измерить, определяя уровень отдельных показателей, всегда тотален. Отсюда и ситуации, при которых действие кверцетина воспринимается как благоприятное, так и неблагоприятное.

4. Материалы и методы

4.1.Материалы

Состав модели липидной части мембраны клеток нейробластомы установлен на основании работы авторов [39-41]. Фосфолипиды: 1-олеоил-2-пальмитоил-sn-глицерин-3-фосфохолин; 1-гексакозаноил-d4-2-гидрокси-sn-глицерин-3-фосфохолин; 1,2-диолеоил-sn-глицерин-3-фосфохолин; L- -фосфатидилэтаноламин (мозг); сфингомиелин (Мозг) - (Avanti Polar Lipids Inc., Алабастер, Алабама, США). Приобретен холестерин (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия). Соотношение фосфолипидов и холестерина составляло 79% к 21%. Соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот составляло 48% к 52%.

Растворители (хлороформ, этанол) химической чистоты-Poch (Гливице, Польша); свежедеионизированная вода производства HLP 5 Hydrolab (Страшин, Польша). Культуральную среду, сыворотку и антибиотики приобретали у CytoGen GmbH. Химические реактивы, использованные в экспериментах, были получены от Sigma Aldrich.

4.2. Культура клеток

Клеточная линия нейробластомы человека SK-N-SH (Европейская коллекция аутентифицированных клеточных культур (ECACC) культивировали в 10% фетальной телячьей сыворотке (FBS) в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 0,01% пенициллина. -стрептомицин при 37 градусах во влажной атмосфере, содержащей 5 процентов СО2.

4.3. Измерение жизнеспособности клеток (анализ МТТ)

Клетки высевали в {{0}}луночный планшет с плотностью 1×104 клеток на лунку в объеме 0,1 мл. Клетки обрабатывали в течение 24 ч различными концентрациями кверцетина (3,75-200 мкМ). После этого на 3 ч добавляли 3 мМ и 5 мМ перекиси водорода. Из-за отсутствия различий между эффектами HO2 при концентрациях 3 и 5 мкМ, для статистических исследований они обрабатывались как одни и те же обработки и описывались как обработка 3-5 мкМ H2O2.

Затем 50мкл МТТ（3-【4,5-диметилтиазол-2-ил】-2,5 дифенилтетразолия бромид）(стерильный исходный раствор 5 мг/мл) добавляли к клеткам и инкубировали в течение 2 ч при 37° во влажной атмосфере с 5% СО. Затем в каждую лунку добавляли по 0,4 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и выдерживали в течение 10 мин. После центрифугирования измеряли оптическую плотность супернатанта при 570 нм с помощью микропланшет-ридера (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4. Анализ повреждения мембраны (анализ ЛДГ)

Анализ лактатдегидрогеназы (ЛДГ) использовали в качестве маркера целостности клеточной мембраны.

Клетки в количестве 1×1{{10}}* клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в присутствии кверцетина (3,75-200 мкМ) на 24 ч; Затем добавляли 3 мМ и 5 мМ H2O на 3 часа. В пробирки, содержащие 0,5 мл 0,75 мМ пирувата натрия и 10 мкл NADH (140 мкМ) (нагретые при 37°С в течение 10 мин), добавляли 150 мкл супернатанта и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем к образцу добавляли 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина и через 1 ч измеряли оптическую плотность при 450 нм.

4.5. Определение перекисного окисления липидов (концентрация МДА)

Мембранное перекисное окисление липидов оценивали по реакции тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с малоновым диальдегидом (МДА). Клетки высевали в {{0}}луночные планшеты, содержащие кверцетин и H, O2 (в концентрациях и временах, описанных выше) в количестве 1×104 клеток на лунку в объеме { {10}},25 мл. После обработки образцы собирали и центрифугировали (1000×&,5 мин). К осадкам добавляли 0,5 мл 0,5% ТХУ, встряхивали в течение 1 мин и лизировали путем обработки ультразвуком в течение 5 мин. После центрифугирования при 10000×g в течение 10 минут 0,4 мл супернатанта добавляли к 1,25 мл 20-процентной ТХУ с 0,5-процентным ТВА и нагревали в сухом термоблоке (100 градусов) в течение 30 минут. После охлаждения измеряли оптическую плотность при 532 нм, используя молярный коэффициент экстинкции МДА, равный 155 М{28}} см-1.

4.6.Модельные мембраны

Буферное озонирование. Фосфатный буфер (0.01 М, рН 7,4) насыщали озоном, полученным с помощью генератора озона FM 500 (Grekos, Польша). Концентрацию озона в буфере определяли по Бейдеру и Хойну [42].

Изотермы поверхностного давления.рост полового членаДля регистрации изотермы поверхностного давления использовали желоб Ленгмюра (KSV, Финляндия) при постоянной скорости сжатия, соответствующей скорости барьера 5 мм/мин. Монослой липидов формировали путем нанесения определенного количества раствора липидов в хлороформе с концентрацией 1 мг/мл на субфазу, состоящую из водного 0.01 М фосфатного буфера, рН 7,4 с кверцетином или без него, а также с озоном или без него. Поверхностное натяжение измеряли пластиной Pt-Wilhelmy. Эксперименты проводились при температуре 25 градусов ±1 градус.

4.7. Статистический анализ

Для каждого тестируемого варианта проводили от трех до шести независимых анализов и усредняли (±SD). Существенные различия по сравнению с контролем оценивались с использованием процедуры SAS ANOVA. Статистический анализ был выполнен с помощью многодиапазонного критерия Дункана, принимая p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Вклад авторов: концептуализация, BK, BD и методология ER-S, BKBD; программное обеспечение, БК, БДвалидация, БК, БД, ЭР-С., АБрайтинг — подготовка исходного проекта БК, БД, ЭР-С., написание — просмотр и редактирование, БК, БД, ЭР-С., АБвизуализация, БК, БДнадзор, BK, BD, ER-S., ABВсе авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:Это исследование не получило внешнего финансирования.

Заявление Институционального контрольного совета: Непригодный.

Заявление об информированном согласии: Непригодный.

Заявление о доступности данных: Данные содержатся в статье. Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Эта статья взята из Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules