Замалчивание MiR-103a-3p улучшает отложение оксалата кальция в почках крыс путем активации оси UMOD/TRPV5

2.10. Биоинформатический анализ и анализ люциферазы.

УМОД-нацеленная на микроРНК, miR-103a-3p, как и ожидалось, была проанализирована с помощьюВеб-сайт ТаргетСкан(http://www.targetscan.org/vert_71/)и затем был подтвержден с помощью анализа люциферазы. pGL3-контрольвекторы (Е1741) были приобретены у компании Promega (США) дляпостроить UMOD дикого типа (UMOD-WT, 5′-AGCCУГУГУКУУУАААУГКУГКУ-3′) и мутантный типУМОД (УМОД-МУТ, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAУГАУККУ-3′). NRK-52E-клетки котрансфицировалиmiR-103a-3p имитатор UMOD-WT или miR-103a-3pмимика и УМОД-МУТ с помощью Липофектамина2000 г. Идентичная процедура была проведена в мимике.контроль (векторы pRL-TK, VT1568, YouBio, Китай). Послечто мы определили активность люциферазы в клетках с помощьюНабор для репортерного анализа двойной люциферазы (E1910, Promega, США).2.11. Создание модели гипероксалурии in vivo.Дляв естественных условияхисследовании мы создали крысиную модель гипероксалуриипутем добавления 1% этиленгликоля (EG) (324558, Sigma-Aldrich,США) к питьевой воде. Эксперимент на животных былодобрено Комитетом лабораторных животныхТретий АФФИБольница Синьсянского медицинского университета(IHRM20200510). Всего 40 мужчин Спрэг Доули (ЮД).крысы (8 недель, 180–210 г) куплено у Чарльза РивераЛаборатории (Пекин, Китай) использовались вв естественных условияхизучать. Всекрысы были разделены на 4 группы контроль, ЭГ, ЭГ + антагомир и ЭГ + антагомир-НК по десять крыс в каждой группе.Во время содержания в контрольной группе крысам предоставляли толькос водопроводной водой; в группе ЭГ крысы получали лечениес 1% ЭГ; в группе ЭГ + антагомир крысы былиобработанный 1% ЭГ и внутривенно введенный миР-103а-3п антагомир; а в группе ЭГ+антагомир-НК,крысам вводили 1% ЭГ и внутривенно вводилис миР-103a-3p антагомир-NC. Через 4 недели все крысыбыли жертвеннымифискончался в результате вывиха шейных позвонков под наркозом(пентобарбитал натрия, 40 мг/кг, P-010, Merck, США) иткани почек собирали для гистологического исследования.miR-103a-3p антагомиры, использованные в этом эксперименте, былиполучен из Рибобио (Гуанчжоу, Китай).

НОВАЯ ТРАВЯНАЯ ФОРМУЛА ДЛЯТКАНИ ПОЧЕК

2.12. Окраска гематоксилин-эозином (HE).

Фиксированные формалином ткани почек заливали в парафин для оценки отложения CaOx. Перед окрашиванием HE срезы депарафинизировали и гидратировали. Затем для обработки образцов использовали набор для окрашивания HE (C0105S, Beyotime, Китай) в соответствии с инструкциями по эксплуатации. После герметизации тканей область осаждения кристаллов наблюдали под поляризационным микроскопом (Axio Scope.A1, Precision Instrument, Китай) при увеличении × 100 и количественно оценивали с помощью ImageJ (видение 1.8.0, Национальные институты здравоохранения, США).

Рисунок 5: Продолжение.

Рисунок 5. Замалчивание miR-103a-3p активировало ось UMOD/TRPV5, чтобы ослабить NRK-52E-клетки от повреждения, вызванного оксалатами. ( а ) Было определено влияние ингибитора miR-103a-3p на жизнеспособность клеток в клетках NRK-52E, обработанных оксалатом, плазмидой, сверхэкспрессирующей TRPV5-, и siUMOD. по МТТ-тесту. (b) Анализ адгезии кристаллических клеток использовали для количественной оценки отложения CaOx в определенных клетках (увеличение ×200, масштабная линейка=200 мкм). (c) Набор Fluo-4 AM проанализировал измерение содержания Ca2+ в различных группах. ∗∗∗p < 0:001 по сравнению с оксалатом; ###p < 0:001 по сравнению с оксалатом + TRPV5 + siNC + IC; ∧∧p < 0:01 и ∧∧∧p < 0:001 по сравнению с оксалатом + TRPV5 + siUMOD + IC. TRPV5: член 5 катионного подсемейства V подсемейства переходного рецепторного потенциала; УМОД: уромодулин; МТТ: метилтиазолилдифенилтетразолий бромид; НК: отрицательный контроль; siUMOD: малая интерферирующая РНК против UMOD; Я: ингибитор; IC: контроль ингибитора.

2.13. Иммуногистохимия (ИГХ).

Для изучения распределения TRPV5 в тканях почек мы использовали для проведения ИГХ набор Super Plus™ High Sensitive and Rapid Immunohistochemical Kit (E-IR R221, Elabscience, Китай). Короче говоря, срезы почек (4 мкм) обрабатывали буфером для депарафинизации/антигена в течение 30 минут при нагревании и затем инкубировали с буфером, блокирующим пероксидазу SP Reagent B, при комнатной температуре в течение 15 минут. После промывки PBS срезы подвергали взаимодействию с антителом против TRPV5 (ab137028, 1/100, Abcam, UK) при 37 градусах Цельсия в течение 2 часов с последующей инкубацией вторичных антител. После этого срезы требовались для проявления окраски в рабочем растворе DAB и окрашивания в гематоксилиновом буфере. После повторной обработки изображения окрашивания были получены с помощью микроскопа (CX23, Olympus, Япония) при увеличении ×100.

2.14. Статистический анализ.

Все эксперименты повторялись три раза по отдельности, при этом данные измерений описывались как среднее ± стандартное отклонение. Различия по сравнению между несколькими группами анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа. Для анализа данных использовали GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США), и значение p < 0.05 указывало на статистически значимую разницу.

НОВАЯ ТРАВЯНАЯ ФОРМУЛА ДЛЯТКАНИ ПОЧЕК

3. Результаты

3.1. Повышение регуляции TRPV5

Защищенные клетки NRK-52E отТравма, вызванная оксалатами. Основываясь на ключевой роли TRPV5 в регуляции транспорта Ca2+ вклетки почечных канальцевмы впервые выполнили сверхэкспрессию TRPV5 в клетках NRK-52E. Как показано на рисунке 1(а), значительное увеличение уровня мРНК TRPV5 было обнаружено с помощью qRT-PCR (p < 0:001). Вестерн-блоттинг также позволил измерить высокий уровень белка TRPV5 в трансфицированных клетках (рис. 1(b), p < 0:001). После обработки оксалатом клеток NRK-52E мы обнаружили, что экспрессия TRPV5 была снижена по сравнению с таковой в контрольной группе, которая была обращена вспять путем трансфекции плазмиды, сверхэкспрессирующей TRPV5- (рис. 1(c), р < 0:001). Кроме того, обнаружение вестерн-блоттинга дало аналогичные результаты (рис. 1 (d), p <0:001). Следующий МТТ-анализ показал, что оксалат присутствует и жизнеспособность клеток, которая была частично отменена послеСверхэкспрессия TRPV5(Рис. 1(e), p < 0:05). Обнаружение адгезии кристаллов показало, чтоСверхэкспрессия TRPV5поразительно ингибировал адгезию CaOx, индуцированную оксалатом, в клетках NRK-52E (рис. 1(f)).

.

Рисунок 6: Замалчивание miR-103a-3p смягчало EG-индуцированное отложение CaOx в тканях почек in vivo путем активации оси UMOD/TRPV5. (а, б) Отложение CaOx измеряли путем окрашивания H&E в тканях почек крыс, получавших ЭГ или ЭГ и миР-103a-3p антагомир (×100 увеличение, масштабная линейка=200 мкм). (c) Вестерн-блоттинг использовали для измерения уровней белка UMOD и TRPV5 в тканях почек крыс, получавших EG или EG и miR{{10}}a-3p антагомир. -Актин служил внутренним контролем. ( г ) ИГХ-анализ экспрессии TRPV5 проводили в тканях разных групп (увеличение × 100, масштабная линейка=200 мкм). ∗∗∗p < 0:001 по сравнению с контролем; #p < 0:05, ###p < 0:001 по сравнению с EG + антагомир-NC. ОН: гематоксилин и эозин ЭГ, этиленгликоль; TRPV5: член 5 катионного подсемейства V подсемейства переходного рецепторного потенциала; УМОД: уромодулин; НК: отрицательный контроль; ИГХ: иммуногистохимия

3.2. Оксалатная индукция

Сниженная экспрессия UMOD, которая положительно связана с обогащением TRPV5 на поверхности клеток. Было обнаружено, что экспрессия мРНК UMOD подавляется в индуцированных оксалатами NRK-52E-клетках (рис. 2(a), p < 0:001), а также уровень белка (рис. 2(b), p < 0:01). Результаты CoIP подтвердили, что UMOD в значительной степени коиммунопреципитируется с помощью TRPV5, меченного анти-флагом, и, наоборот, TRPV5 коиммуно преципитируется с помощью анти-UMOD (рис. 2(c)). Затем мы усилили экспрессию UMOD в клетках NRK-52E, что было подтверждено с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга. Заметное повышение экспрессии UMOD, определенное по уровням мРНК (рис. 2 (d), p <0:001) и белка (рис. 2 (e), p <0:001), свидетельствовало об успешной трансфекции. Кроме того, результаты анализа биотинилирования клеточной поверхности показали, что TRPV5 в большом количестве присутствует на поверхности клеток NRK- 52E, котрансфицированных сверхэкспрессией UMOD и TRPV5, по сравнению с его отрицательным контролем (рис. 3(a)).

3.3. УМОД

Регулирует защитную роль TRPV5 в клетках, индуцированных оксалатами. (Рисунок 3(а)). Чтобы раскрыть взаимодействие UMOD и TRPV5 в индуцированных оксалатами NRK-52E-клетках, мы провели трансфекцию siUMOD. QRT-ПЦР определила, что мРНК UMOD экспрессируется на низком уровне в клетках, трансфицированных siUMOD (рис. 3(b), p < 0:001), и аналогичный результат уровень его белка измеряли с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3(c), p < 0:001). Впоследствии анализы МТТ и адгезии кристаллов показали, что siUMOD заметно компенсирует стимулирующий эффект TRPV5 на жизнеспособность клеток (рис. 3(d), p <0:01) и ингибирующий эффект TRPV5 на адгезию CaOx (рис. 3(e)) в клетках NRK-52E, индуцированных оксалатом. Кроме того, мы измерили содержание Ca2+ после дивергентных трансфекций. Как показывают результаты, представленные на рисунке 3(f), TRPV5 заметно сдерживал индуцированное оксалатами снижение внутриклеточной концентрации Ca2+ в NRK-52E-клетках, которое частично восстанавливалось при добавлении Саймона (p < 0: 001).

3.4. миР-103а-3п

Направлен на UMOD и опосредован регуляцией оси UMOD/TRPV5 в клетках, индуцированных оксалатами. С помощью веб-сайта TargetScan результат предсказания генов показал, что miR-103a-3p может содержать сайты связывания для UMOD (рис. 4(a)). Затем анализ люциферазы выявил подавленную активность люциферазы в клетках, котрансфицированных миметиком miR-103a-3p и UMOD WT (рис. 4(b), p < 0:{{21) }}01). Чтобы понять регулирующее влияние miR{{10}}a-3p на UMOD, мы реализовали ингибирование miR- 103a-3p в NRK{{14} }E-клетки, при этом обнаружение qRT-PCR подтверждает, что экспрессия miR-103a-3p сильно снижалась после трансфекции ингибитора miR- 103a-3p ( Рисунок 4(c), p < 0:001). Интересно, что экспрессия мРНК UMOD была повышена после ингибирования miR-103a-3p, которое заметно прекращалось с добавлением подавления UMOD (рис. 4(d), p < 0:01). ). При обнаружении вестерн-блоттинга было обнаружено, что изменение экспрессии белка UMOD такое же, как и при экспрессии мРНК UMOD (рис. 4 (e), p <0:01). Кроме того, мы провели эксперименты по спасению функций клеток. Как показано, регулирующая роль оси UMOD/TRPV5 в жизнеспособности клеток (рис. 5(а), p <0:001), адгезии CaOx (рис. 5(b)) и внутриклеточной концентрации Ca2+ (рис. 5(c), p < 0:01) был поразительно реверсирован ингибитором miR- 103a-3p.

3.5. миР-103а-3п

Замалчивание смягченного EG-индуцированного отложения CaOx в тканях почек in vivo путем активации оси UMOD/TRPV5. Чтобы еще больше подтвердить наши результаты in vitro, мы создали крысиную модель гипероксалурии для исследования in vivo. Как показано на рисунках 6(a) и 6(b), наблюдалось значительное отложение кристаллов CaOx в тканях почек группы EG по сравнению с таковым в контрольной группе, и эта тенденция была обращена вспять miR-103a{{ 5}}p Сантьягомир (p < 0:001). Затем результаты вестерн-блоттинга показали, что ЭГ сильно подавлял уровни белка UMOD и TRPV5, что было заметно восстановлено антагомиром miR-103a- 3p (рис. 6(c), p < 0:05). ). С помощью ИГХ мы заметили, что экспрессия TRPV5 была снижена в группе EG по сравнению с контрольной группой и повышена в группе EG + антагомир по сравнению с группой EG + антагомир-NC (рис. 6 (d)).

4. Обсуждение

В контексте все более разнообразных хирургических методов лечения камней в почках следует подчеркнуть известные методы предотвращения их возникновения и рецидивов [27]. Наиболее распространенным компонентом камней в почках являются кристаллы CaOx. На развитие камней в почках, содержащих Ca2+-, влияет множество факторов, при этом гиперкальциурия является, безусловно, основным признанным фактором риска [28]. Цуруока и др. продемонстрировали, что через почечные канальцы снижение реабсорбции Ca2+ играет важную роль в индукции гиперкальциурии и что активная реабсорбция кальция может регулироваться различными факторами [29]. Позже Вустер и др. предположили, что постпрандиальные уровни Ca2+ в моче были значительно выше у пациентов с гиперкальциурией по сравнению с контрольной группой, даже когда секреция паратгормона в крови и почечная нагрузка были на одном уровне [30]. В целом следует отметить, что нарушение почечной канальцевой реабсорбции может быть основной причиной гиперкальциурии. Таким образом, в этом исследовании был изучен основной молекулярный механизм, который регулирует уровни Ca2+ в моче с точки зрения реабсорбции Ca2+, чтобы выявить важные каналы для предотвращения и лечения камней в почках.

TRPV5 действует как канальцевый эпителиальный Ca2+ канал почек, который опосредует транспорт и реабсорбцию Ca2+ в почках [31]. Джанг и др. отметили, что экспрессия белка TRPV5 явно подавлялась в почечных тканях крыс с гиперкальциемией, но восстанавливалась при введении гидрохлоротиазида, что указывает на то, что механизм лечения гиперкальциурии гидрохлоротиазидом может быть достигнут за счет повышения экспрессии белка TRPV5 в почечных тканях [32]. Исследования подтвердили, что высокая оксалурия индуцирует выработку активных форм кислорода (АФК), повреждает эпителиальные клетки почечных канальцев и изменяет структуру фосфатидилсерина в клеточной мембране, что приводит к адгезии CaOx к поверхности эпителиальных клеток почечных канальцев [33]. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что заметное снижение уровня TRPV5 возникало после индукции повреждения NRK-52E-клеток оксалатом, тенденция которого изменилась после трансфекции сверхэкспрессии TRPV5. Кроме того, активация TRPV5 повышала жизнеспособность клеток и ингибировала адгезию CaOx в клетках NRK-52E, индуцированную оксалатом, что указывает на то, что TRPV5 оказывает критический профилактический эффект на индуцированное оксалатами образование камней CaOx в почках.

ЦИСТАНШ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ОКСАЛАТА КАЛЬЦИЯ

Будучи основным каналом реабсорбции Ca2+, активность и экспрессия TRPV5 могут регулироваться множеством факторов [34]. Например, недавнее исследование подтвердило, что UMOD предотвращает образование камней в почках, стимулируя реабсорбцию Ca2+ через TRPV5 [35]. Более того, было отмечено, что у 87,5% мышей с нокаутом по UMOD в возрасте 15 месяцев образовались кальций-оксалаты и кальций-фосфатные камни в УНТ, мозговом веществе почек и сосочках. Все эти данные позволяют предположить, что UMOD может взаимодействовать с TRPV5 при образовании камней в почках, но это еще не подтверждено. Однако наше исследование впервые выявило существование взаимодействия, при котором UMOD положительно регулирует экспрессию TRPV5 в поврежденных клетках NRK-52E, усиливая жизнеспособность клеток, уменьшая адгезию CaOx и усиливая реабсорбцию Ca{{12}. }.

микроРНК участвуют в развитии и прогрессировании заболеваний почек посредством направленной регуляции мРНК. Было обнаружено, что miR-21 способствует индуцированному оксалатами повреждению клеток почечных канальцев за счет повышения регуляции PPARA [36]. Кроме того, Цзян и др. сообщили, что ингибирование miR-155-5p с целью усиления экспрессии MGP может заметно ослабить вызванное оксалатами окислительное стрессовое повреждение в почках [37]. Однако мало исследований было посвящено выяснению механизма регуляции микроРНК UMOD, влияющей на образование камней в почках. Чтобы получить более глубокое понимание патогенеза этого заболевания, в этом исследовании использовался биоинформатический анализ и анализ люциферазы, чтобы найти микроРНК, miR-103a-3p, потенциально регулирующую UMOD. В исследованиях заболеваний почек было подтверждено, что цикл miR-103a-3p оказывает глубокое влияние на воспаление и фиброз почек [38]. Питерс и др. также предположили, что miR-103a-3p можно рассматривать как потенциальный биомаркер при хронической болезни почек [39]. Интересно, что в нашем исследовании мы подтвердили молекулярный механизм miR-103a-3p в камнях почек, согласно которому подавление miR- 103a-3p может облегчить повреждение, вызванное оксалатами. NRK-52E-клетки путем активации оси UMOD/TRPV5. Более того, мы еще более убедительно доказали этот регуляторный механизм в экспериментах in vivo на моделях крыс, индуцированных ЭГ. Однако в этом исследовании уделяется недостаточно внимания, поскольку оно включает один тип клеток и относительно небольшое количество переменных исследования в экспериментах in vitro.

ЦИСТАНШ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ОКСАЛАТА КАЛЬЦИЯ

5. Выводы

В целом, наше текущее исследование показало, что подавление miR-103a-3p улучшает отложение CaOx в почках крыс за счет активации оси UMOD/TRPV5, что закладывает новую теоретическую основу для стратегий профилактики, диагностики и лечения. в отношении камней в почках с точки зрения реабсорбции Ca2+.

Доступность данных. Проанализированные наборы данных, созданные в ходе исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Конфликты интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.

Ссылки

[1] RE Hautmann и M. Straub, «Мочевые камни. Метаболизм и диагностика», Urologie A, vol. 45, нет. 4, стр. 181–184, 2006. [2] З. Киркали, Р. Расули, Р. А. Стар и Г. П. Роджерс, «Мочевыделительная болезнь: прогресс, состояние и потребности», Урология, том. 86, нет. 4, стр. 651–653, 2015.

[3] А. Л. Роджерс, «Раса, этническая принадлежность и мочекаменная болезнь: критический обзор», Мочекаменная болезнь, том. 41, нет. 2, стр. 99–103, 2013.

[4] К. Сахаи, «Последние достижения в патофизиологии нефролитиаза», Kidney International, vol. 75, нет. 6, стр. 585–595, 2009.

[5] Т. Нолл, А. Б. Шуберт, Д. Фаленкамп, Д. Б. Лейсманн, Г. Вендт-Нордаль и Г. Шуберт, «Мочекаменная болезнь на протяжении веков: данные более чем 200 анализов камней в мочевом пузыре». Журнал урологии, том. 185, нет. 4, стр. 1304–1311, 2011. [6] Т. Митчелл, П. Кумар, Т. Редди и др., «Пищевые оксалаты и образование камней в почках», Американский журнал физиологии. Физиология почек, том. 316, нет. 3, стр. F409–f413, 2019. [7] С.Р. Хан, М.С. Перл, В.Г. Робертсон и др., «Камни в почках», Nature Reviews. Учебники по болезням, том. 2, нет. 1, с. 16008, 2016.

[8] CY Pak, HJ Heller, MS Pearle, CV Odvina, JR Poindexter и RD Peterson, «Профилактика образования камней и потери костной массы при абсорбционной гиперкальциурии с помощью комбинированных диетических и фармакологических вмешательств», The Journal of Urology, vol. 169, нет. 2, стр. 465–469, 2003.

[9] GC Curhan, WC Willett, EL Knight и MJ Stampfer, «Диетические факторы и риск возникновения камней в почках у молодых женщин: исследование здоровья медсестер II», Archives of Internal Medicine, vol. 164, нет. 8, стр. 885–891, 2004.

[10] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi и др., «Диетические растения для профилактики и лечения камней в почках: доклинические и клинические данные и молекулярные механизмы», International Journal of Molecular Sciences, vol. 19, нет. 3, с. 765, 2018.