Старение и долголетие всегда были соблазнительными темами для организмов. Как тип взрослой стволовой клетки со способностью к самообновлению

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Старение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) не только препятствует применению МСК в регенеративной медицине, но и тесно связано с биологическим старением и развитием дегенеративных заболеваний. В этом исследовании мы исследовали омолаживающие эффекты куркумина (Cur) на МСК, происходящие из костного мозга собак (cBMSC), и дополнительно выяснили потенциальный механизм действия, основанный на модуляции аутофагии. cBMSCs размножали in vitro стандартными процедурами для создания клеточной модели преждевременного старения.доза цистанхеНаши данные показывают, что по сравнению с третьим пассажем cBMSC многие типичные фенотипы, связанные со старением, наблюдались при шестом пассаже cBMSC. Обработка Cur может улучшать выживаемость cBMSC и замедлять старение cBMSC, согласно наблюдениям, что обработка Cur(1 мкМ) может улучшать эффективность колониеобразующих единиц-фибробластов (CFU-Fs) и повышать экспрессию мРНК плюрипотентных факторов транскрипции (SOX{{5}). } и Nanog), а также ингибирует активность бета-галактозидазы, связанной со старением (SA{8}}gal), и экспрессию мРНК связанных со старением маркеров (pl6 и p21) и провоспалительных молекул (фактор некроза опухоли- (TNF-a) и интерлейкин -6(IL-6)). Кроме того, было обнаружено, что Cur（0.1 мкМ~10 мкМ） увеличивает аутофагическую активность, о чем свидетельствует активация связанной с микротрубочками протеина 1 легкой цепи 3 (LC3), unc51-подобная киназы, активирующей аутофагию. -1 (ULK1), гены, связанные с аутофагией (Atg)7 и Atg12, и генерация типа II легкой цепи 3 (LC3-II), тем самым увеличивая аутофагические вакуоли и кислые везикулярные органеллы, как а также вызывая значительное снижение уровня белка р62. Кроме того, было обнаружено, что активатор аутофагии рапамицин (RAP) и Cur частично улучшают признаки старения cBMSC, в то время как ингибитор аутофагии 3-метиладенин (3-MA) усугубляет старение cBMSC, а лечение Cur способны восстанавливать подавленную аутофагию и противодействовать 3-MA-индуцированному старению cBMSC. Следовательно, наше исследование подчеркивает важную роль Cur-индуцированной аутофагии и ее влияния на улучшение старения cBMSC и дает новое представление о замедлении старения и улучшении терапевтического потенциала MSC.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Ключевые слова:куркумин;старение; аутофагия; мезенхимальные стволовые клетки костного мозга собак

1. Введение

Старение и долголетие всегда были соблазнительными темами для организмов. Как тип взрослых стволовых клеток со способностью к самообновлению, иммуносупрессии, дифференцировке и миграции, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) широко распространены в различных тканях и органах, таких как костный мозг, жировая ткань, амниотическая жидкость, плацента, пуповина. спинной и мышечный [1,2] и играют существенную роль в поддержании тканевого гомеостаза на протяжении всей жизни организма [3,4]. Накопленные данные показали, что биологическое старение и развитие многих дегенеративных заболеваний могут быть связаны со старением МСК [5,6]. Кроме того, МСК являются многообещающими источниками клеточной регенеративной терапии, но обычно их необходимо увеличивать in vitro для достижения минимального числа трансплантаций МСК ({8}} миллионов) для лечения [7]. Однако культура in vitro не способна полностью имитировать микроокружение МСК in vivo и неизбежно запускает клеточное старение [8,9]. Старение митотических клеток происходит в ответ на различные стрессоры, такие как дисфункция теломер [10], ДНК. повреждения [11], окислительного стресса [12] и активации онкогенов [13], что в конечном итоге приводит к прекращению клеточного деления. Кроме того, стареющие МСК проявляют негативное влияние на биологические функции, включая иммуномодуляцию, дифференцировку и миграцию [14]. Много работы было предпринято для разработки эффективных стратегий замедления старения МСК. Недавно было предложено несколько продуктов, полученных из трав, для улучшения здоровья и долголетия организма, и они могут быть многообещающими инструментами для замедления старения МСК [15].

Цистанхе может омолаживать

Куркумин (Cur), гидрофобный полифенол, извлеченный из куркумы традиционной китайской медицины, привлек большое внимание из-за его противовоспалительного, антиоксидантного, антиапоптотического, противоопухолевого и омолаживающего действия на клетки тканей и некоторых моделей заболеваний [{ {4}}]. Многочисленные исследования показали, что Cur оказывает положительное влияние на здоровье при возрастных заболеваниях, включая костно-суставные, неврологические, репродуктивные и сердечно-сосудистые заболевания [20-24]. Старение связано с изменениями опорно-двигательного аппарата, а также с возникновением и прогрессированием костно-суставных заболеваний. Было обнаружено, что хроническое диетическое вмешательство с Cur улучшает моторную функцию руки и пальцев у обезьян среднего возраста и оказывает благотворное влияние на стареющие скелетные мышцы [25,26]. Имеющиеся данные Бурманна и его коллег показали, что Cur может ослаблять остеоартрит, вызванный окружающей средой, уравновешивая выживаемость хондроцитов и воспалительные реакции [27,28]. Кроме того, Cur оказывает нейропротекторное действие через опосредование аутофагии и воспаления и, следовательно, может быть эффективной терапией для пациентов с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Александера, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона [29,30].

Действительно, тот факт, что Cur обладает плейотропной активностью, можно объяснить их активирующим и защитным действием на МСК [31,32]. Несколько исследований подтвердили, что Cur участвует в регуляции иммуномодулирующих способностей; в этот процесс вовлечен дифференциальный потенциал МСК к разным клеточным линиям (нейроцитам, хондроцитам, адипоцитам и остеобластам) и множественным механизмам передачи сигналов [28–31,33-35]. Кроме того, Cur также считается хорошим антиоксидантом, с помощью которого можно увеличить продолжительность жизни мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс (ADSC), благодаря увеличению экспрессии гена теломеразы обратной транскриптазы (TERT) [36]. Недавнее исследование показало, что ингибирование р65 с помощью Cur может предотвратить клеточное старение и активацию воспаления в МСК, полученных из пуповины человека [37].Преимущества экстракта цистанхеОчевидно, больше внимания уделяется омолаживающим эффектам Cur в МСК из-за их огромного терапевтического потенциала, но механизмы, лежащие в основе этого эффекта, до сих пор неясны. Некоторые данные исследований in vitro подтвердили, что положительные эффекты, оказываемые Cur, должны быть связаны с его модуляцией аутофагии [29, 38-41]. Хан и его коллеги продемонстрировали, что Cur может защищать эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) от H2O2-индуцированного окислительного повреждения, и что положительные эффекты возникают за счет усиления аутофагии с помощью фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K)/Akt/. мишень ингибирования рапамицина (mTOR) у млекопитающих [40]. Другое исследование показало, что Cur способен способствовать выживанию клеток путем ингибирования индуцированного гипоксией/реоксигенацией (H/R) апоптоза и чрезмерной аутофагии среди кардиомиоцитов [41]. Следовательно, действует ли Cur в качестве положительного или отрицательного регулятора аутофагии, зависит от стимула, вызывающего стресс, и клеточных условий, и требуется больше деталей, чтобы определить, является ли модуляция аутофагии Cur эффективной стратегией для задержки старения MSC. Как принцип пути деградации и рециркуляции внутриклеточных веществ, аутофагия играет решающую роль в поддержании клеточного гомеостаза и противостоянии давлению окружающей среды и продемонстрировала огромный потенциал для замедления клеточного старения и лечения возрастных заболеваний. Дисфункция органелл и накопление токсических метаболитов являются ключевыми характеристиками стареющих МСК [42], что указывает на потенциальную связь между аутофагией и старением. Ма и его коллеги обнаружили, что аутофагическая активность старых СККМ была снижена по сравнению с молодыми СККМ и что ингибитор аутофагии 3-метиладенин (3-МА) может ускорять старение в молодых МСК; напротив, они обнаружили, что активатор аутофагии рапамицин (RAP) может частично восстанавливать биологические свойства старых СККМ [5]. В недавнем исследовании изучалась роль модулированной аутофагии с использованием RAP и 3-MA в старении МСК, индуцированном D-галактозой (D-gal), и было показано, что RAP заметно облегчал старение МСК [43]. Интересно, что несколько исследований показали, что увеличение аутофагии наблюдается в стареющих МСК и что аутофагия необходима для поддержания процессов старения МСК [44,45]. Таким образом, вопрос о том, можно ли рассматривать аутофагию как положительный или отрицательный регулятор старения МСК, остается противоречивым и неоднозначным. Следовательно, было бы интересно исследовать взаимосвязь между аутофагией, старением МСК и Cur, что могло бы обеспечить более широкую перспективу для замедления старения и улучшения терапевтического потенциала МСК.

В этом исследовании наша основная цель состояла в том, чтобы выяснить, может ли лечение Cur задерживать старение MSC (cBMSC), происходящих из костного мозга собак, и коррелирует ли основной механизм с модуляцией аутофагии. С этой целью мы оценили фенотипическую характеристику, аутофагическую активность и экспрессию генов после воздействия Cur в стареющих cBMSC, а также определили ли взаимосвязь между аутофагией и ее эффектами на старение cBMSC с помощью 3-MA и RAP. .

2. Результаты

2.1. Характеристики cBMSC

cBMSC размножали in vitro стандартными процедурами, и было показано, что они стабильно пассируются в течение девяти поколений (данные не показаны). cBMSCs демонстрировали прилипание к пластику и фибробластоподобный внешний вид на протяжении всего процесса культивирования (рис. 1А). Способность cBMSCs к дифференцировке была подтверждена адипогенной и остеогенной индукцией (рис. 1B, C). Иммунофенотип cBMSC оценивали с помощью проточной цитометрии. Результаты показали, что клеточная популяция положительно экспрессировала CD90, CD105 и ITGB1 и отрицательно экспрессировала CD31, CD34 и CD45, что свидетельствует об их мезенхимальном, а не гемопоэтическом происхождении (рис. 1 и таблица 1).

2.2.cBMSC постепенно проявляют признаки старения по мере роста in vitro

cBMSC раннего пассажа (P1 и P3) имеют длинную веретенообразную или треугольную форму и образуют водоворот после роста in vitro (рис. 2А). Впоследствии cBMSC постепенно демонстрировали фенотипы, связанные со старением, в ходе длительного культивирования in vitro, характеризующиеся увеличенной и плоской морфологией и снижением пролиферации (рис. 2А, В). Кроме того, результаты анализа колониеобразующей единицы-фибробласта (КОЕ-Ф) показали, что как количество КОЕ-Ф, так и размер колоний значительно уменьшались в ходе культуральных пассажей (рис. 2С), что согласуется со сниженной регуляцией мРНК. экспрессия плюрипотентных факторов транскрипции Nanog и SOX-2 в 6-м и 9-м пассажах (рис. 2G).

Ассоциированная со старением -галактозидаза (SA- -gal) представляет собой лизосомальный фермент, активность которого сильно коррелирует с клеточным старением [46]. Результаты окрашивания SA- -gal показали, что количество SA- --положительных клеток выросло с 7,5 ± 2,4 процента (P3) до 65,0 ± 5,0 процентов (P6) и 87,3 ± 3,3 процента (P9) соответственно (рис. 2D).Цистанче ЧингисханКроме того, было обнаружено увеличение экспрессии ингибиторов киназ клеточного цикла (p21 и p16) и провоспалительных молекул (TNF- и IL-6), которые действуют как компоненты секреторного фенотипа, ассоциированного со старением (SASP). в 6-м и 9-м пассажах (рис. 2Д, Е). Следовательно, cBMSCs проявляют зависимое от пассажей увеличение стареющих фенотипов и прекращают пролиферацию на 9-м пассаже.

2.3. Cur облегчает состояние старения cBMSCs

cBMSC 6-го пассажа инкубировали в отсутствие или в присутствии Cur в дозах 0.1, 0.5,1,5 или 10мкмоль/мл (мкМ) в течение 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч, а их клеточную жизнеспособность оценивали с помощью CCK-8. Результаты показали, что Cur (0.1-10 мкМ) не оказывает токсического действия на cBMSC и оказывает ощутимое влияние на повышение жизнеспособности cBMSC через 24 часа лечения (рис. 3А). Чтобы оценить влияние Cur на клеточное старение, cBMSC подвергали воздействию различных концентраций Cur (0,1, 1 и 10 мкМ) в течение 24 часов. Результат показал, что количество SA- -gal-положительных клеток значительно уменьшилось в cBMSC после обработки Cur (1 мкМ и 10 мкМ) по сравнению с контрольной группой (рис. 3B). Анализы CFU-F использовались для оценки влияния Cur на эффективность самообновления cBMSCs (P6). Было обнаружено, что доза 1 мкМ Cur является наиболее эффективной концентрацией для повышения эффективности CFU-F cBMSCs. Однако доза 10 мкМ Cur оказывала неблагоприятное воздействие на эффективность самообновления cBMSC (рис. 3C). IL-6 и TNF- и усиление экспрессии Nanog и SOX-2 (рис. 3D-F).продление жизни цистанхеВ совокупности эти результаты показывают, что Cur в дозе 1 мкМ может эффективно оказывать цитопротекторное действие на стареющие cBMSC.

2.4. Обработка Cur усилила аутофагическую активность в cBMSCs

Функциональная активация лизосом играет критическую роль в ходе аутофагии, а нарушения лизосомального закисления неблагоприятны для функции лизосомной деградации [38]. Таким образом, аутофагическая активность была впервые обнаружена с помощью окрашивания LysoTracker, с помощью которого можно отслеживать лизосомальное закисление. Результат показал, что предварительное кондиционирование Cur в зависимости от дозы увеличивало интенсивность красной флуоресценции в cBMSCs, что свидетельствует об усилении подкисления лизосом (рис. 4D).

Чтобы дополнительно оценить влияние Cur на аутофагию cBMSC, мы использовали маркеры аутофагосом, ассоциированный с микротрубочками белок 1A/1Belight chain 3 (LC3) и p62/SQSTM1, которые являются ключевыми маркерами для оценки аутофагического потока [47,48]. ]. Повышенная аутофагическая активность наблюдалась в cBMSC после воздействия Cur, о чем свидетельствует дозозависимое увеличение превращения LC{{10}}I в LC3-}II наряду с ускорением p62. деградация (рис. 4A). Кроме того, экспрессия мРНК ATG7, ATG12.LC3. и ULK1 повышались после обработки Cur (рис. 4B). Ультраструктуру cBMSC исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Затем мы наблюдали увеличение образования аутофагосом и аутолизосом в cBMSCs после обработки Cur в дозах 0,1, 1 и 10 мкМ в течение 24 часов (рис. 4C).цистанче россияИммунофлуоресцентное окрашивание также показало, что количество характерных точечных флуоресцентных точек LC3 было значительно увеличено при обработке Cur (рис. 4E). Эти результаты показали, что Cur может способствовать закислению лизосом и активации аутофагии дозозависимым образом.

Эта статья взята из Int. Дж. Мол. науч. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms