Вакцина мРНК вызывает STING-зависимые противоопухолевые иммунные ответы

Абстрактный

РНК-вакцины на основе липидов широко используются для профилактики и лечения заболеваний, однако механизм их действия и отдельные компоненты, способствующие такому действию, еще предстоит определить. Здесь мы показываем, что терапевтическая противораковая вакцина, состоящая из ядра протамина/мРНК и липидной оболочки, очень эффективно стимулирует цитотоксические реакции CD8+ Т-клеток и опосредует противоопухолевый иммунитет. Механически и ядро ​​мРНК, и липидная оболочка необходимы для полной стимуляции экспрессии интерферонов I типа и воспалительных цитокинов в дендритных клетках. Стимуляция экспрессии интерферона-b зависит исключительно от STING, а противоопухолевая активность мРНК-вакцины значительно снижается у мышей с дефектным геном Sting. Таким образом, мРНК-вакцина вызывает STING-зависимый противоопухолевый иммунитет.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

1. Введение

Быстрая разработка и повсеместное применение мРНК-вакцин для профилактики инфекции SARS-CoV-2 продемонстрировали эффективность препаратов на основе мРНК в здравоохранении1,2. Из-за большой молекулярной массы и отрицательного заряда молекулы мРНК необходимо упаковывать в средства доставки, чтобы эффективно проникать в клетки млекопитающих. Упаковка в средства доставки нанометрового размера также защищает молекулы мРНК от ферментативной деградации. Для этой цели были разработаны многочисленные платформы доставки, такие как липидные наночастицы4, липополиплекс (LPP)5, липосома-протамин-РНК (LPR)6, РНК-липоплекс (РНК-LPX)7 и вирусоподобные вакцинные частицы (VLVP). )8. Хотя каждая платформа имеет свою уникальную структуру и состав, большинство носителей содержат молекулу ионного липида, которая облегчает упаковку мРНК и выход молекул мРНК из эндосом. Благодаря успеху профилактических вакцин пришло общее понимание того, что мРНК-терапия может использоваться для лечения, возможно, большинства, если не всех, типов заболеваний 9e12. Действительно, терапевтические противораковые вакцины на основе мРНК изучаются уже много лет13,14. Недавние достижения в клинических исследованиях также продемонстрировали потенциал их применения у отдельных больных раком15e17. В отличие от пептидных противораковых вакцин, которые готовятся с адъювантными молекулами18e20, частицы мРНК вакцины также могут служить самоадъювантами21.

Например, двухкомпонентная противораковая вакцина на основе мРНК, содержащая свободную мРНК и мРНК, связанную с протамином, также может активировать передачу сигналов toll-подобного рецептора 7 (TLR7)22. Однако в связи с растущей обеспокоенностью по поводу острой врожденной иммунной токсичности голой мРНК большинство исследователей и компаний используют модифицированную РНК, чтобы избежать врожденного распознавания TLR23. Следовательно, липидные компоненты играют важную роль в усилении адъювантной активности мРНК-вакцинной частицы, предпочтительно путем активации передачи сигналов, отличных от TLR. Недавнее исследование липидной отрицательно заряженной РНК-LPX, состоящей из липосомы 1,2-диоктадеценил-3-триметиламмония (DOTMA, катионный липид)/диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE, хелперный липид), выявило активация оси интерлейкин 1 (IL1)-антагонист рецептора интерлейкина 1 (IL-1ra) в регуляции секреции провоспалительных цитокинов и существенная роль активации двухэтапного пути воспаления в моноцитах24. Интересно, что еще одно недавнее исследование BNT162b2 на основе LNP, полученного с ALC-0315 (ионизированный липид), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолином (DSPC, хелперный липид) , полиэтиленгликоль-2000-N, N-дитетрадецилацетамид (ПЭГ2000-ДТА) и холестерин показали ключевую роль в активации интерферон-зависимой передачи сигналов MDA5 типа I, но не TLR или воспалительные процессы, в стимулировании обоих врожденный и адаптивный иммунитет к вакцине COVID-1925. Эти исследования указывают на возможность того, что платформы доставки, состоящие из различных липидных молекул, могут полагаться на разные пути передачи сигнала для активности вакцины. Таким образом, важно полностью изучить функцию ключевых молекул и их комбинаций для дальнейшего улучшения терапии мРНК.

В текущем исследовании мы поставили эксперименты, чтобы проанализировать функциональную роль отдельных компонентов терапевтической противораковой вакцины. Вакцинная частица мРНК (MVP) состоит из ядра протамина/мРНК, инкапсулированного в липидную оболочку, состоящую из катионного липида, хелперного липида, пегилированного липида и холестерина (рис. 1А). Было продемонстрировано, что включение заряженного липида может облегчить адресную доставку РНК26, а диолеилэтилфосфатидилхолин (EDOPC) и диолеоил-3- триметиламмонийпропан (DOTAP) являются двумя катионными липидами, которые были протестированы для этой цели5,27. Мы исследовали стимуляцию экспрессии интерферона-b (IFN-b), IL-1b и фактора некроза опухоли-a (TNF-a) ядром мРНК, носителем без мРНК и всем MVP, и коррелировали такую ​​активность с TLR7, митохондриальной противовирусной передачей сигналов (MAVS, также известной как IPS-1), стимулятором генов IFN (STING) и адаптером, содержащим TIR-домен, индуцирующим передачу сигналов IFN-b (TRIF). Впоследствии мы исследовали роль протамина в ядре и катионного липида в оболочке в стимуляции экспрессии IFN-b и TNF-a. Наконец, мы сравнили противоопухолевые иммунные ответы MVP у мышей дикого типа и мышей с нокаутом генов.

Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

1,2-Диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (EDOPC) (890704), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE) (850725) ), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP) (890890), 1,2- диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) (850375) были приобретены у Avanti Polar Lipids, Inc. ( Бирмингем, Алабама, США). Холестерин (C8667) был получен от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Реагенты растворяли в этаноле в концентрации 2 мг/мл для ДСПЭ-ПЭГ2к, 10 мг/мл для холестерина и ДОФХ и 20 мг/мл для ЭДОФХ, ДОФЭ и ДОТАП соответственно. Сульфат протамина (P4020) был получен от Sigma Aldrich. Молекулы мРНК, кодирующие овальбумин (OVA-мРНК) (L-7210), eGFP (мРНК eGFP) (L-7201) и люциферазу (Luc-мРНК) (L-7204), были приобретены у TriLink Biotechnologies (Сан-Диего, Калифорния, США). Воду, не содержащую РНКазы (W0805-010), получали от GeneDEPOT (Бейкер, Техас, США). Агонист TLR7 имиквимод (tlrimq) и агонист Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) были продуктами компании Invivogen (Сан-Диего, Калифорния, США). Липофектамин 2000 (11668019) и набор для анализа РНК Quant-iT™ RiboGreen™ (R11490) были приобретены у Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Рекомбинантный мышиный GM-CSF (554586) был приобретен у BD Biosciences (Сан-Диего, Калифорния, США). Коктейль ингибиторов переносчиков белков 500 (00-4980-93) был продуктом компании Invitrogen. Набор Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) был приобретен у BD Biosciences. Набор для выделения Т-клеток мыши EasySep™ (19851) был получен от STEMCELL Technologies, Inc. (Ванкувер, Британская Колумбия, Канада). Следующие антитела были приобретены у BioLegend (Сан-Диего, Калифорния, США): анти-CD80-PE-Cy7 (104734), анти-CD86-FITC (105006), анти-CD11b-APC- Cy7 (101226), анти-CD8-BV510 (100752), анти-CD44-APC (103012), анти-CD69-APC (104514) и анти-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), анти-CD64- PE-Cy7 (139314), анти-B220-APC (103212), анти-MHCII-BV711 (107643) и анти-CD103-PE (121406). Анти-CD40-FITC (553723), анти-LY6C-AF700 (557979) и анти-IFN-g-PE (554412) были получены от BD Biosciences. Декстрамер OVA257e264-MHCIPE (JD2163) был приобретен у ImmuDex (Фэрфакс, Вирджиния, США). Наборы ELISA для IL-1b (EM2IL1B) и TNF-a (BMS607-3) были приобретены у Invitrogen, а наборы ELISA для CCL5 (DY478) и IFN-b (DY8234) были получены от R&D Systems. , Inc. (Миннеаполис, Миннесота, США). Антитела для вестерн-блот-анализа, включая анти-MAVS (4983), анти-STING (13647), анти-TBK1 (3504), антифосфо-TBK1 (5483), анти-b-актин (4970) и анти-GAPDH (5174) были приобретены у Cell Signaling Technology, Inc. (Данверс, Массачусетс, США).

Рисунок 1. Получение и характеристика частиц мРНК. (A) Схематическое изображение приготовления частиц вакцины. (B) Электрофорез в агарозном геле показывает, что молекулы мРНК удерживались в лунке для загрузки образцов в образцах, приготовленных с использованием мРНК/протамина в соотношении от 1:1 до 1:2. (CeF) Характеристика мРНК вакцинных частиц (MVP) на основе процента инкапсуляции, индекса полидисперсности, зета-потенциала и размера. (G) Репрезентативные TEM-изображения частиц MVP2, масштабная линейка Z 5 0 нм. (H) Процент экспрессии eGFP после обработки клеток DC2.4 eGFP-MVP в течение 16 часов. (I) Флуоресцентная визуализация клеток DC2.4, экспрессирующих eGFP, масштабная линейка Z 400 мм. (J) Количественный анализ биолюминесценции в BMDC, обработанных MVP, инкапсулированных мРНК, кодирующей люциферазу, в течение 16 часов. (K) Изменения жизнеспособности BMDC, обработанных PBS, носителем без мРНК, ядром мРНК/протамина или MVP2, инкапсулированным в мРНК. Концентрации лечения были эквивалентны мРНК. Данные представлены как среднее значение SEM (n Z 3). *Р <0,05; **Р <0,01.

2.2. Клеточные линии и клеточная культура

Линия мышиных дендритных клеток DC2.4 была получена из ATCC (Манассас, Вирджиния, США) и культивировалась в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина. Линия клеток мышиной меланомы B16-OVA была приобретена у доктора Кеннета Рока, Институт рака Дана-Фарбер (Бостон, Массачусетс, США). Клетки B16-OVA культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина. Клеточная линия MC38 аденокарциномы толстой кишки мышей была приобретена у ATCC. Клетки были сконструированы с экспрессией OVA и культивированы в DMEM с 10% FBS и 1% пенициллином-стрептомицином. Культуру клеток поддерживали при 37°С с 5% CO2.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

2.3. Приготовление вакцинных частиц мРНК

Все частицы вакцины мРНК были приготовлены с использованием микрофлюидного прибора NanoAssemblr Benchtop от Precision Nanosystems, Inc. (Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) путем смешивания органической фазы и водной фазы. Для приготовления органической фазы EDOPC (20 мг/мл), DOPE (20 мг/мл), холестерин (10 мг/мл) и бис-DSPE-PEG2k (2 мг/мл) растворяли в этаноле и смешивали при 34°С. Соотношение М:30:35:1 со скоростью потока 9 мл/мин. Для приготовления ядра мРНК в водной фазе мРНК смешивали с сульфатом протамина в соотношении 1:1 (по массе) в микрофлюидном приборе со скоростью потока 9 мл/мин. После 20-минутной инкубации при 20°C ядро ​​мРНК в водной фазе смешивали с органической фазой для получения частиц вакцины мРНК. Через 20 минут суспензию частиц вакцины переносили в ультрацентробежный фильтр Amicon (MWCO 30 кДа) и добавляли 9-воду молекулярной чистоты для разбавления концентрации этанола с 25% до 2,5%. Затем суспензию частиц концентрировали центрифугированием при 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при 4°С. К концентрированному продукту добавляли равный объем 2 PBS для регулирования осмотического давления.

2.4. Анализ замедления геля

Ядро мРНК/протамина сначала анализировали методом замедления в геле. Вкратце, ядро ​​мРНК/протамина, содержащее 0,5 мг мРНК, загружали в лунку 1% агарозного геля в 1 растворе ТВЕ и проводили электрофорез при 120 В в течение 30 минут (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Геркулес, Калифорния). Полосы РНК окрашивали Gelred (Biotium, Хейворд, Калифорния) и детектировали с помощью системы GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Характеристика частиц мРНК вакцины

Распределение по размерам и дзета-потенциал измеряли с помощью динамического светорассеяния Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Вестборо, Массачусетс, США). Скорость инкапсуляции определяли с использованием набора для анализа РНК Quant-iT™ RiboGreen™. Вкратце, образец частиц вакцины, содержащий 0,5 мг мРНК, разводили буфером TriseEDTA (10 ммоль/л TriseHCl, 1 ммоль/л ЭДТА, pH 7,5) с 2% Triton-X100 или без него в { {10}}луночный планшет. После 10 минут инкубации при 37°С в каждую лунку добавляли RiboGreen и измеряли интенсивность флуоресценции. Эффективность инкапсуляции рассчитывали, как показано в уравнении. (1): Просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) частиц вакцины проводили в соответствии с ранее описанной процедурой9.

2.6. Животные

Все операции с животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Хьюстонской методистской больницы (номер протокола AUP06200042). Мышей содержали в среде, которая полностью соответствовала нормативным стандартам Национального института здравоохранения и стандартам Американской ассоциации ухода за лабораторными животными. Мыши C57BL/6J дикого типа и генно-инженерные мыши, включая мышей Tlr7/, Sting/, Mavs/ и Trif/, были приобретены в лаборатории Джексона.

2.7. Генерация мышиных дендритных клеток костного мозга (BMDC)

Клетки костного мозга вымывали из бедренной и большеберцовой кости с помощью полного RPMI 1640. Эритроциты лизировали буфером для лизиса ACK, а незрелые клетки костного мозга культивировали в RPMI 1640, дополненном 20 нг/мл рекомбинантного мышиного GM-CSF в течение 10 дней при 37 C с 5% CO2. Среду для культивирования клеток обновляли на 3, 6 и 8 дни, а неприкрепившиеся дендритные клетки собирали на 10 день.

2.8. Измерение цитокинов и хемокинов

BMDC высевали в 24-луночный планшет с плотностью 5  105 клеток/лунку. После 1 часа поселения клетки обрабатывали имиквимодом в концентрации 1 мг/мл, частицами вакцины 20 30 -cGAMP в концентрации 20 мг/мл (эквивалент мРНК 1 мг/мл) или контрольными частицами. Среду для культивирования клеток собирали через 24 часа, а уровни TNF-a, CCL5, IFN-b и IL-1b измеряли с использованием наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) в соответствии с процедурами, предложенными производителем.

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

2.9. Анализ трансфекции ДК, созревания ДК и стимуляции.

Для анализа эффективности трансфекции DC in vitro клетки DC2.4 высевали из расчета 2,5 105 клеток на лунку в 24-луночном планшете. Клетки обрабатывали частицами, инкапсулированными в мРНК, кодирующими eGFP или люциферазу, в конечной концентрации 1 мг мРНК/мл. Клетки собирали через 24 часа, промывали 2% FBS в растворе PBS, а затем ресуспендировали в том же растворе перед применением для анализа проточной цитометрии с помощью проточного цитометра BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния). . Для измерения созревания DC и презентации антигена in vitro BMDC высевали по 2,5  105 клеток на лунку в 24-луночном планшете и обрабатывали 1 мг/мл OVA-MVP в течение 24 часов. BMDC окрашивали в течение 30 минут антителами, специфичными к CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 и CD86 для созревания DC и анти-H-2Kb (SIINFEKL) для презентации антигена. Чтобы определить стимулирующую эффективность in vivo, мышей C57BL/6J однократно вакцинировали 10 мг OVA-MVP на мышь в подушечке лапы и собирали дренирующие подколенные ЛУ 24, 48 и следующие маркеры клеточной поверхности: CD11c, MHC I, CD11b, B220. , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Анализ проточной цитометрии на активацию и пролиферацию Т-клеток

Для измерения активации Т-клеток in vivo мышей однократно вакцинировали 10 мг OVA-MVP и через 24 или 48 часов выделяли подколенные ЛУ. Т-клетки окрашивали следующими антителами: CD45, CD3, CD4, CD8 и CD69. Для обнаружения антигенспецифических Т-клеток опухоли, селезенку и подколенные лимфатические узлы собирали через 5 дней после второй вакцинации. Ткани обрабатывали для получения одноклеточных суспензий, а клетки окрашивали Т-клеточно-специфичными антителами и декстрамером OVA257e264-MHCI в соответствии с инструкциями производителя. Для измерения внутриклеточного уровня IFN-g 2  106 спленоциты или клетки, выделенные из подколенных ЛУ и опухолей, стимулировали 10 мг/мл пептида OVA257e264 в полной среде RPMI 1640, дополненной 55 ммоль/л b-меркаптоэтанола и 1 ингибитором белкового переносчика. коктейль на 18 часов. Клетки собирали и окрашивали Т-клеточно-специфичными антителами. После фиксации и пермеабилизации с помощью набора Cytofix/Cytoperm клетки окрашивали антителом против IFN-g и наносили на анализ на проточном цитометре BD LSR II (BD Biosciences). Для измерения пролиферации Т-клеток Т-клетки выделяли из селезенки трансгенных мышей OT-I с использованием набора для выделения мышиных Т-клеток. Их окрашивали 1 ммоль/л CFSE в RPMI 1640, содержащем 200 мг/мл BSA, в течение 10 минут при 37°C. Т-клетки, меченные CFSE, дважды промывали 5 объемами холодного полного RPMI 1640. Тем временем зрелые BMDC обрабатывали MVP, инкапсулированный мРНК OVA, в дозе 2 мг/мл в течение 24 часов перед выделением Т-клеток. Когда Т-клетки были готовы, BMDC и Т-клетки совместно культивировали в соотношении 1:5 (ДК:Т) в течение 72 часов. Клетки собирали и окрашивали поверхностными антителами к Т-клеткам, пролиферацию тестировали с использованием проточного цитометра BD LSR II (BD Biosciences) и анализировали. Все результаты проточной цитометрии анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo v10 (Ашленд, Огайо, США).

2.11. Отслеживание экспрессии белка у живых мышей

Мышам BALB/c вводили в подушечку лапы инъекцию 10 мг MVP, инкапсулированного в мРНК Luc. Им вводили внутрибрюшинно 30 мг D-люциферина RediJect на мышь через 6, 12, 24 или 48 часов и измеряли биолюминесценцию с помощью системы визуализации Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Хопкинтон, Массачусетс, США).

2.12. ELISpot-анализ

Планшеты IP-фильтра предварительно промывали 50 мл 35% этанола и тщательно промывали 3 раза PBS перед испарением этанола. Затем планшеты покрывали захватывающими антителами против IFN-g при 4°C в течение ночи. Планшеты блокировали полной средой RPMI 1640, содержащей 55 ммоль/л b-меркаптоэтанола, на 2 ч при 37°С. Клетки (1  105 спленоциты, 1  105 клетки из подколенного ЛУ) высевали в каждую лунку и стимулировали в течение 36 часов пептидом OVA257e264 в концентрации 10 мг/мл. Среду отбрасывали, а клетки промывали 4 раза PBST (PBS, содержащий 0,05% Tween 20) и дважды PBS. После окончательной промывки добавляли детектирующее антитело против IFN-g и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Планшеты промывали 4 раза PBST и дважды PBS, добавляли авидин-HRP и инкубировали еще 45 минут при комнатной температуре в темноте. Наконец, планшеты промывали PBST и еще раз PBS, как описано выше, наносили 50 мл субстрата AEC и наблюдали за точечной реакцией. Когда пятна становились видимыми, реакцию останавливали, удаляя субстрат АЭК и промывая его бидистиллированной водой 5 раз. После сушки на воздухе в течение ночи планшеты сканировали и анализировали с использованием анализатора CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Кливленд, Огайо, США).

2.13. Вестерн-блот-анализ

BMDC, полученные от мышей дикого типа, Mavs KO или Sting KO, собирали и клетки лизировали в буфере для лизиса клеток RIPA, дополненном ингибиторами протеазы и фосфатазы. Концентрацию белка в клеточном лизате измеряли с помощью набора для анализа белка BCA. Образцы белка разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF). Экспрессию MAVS и STING обнаруживали после инкубации мембраны с антителом против MAVS или против STING в разведении 1:2000 с последующим иммунодетектированием с помощью SuperSignal West Pico и фемтохемилюминесцентного субстрата. Для измерения активации пути STING BMDC, полученные от мышей дикого типа, обрабатывали носителем или MVP, инкапсулированным в мРНК OVA, в указанной концентрации в течение 2 часов. Клетки лизировали и подвергали вестерн-блот-анализу с антителами против ТБК1 и антифосфо-ТБК1 в разведении 1:2000.

2.14. Противоопухолевый анализ

Мышиные модели опухолей были созданы путем инокуляции 2  105 клеток B16-клеток меланомы OVA или 5  105 клеток MC38-OVA на мышь подкожно в левый бок от 6 до {{5} } самки мышей C57BL/6J недельного возраста. Мышей случайным образом распределяли по группам лечения и дважды обрабатывали с интервалом в 7 дней 10 мг OVA MVP или контрольной группы в подушечке лапы. Рост опухоли контролировали каждые 2 дня. Объем опухоли рассчитывали по формуле. (2):

Мышей умерщвляли через 5 дней после второй вакцинации и регистрировали массу опухолевых тканей.

2.15. статистический анализ

Все результаты представлены как среднее значение SEM. Статистические данные оценивались с помощью одностороннего теста ANOVA с использованием поправки Тьюки для сравнения нескольких групп и непарного двустороннего t-критерия для сравнения двух групп. Данные анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 считалось статистически значимым (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Результаты

3.1. MVP опосредует надежную экспрессию мРНК в дендритных клетках (DC)

Мы подготовили частицы вакцины ядро-оболочка с помощью двухэтапного микрофлюидного подхода (рис. 1А) и систематически оценивали отдельные компоненты наночастиц, чтобы собрать частицу вакцины с высокой стабильностью, высоким клеточным поглощением и высоким потенциалом экспрессии в ДК. Гель-электрофорез показал, что стабильное ядро ​​мРНК может образовываться, когда соотношение мРНК к протамину становится равным 1 или ниже (рис. 1B). Используя мРНК, кодирующую eGFP, в качестве суррогатного маркера, мы обнаружили, что липидная композиция при молярном соотношении 34% EDOPC/30% DOPE/35% холестерина/1% DSPEPEG2k обеспечивает идеальную скорость инкапсуляции и наилучшую эффективность экспрессии (таблица 1, Вспомогательная информация Рис. S1AeS1D). Изменение соотношения зарядов существенно не изменило скорость инкапсуляции, индекс полидисперсности или поверхностный заряд частиц (таблица 2, рис. 1CeE); однако размер полученных частиц составлял от 70 до 80 нм в диаметре, когда соотношение составляло от 12 до 16, по сравнению с диаметром 120–130 нм, когда соотношение выходило за пределы диапазона (рис. 1F и G). Наилучшая экспрессия была обнаружена в клетках DC2.4, обработанных MVP2, которые имели соотношение зарядов 12 (рис. 1H и I). Аналогичная картина наблюдалась, когда были приготовлены частицы с мРНК, кодирующей люциферазу, и была обнаружена дозозависимая экспрессия (рис. 1J). Частицы, инкапсулированные в мРНК, продемонстрировали желаемую стабильность, поскольку они не теряли активности после лиофилизации или замораживания-оттаивания (рис. S1E и S1F). Кроме того, цитотоксичности не наблюдалось после обработки дендритных клеток костномозгового происхождения (BMDC) только ядром мРНК, частицами носителя, приготовленными без молекул мРНК, или мРНК-содержащим MVP2 (рис. 1K). Таким образом, MVP2 продемонстрировал лучший потенциал экспрессии. Он использовался для всех дальнейших экспериментов в исследовании и в остальной части текста помечен как MVP. Частицы MVP могли эффективно доставлять молекулы мРНК in vivo, и не было обнаружено никакой обнаруживаемой токсичности со стороны MVP, инкапсулированного в мРНК, на основании изменений массы тела (рис. S1GeS1I).

3.2. MVP эффективно индуцирует презентацию антигена и активацию Т-клеток in vitro и in vivo.

Мы подготовили ядро ​​мРНК, носитель без мРНК и MVP, инкапсулированный мРНК OVA, и применили их для проверки созревания DC и презентации антигена (рис. 2A). BMDC, обработанные MVP, демонстрировали дозозависимую сверхэкспрессию маркеров созревания DC, включая CD40, CD80 и CD86 (рис. 2BeD). Обработка носителем, не содержащим мРНК, или MVP, инкапсулированным в мРНК, вызывала сверхэкспрессию MHC I (рис. 2E), указывая на то, что эффект был связан с носителем, а не с комплексом мРНК. Кроме того, обработка MVP привела к отображению на клеточной поверхности комплекса антиген-эпитоп OVA257e264-MHC I (SIINFEKL-MHC I), который был обнаружен с помощью антитела против SINFEKL-MHCI (рис. 2F), демонстрируя эффективный процессинг и презентацию антигена BMDC. . Кроме того, совместная инкубация BMDC, обработанных MVP, с B3Z, линией CD8+ Т-клеток, которая специфически распознает эпитоп OVA257e264, или Т-клетками, выделенными из селезенки мыши OT-I, которые экспрессируют OVA257e264-специфические Т-клетки. рецептор, запускал секрецию IL-2, результат не наблюдался в Т-клетках, совместно инкубированных с DC, обработанными только носителем или только ядром мРНК/протамина (рис. 2G). Анализ проточной цитометрии выявил 32,5% пролиферативных CD8+ Т-клеток после совместной инкубации с MVP (рис. 2H и I). Частицы MVP, инкапсулированные мРНК OVA, также применялись для лечения мышей путем внутрикожной инъекции. Исследование клеток дренирующих лимфатических узлов выявило устойчивое увеличение экспрессии CD86 как среди классических ДК (CD8+ ДК, CD11b+ ДК, CD103+ ДК), так и среди плазмоцитоидных ДК (pDC) в течение первых 48 часов, что указывает на стимуляцию ДК. созревание (рис. 2J). Лечение также способствовало обогащению CD8+ Т-клеток в лимфатических узлах со значительным увеличением популяции CD69+CD8+ Т-клеток (рис. 2K и L), что указывает на активацию Т-клеток в результате лечения. Чтобы определить активацию Т-клеток, мы собрали клетки в дренирующих лимфатических узлах через 3, 5 или 7 дней после лечения MVP и провели анализ ELISpot после того, как клетки были заражены антигенным пептидом OVA257e264 (вспомогательная информация, рис. S2). Лечение MVP за это время вызвало большой скачок количества клеток, секретирующих IFN-g, с пиковой активностью на 5-й день (рис. 2M). Эти результаты продемонстрировали надежную стимуляцию DC, презентацию антигена и активацию Т-клеток после лечения MVP.

Таблица 1. Состав наночастиц, инкапсулированных мРНК, кодирующей eGFP.

Таблица 2Липидный состав и соотношение зарядов MVPчастицы.

3.3. MVP вызывает мощный противоопухолевый иммунитет на мышиных моделях колоректальной опухоли и меланомы

MVP применяли для лечения мышей с раком толстой кишки MC38 и меланомой B16. В обеих моделях лечение мРНК OVA, инкапсулировавшей MVP, дважды полностью блокировало подкожный рост опухоли; для сравнения, лечение MVP, инкапсулированным в мРНК eGFP, или одним носителем не оказывало какого-либо заметного ингибирующего эффекта на рост опухоли (рис. 3AeD, вспомогательная информация, рис. S3). В соответствии с паттерном сдвига CD4 на CD8 в лимфатических узлах (рис. 2), мы наблюдали увеличение соотношения CD8+/CD4+ Т-клеток в опухолях мышей, получавших MVP, инкапсулированный мРНК OVA (рис. 3E). Кроме того, мы обнаружили повышенные уровни IFN-g+CD8+ T-клеток в селезенке, лимфатических узлах и опухолях у мышей, получавших MVP, инкапсулированный в мРНК OVA, но не только носитель или MVP, инкапсулированный в мРНК GFP (рис. 3FeH, вспомогательная информация). Рис. S4). Кроме того, наблюдалось значительное увеличение количества OVA257e264-MHCI декстрамер-положительных CD8+ Т-клеток в опухолях из группы лечения MVP, инкапсулированной в мРНК OVA, что указывает на пролиферацию антигенспецифичных CD8+ Т-клеток (рис. 3I). Анализ ELISpot с клетками, выделенными из селезенки и лимфатических узлов, обеспечил дополнительную поддержку активации Т-клеток (рис. 3JeM).

3.4. MVP стимулирует врожденные иммунные реакции путем активации STING-зависимой передачи сигналов.

Мы применили ядро ​​мРНК, носитель без мРНК и MVP, инкапсулированный в мРНК, для лечения BMDC, чтобы идентифицировать ключевые факторы и пути, ответственные за стимуляцию IFN типа I и экспрессию воспалительных цитокинов. Интересно, что MVP был столь же эффективен в стимуляции секреции IFN-b, как и имиквимод, агонист Tlr7, а сам носитель также проявлял активность в стимулировании секреции IFN-b, хотя его эффективность была не такой высокой, как у MVP; однако ядро ​​мРНК само по себе было неэффективно в стимуляции секреции IFN-b (рис. 4А). Результат подразумевал, что как мРНК, так и компоненты носителя необходимы для максимизации экспрессии IFN-b. Между тем, имихимод и носитель продемонстрировали сходную активность в стимулировании экспрессии TNF-a и IL-1b, тогда как MVP был гораздо более эффективным, чем любой из них (рис. 4B и C). Экспрессия CCL5, цитокина, обычно связанного с регуляторными факторами NF-kB и IFN, в равной степени стимулировалась в клетках, обработанных имихимодом, только носителем или MVP (рис. 4D). TLR7, MAVS, STING и TRIF являются ключевыми факторами основных путей передачи сигнала, которые опосредуют клеточные ответы на вирусную РНК и поврежденную ДНК28e30. Мы получили BMDC от мышей с нокаутом генов Tlr7, Mavs, Sting или Trif (KO) и обработали клетки ядром мРНК, носителем без мРНК или инкапсулированным в мРНК MVP для изучения экспрессии IFN-b и TNF-a.

Рисунок 2. Стимуляция иммунных ответов MVP. (A) Схематическое изображение ядра мРНК/протамина, носителя без мРНК и полного MVP. (BeD) Созревание BMDC после обработки OVA-MVP в течение 24 часов. (E и F) Экспрессия MHC I и комплекс антиген-эпитоп OVA257e264-MHC I в BMDC после обработки OVA-MVP в течение 24 часов. (G) Уровень IL-2 из обработанных BMDC, совместно инкубированных с Т-клетками B3Z или OT-I. (H и I) Анализ пролиферативных Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Показаны репрезентативные хроматограммы Т-клеток. (J) Созревание DC после лечения MVP in vivo. Мышам C57BL/6J вводили OVA-MVP и анализировали ДК в подколенных лимфатических узлах. (K и L) Анализ популяции Т-клеток. Мышам C57BL/6J вводили носитель или OVA-MVP, а Т-клетки в подколенных лимфатических узлах анализировали с помощью проточной цитометрии. (М) Анализ ELISpot. Мышам C57BL/6J вводили OVA-MVP и собирали лимфатические узлы в указанные моменты времени. Изолированные клетки применяли для измерения клеток, экспрессирующих IFN-g. Данные представлены как среднее значение SEM (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***Р <0,005; ****Р <0,001; нс, не существенно.

Рисунок 3. Противоопухолевая активность MVP. (А) Ингибирование роста опухоли MC38-OVA. Самкам мышей C57BL/6J подкожно инокулировали опухолевые клетки 5  105 MC38-OVA на мышь в день 0 и обрабатывали контрольным PBS, контрольным носителем, GFP-MVP или OVA-MVP на Дни 3 и 10. (Б) Ингибирование роста опухоли B16-OVA. Самкам мышей C57BL/6J подкожно инокулировали опухолевые клетки 2  105 B16-OVA/мышь в день 0 и обрабатывали контрольным PBS, контрольным носителем, GFP-MVP или OVA-MVP. в дни 3 и 10. (C и D) Изображение и вес опухолей B16-OVA на 17-й день. (E) Популяция Т-клеток в опухолях мышей после лечения. (FeH) IFN-g+CD8+ Т-клетки в селезенке, лимфатических узлах (LN) и опухолях мышей после лечения. (I) OVA-специфичные CD8+ Т-клетки в опухолях мышей после лечения. (JeM) Изображения и количественный анализ ELISpot-анализа клеток селезенки и LN мышей после лечения. Данные представлены как среднее значение SEM (n Z 5). *P < 0.05; **Р <0,01; ***Р <0,005; ****Р <0,001.

Статус нокаута Mavs и Sting в BMDC был подтвержден с помощью вестерн-блот-анализа (вспомогательная информация, рис. S5A). Удивительно, но Sting KO уничтожил стимулирующую активность секреции IFN-b как со стороны носителя, так и с MVP (рис. 4E), указывая на то, что MVP активировал экспрессию IFN типа I посредством STING. Чтобы подтвердить эту идею, мы обнаружили фосфорилирование танк-связывающей киназы 1 (TBK1) (рис. S5B), киназы, которая обычно связана с активностью STING31. Кроме того, этот путь не зависел от передачи сигналов TLR7, поскольку экспрессия IFN-b не нарушалась в клетках, обработанных имихимодом (рис. 4E). Для сравнения, Trif или Mavs KO оказывали минимальное влияние на экспрессию IFN-b, стимулируемую MVP. Как и ожидалось, имихимод оказался неэффективен в стимуляции секреции IFN-b в BMDC, происходящих из Tlr7 KO; однако Tlr7 KO отрицательно влиял на стимулирующий эффект ПМК (рис. 4Д). Интересно, что при одном и том же лечении наблюдался другой профиль секреции TNF-α. Нокаут Sting, Trif или Tlr7 не оказывал минимального влияния на экспрессию цитокинов, стимулируемую MVP. С другой стороны, нокаут Mavs резко снижал уровни TNF-a в клетках, обработанных либо одним носителем, либо MVP (рис. 4F). Результат показывает, что MAVS является ключевым регулятором экспрессии TNF-a в ДК при лечении MVP.

3.5. MVP стимулирует пути STING и MAVS, способствуя секреции IFN-I и воспалительных цитокинов.

Чтобы идентифицировать компоненты транспортного средства, ответственные за стимуляцию передачи сигналов STING и MAVS, мы подготовили транспортные средства и MVP, заменив или исключив ключевые компоненты, и применили их для лечения BMDC. Агонист Sting циклический GMP-AMP (cGAMP) служил положительным контролем при стимуляции секреции IFN-b. Замена катионного липида EDOPC в носителе на другой положительно заряженный липид, DOTAP, полностью уничтожила секрецию IFN-b. Для сравнения, стимулирующий эффект носителя и MVP сохранялся с протамином или без него, и такая стимулирующая активность зависела от интактного гена Sting (рис. 4G). Интересно, что BMDC, обработанные отдельными компонентами липидной оболочки, включая EDOPC, не способствовали сильной секреции IFN-b (вспомогательная информация, рис. S6). Таким образом, EDOPC необходим для активации STING, и его активность зависит от образования липидных наночастиц (т.е. носителя или MVP). Носитель и MVP, приготовленные с помощью EDOPC или DOTAP, также применяли для лечения BMDCS, полученного от мышей дикого типа и Mavs KO, и определяли уровни TNF в средах для роста клеток. Как и ожидалось, замена EDOPC на DOTAP или DOPC устранила стимулирующее усилие со стороны транспортного средства и MVP. Кроме того, уровень TNF-a был значительно снижен в клетках Mavs KO по сравнению с клетками дикого типа, но не уменьшался (рис. 4H), что указывает на то, что дополнительные факторы могут быть вовлечены в опосредование MVP-стимулированной экспрессии TNF-a.

3.6. Путь STING важен для MVP-опосредованного противоопухолевого иммунного ответа.

Мышам как дикого типа, так и нокаутным мышам вводили MVP, инкапсулированный в мРНК OVA, и исследовали созревание DC и пролиферацию Т-клеток. Стинг КО значительно снизил процент CD80+ и CD86+ DC-клеток и CD69+ Т-клеток (рис. 5AeD). Анализ ELISpot выявил значительное снижение количества клеток, продуцирующих IFN-g, в селезенке и лимфатических узлах мышей Sting KO по сравнению с мышами дикого типа после лечения той же дозой MVP (рис. 5EeH). Влияние Mavs KO было минимальным, поскольку не наблюдалось различий в CD44+CD8+ Т-клетках памяти, OVA257e264-MHCI-декстрамер-положительных CD8+ Т-клетках или количестве IFN-g-продуцирующих клеток в лимфатических узлах по сравнению с дикими. типа мышей (рис. 5IeL). Этот результат подтверждает мнение о том, что дополнительные факторы, помимо MAVS, могут быть вовлечены в стимулируемую MVP экспрессию воспалительных цитокинов. Мышей дикого типа и Sting KO применяли для инокуляции опухолей B16-OVA, а мышей обрабатывали контрольным PBS или MVP, инкапсулированным мРНК OVA. Анализ проточной цитометрии образцов лимфатических узлов и опухолей, собранных у вакцинированных мышей, выявил значительно уменьшенное количество CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-g, у мышей Sting KO (рис. 6A и B). В результате рост опухоли был полностью ингибирован у мышей дикого типа, получавших MVP, по сравнению с частичным ингибированием у мышей Sting KO (рис. 6C).

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Дискуссия

В текущем исследовании мы систематически изучали функциональную роль отдельных компонентов ПМК в стимуляции противоопухолевых иммунных ответов. Наше клеточное исследование ясно продемонстрировало, что как молекулы мРНК, так и свободный от РНК носитель в ПМК необходимы для его полной активности в стимулировании экспрессии IFN-b и ряда воспалительных цитокинов, включая IL-1b и TNF. -а в дендритных клетках. Было показано, что такие цитокины играют важную роль в активации дендритных клеток и вакцино-опосредованном противоопухолевом иммунитете20. Наше исследование также показало, что стимуляция выработки цитокинов зависит от ряда ключевых путей передачи сигнала, участвующих в чувствительности врожденного иммунитета, в том числе опосредованных STING и MAVS. Хотя STING необходим для экспрессии IFN-b, MAVS в основном участвует в регуляции экспрессии TNF-a (рис. 6D). Значение передачи сигналов STING для противоопухолевого иммунитета, опосредованного MVP, дополнительно демонстрируется снижением активности Т-клеток и, как следствие, нарушением ингибирования роста опухоли у мышей Sting KO. Этот результат согласуется с другими сообщениями о том, что активация STING определяет противоопухолевый иммунитет, опосредованный цитотоксическими Т-клетками32. MAVS является ключевым посредником в передаче сигналов рецептора RIG-I (RLR) в ответ на вирусную инфекцию. Активация этого пути приводит к каскаду воспалительных реакций33. Интересно, что активность Т-клеток не нарушена у мышей Mavs KO, учитывая, что передача сигналов MAVS явно играет большую роль в регуляции экспрессии воспалительных цитокинов, включая TNF-a. Возможная причина заключается в том, что стимуляция таких цитокинов с помощью MVP опосредована несколькими путями, а нарушение пути MAVS не снижает экспрессию цитокинов до достаточно низкого уровня, чтобы вызвать значительный эффект. Альтернативно, потеря передачи сигналов MAVS компенсируется другими путями. Необходимы дальнейшие исследования для выявления этих путей и дальнейшего понимания механизма действия вакцины MVP. Хотя TLR7 традиционно ассоциировался с мРНК-терапией21, передача сигналов TLR7, по-видимому, не играет основной роли в обеспечении активности MVP. Применение полностью метилированных молекул мРНК в текущем исследовании могло сделать передачу сигналов TLR7 менее актуальной. Было хорошо продемонстрировано, что метилирование РНК подавляет узнавание TLR23. TRIF является ключевым белком-адаптером для передачи сигналов TLR3/7/828. Нокаут Trif также не влияет на активность MVP, что подтверждает мнение о том, что вышеупомянутые TLR, включая TLR7, не играют основной роли в опосредовании клеточных ответов на MVP. При разработке вакцин против рака применялись множественные агонисты Sting, включая циклические динуклеотиды, а также низко- и крупномолекулярные соединения34e37. Такие агонисты Sting необходимо добавлять в качестве внешних адъювантов во время приготовления вакцины, что еще больше усложняет композицию вакцины. Кроме того, добавленный извне агонист Sting может вызывать нежелательные побочные эффекты после его отделения от комплекса мРНК. Для сравнения, наш MVP служит самоадъювантом и работает в контексте вакцины против рака, поскольку ни один из отдельных компонентов вакцины, включая EDOPC, не может стимулировать экспрессию цитокинов. Интересно, что катионный фосфолипид EDOPC нельзя заменить нефосфолипидным DOTAP, который также заряжен положительно. Интересно предположить потенциальный механизм различия между этими двумя катионными липидами. Однако было документально подтверждено, что другие свойства компонента липидной молекулы, такие как гидрофобность, могут оказывать глубокое влияние на общую функцию наночастицы и эффективность ее доставки нуклеиновых кислот38. Таким образом, необходимо проявлять осторожность при выборе подходящих молекул для приготовления полнофункциональной мРНК-вакцины. Таким образом, мы разработали мощную терапевтическую вакцину против рака на основе мРНК и присвоили отдельным компонентам вакцины их функциональность. Его механизм действия сильно отличается от механизма действия других мРНК-платформ, используемых для профилактических и терапевтических мероприятий. Знания, полученные в результате текущего исследования, определенно будут определять будущую разработку дополнительных терапевтических средств с использованием мРНК.

Рисунок 4. Стимулирование врожденного иммунного ответа с помощью MVP. (AeD) BMDC, обработанные имиквимодом в дозе 1 мг/мл, ядром, эквивалентным мРНК, в концентрации 1 мг/мл, носителем или MVP в течение 24 часов. Уровни IFN-b, TNF-a, IL-1b и CCL5 измеряли с помощью ELISA. (E и F) Экспрессия IFN-b и TNF-a BMDC, полученных от мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена (KO). КМДК обрабатывали указанными реагентами в течение 24 ч. IFN-b и TNF-a измеряли с помощью ELISA. (G) IFN-b в BMDC, полученных от мышей дикого типа и нокаутных мышей Стинга. BMDC обрабатывали 20 мг/мл цГАМФ, 1 мг/мл эквивалентного мРНК ядра, носителя или MVP в течение 24 часов. Транспортное средство (DOTAP): подготовлено путем замены EDOPC на DOTAP; носитель (без протамина): получен без протамина. НД: не обнаруживается. (H) TNF-a в BMDC, полученных от мышей дикого типа и мышей с нокаутом Mavs. BMDC обрабатывали 1 мг/мл мРНК-эквивалентным ядром, носителем или MVP в течение 24 часов. Транспортное средство (DOTAP): подготовлено путем замены EDOPC на DOTAP; транспортное средство (DOPC): подготовлено путем замены EDOPC на DOPC. Данные представлены как среднее значение SEM (n Z 3). ***P < 0.005; ****Р <0,001; нс, не существенно.

Рисунок 5. Противоопухолевые иммунные реакции у нокаутных мышей Sting и Mavs. (AeD) Снижение активации DC и Т-клеток у мышей, нокаутированных по Стингу. Мышам как дикого типа, так и мышам с нокаутом Стинга вводили MVP, инкапсулированный в мРНК OVA, а лимфатические узлы собирали через 48 часов для измерения DC и Т-клеток. (EeH) Снижение Т-клеток, экспрессирующих IFN-g, в селезенке и лимфатических узлах мышей, нокаутных по Стингу. Показаны как изображения пятен, так и количественные анализы. (IeL) Никакого влияния на активность Т-клеток у мышей, нокаутных по Mavs. Мышей как дикого типа, так и мышей с нокаутом Mavs обрабатывали контрольным PBS или MVP, инкапсулированным в мРНК OVA, а через 48 часов собирали лимфатические узлы для измерения CD44+CD8+ Т-клеток памяти (I), OVA257e264-MHCI декстрамер-положительных CD8+. Т-клетки (J) и количество клеток, продуцирующих IFN-g (K и L). Данные представлены как среднее значение SEM (n Z 3 или 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***Р <0,005; ****Р <0,001; нс, не существенно.

Рисунок 6. Зависимый от укуса противоопухолевый иммунитет. (A и B) Анализ Т-клеток, экспрессирующих IFN-g, в лимфатических узлах и опухолевых тканях после того, как мышам дикого типа и нокаутным мышам Sting с опухолями B16-OVA вводили MVP, инкапсулированный мРНК OVA. Мышей лечили в дни 3 и 10, а лимфатические узлы и опухоли собирали в день 15. Отдельные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. (C) Ингибирование роста опухоли у мышей дикого типа и мышей, нокаутных по Sting. Мышам вводили контрольный PBS или MVP в дни 3 и 10. Данные представлены как среднее значение SEM (n Z 5). *Р <0,05; ****Р <0,001; нс, не существенно. (D) Схематическое изображение стимуляции MVP путей передачи сигнала, ведущих к выработке цитокинов в ДК. Хотя стимуляция экспрессии IFN-b опосредуется исключительно STING, существует множество факторов, включая MAVS, которые опосредуют экспрессию TNF-a и IL-1b.

Рекомендации

1. Эль Сахли Х.М., Баден Л.Р., Эссинк Б., Доблеки-Льюис С., Мартин Дж.М., Андерсон Э.Дж. и др. Эффективность мРНК-1273 вакцины против SARS-CoV-2 по завершении слепой фазы. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Морейра-младший Э.Д., Китчин Н., Сюй Х, Дайхтер С.С., Локхарт С., Гуртман А. и др. Безопасность и эффективность третьей дозы вакцины BNT162b2 Covid-19. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Дауди С.Ф. Преодоление клеточных барьеров для РНК-терапии. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Каллис П.Р., Хоуп М.Дж. Системы липидных наночастиц для генной терапии. Мол Тер 2017;25:1467e75.

5. Персано С., Гевара М.Л., Ли З., Май Дж., Феррари М., Помпа П.П. и др. Липополиплекс потенцирует противоопухолевый иммунитет мРНК-вакцинации. Биоматериалы 2017;125:81e9.

6. Ван Ю, Су Х.Х., Ян Ю, Ху Ю, Чжан Л., Бланкафорт П. и др. Системная доставка модифицированной мРНК, кодирующей тимидинкиназу вируса простого герпеса 1, для таргетной генной терапии рака. Мол Тер 2013;21:358e67.

7. Кранц Л.М., Дикен М., Хаас Х., Крайтер С., Локуай С., Рейтер К.С. и др. Системная доставка РНК в дендритные клетки использует противовирусную защиту для иммунотерапии рака. Природа 2016;534:396e401.

8. Мэн С., Чен З., Май Дж., Ши Ц, Тянь С., Хинкль Л. и др. Вирус-миметическая мРНК-вакцина для лечения рака. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Парди Н., Хоган М.Дж., Портер Ф.В., Вайсман Д. МРНК-вакцины — новая эра в вакцинологии. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Рюрик Ю.Г., Томбач И., Ядегари А., Мендес Фернандес П.О., Шевале С.В., Ли Л. и др. CAR Т-клетки производятся in vivo для лечения повреждений сердца. Наука 2022;375:91e6.

11. Эстебан И., Пастор-Хинонс С., Усеро Л., Плана М., Гарсия Ф., Леал Л. Есть ли надежда на функциональное излечение ВИЧ в эпоху мРНК-вакцин? Вирусы 2021;13:501.

12. Криенке С., Колб Л., Дикен Э., Штрайбер М., Кирххофф С., Букур Т. и др. Невоспалительная мРНК-вакцина для лечения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Наука 2021;371:145e53.

13. Мяо Л., Чжан Ю., Хуан Л. мРНК-вакцина для иммунотерапии рака. Мол Рак 2021;20:41.

14. Ван Хекке Л., Вербеке Р., Девитте Х., Лентакер И., Вермален К., Брекпот К. и др. мРНК в иммунотерапии рака: помимо источника антигена. Мол Рак 2021;20:48.

15. Шахин У., Дерхованессян Э., Миллер М., Клок Б.П., Саймон П., Лоуэр М. и др. Персонализированные РНК-мутаномные вакцины мобилизуют полиспецифический терапевтический иммунитет против рака. Природа 2017;547:222e6.

16. Шахин У., Оем П., Дерхованессян Э., Ябуловский Р.А., Формер М., Голд М. и др. РНК-вакцина повышает иммунитет при меланоме, обработанной ингибиторами контрольных точек. Природа 2020;585:107e12.

17. Хильф Н., Куттруфф-Коки С., Френцель К., Букур В., Стеванович С., Гуттефангеас С. и др. Активно персонализированное исследование вакцинации от впервые диагностированной глиобластомы. Природа 2019;565:240e5.

18. Каррено Б.М., Магрини В., Беккер-Хапак М., Каабинеджадиан С., Хундал Дж., Петти А.А. и др. Иммунотерапия рака. Вакцина на основе дендритных клеток увеличивает широту и разнообразие Т-клеток, специфичных для неоантигена меланомы. Наука 2015;348:803e8.

19. Кескин Д.Б., Анандаппа А.Дж., Сан Дж., Тирош И., Мэтьюсон Н.Д., Ли С. и др. Неоантигенная вакцина вызывает внутриопухолевые Т-клеточные ответы в исследовании фазы Ib глиобластомы. Природа 2019;565:234e9.

20. Май Дж, Ли З, Ся Икс, Чжан Дж, Ли Дж, Лю Х и др. Синергическая активация противоопухолевого иммунитета частицами терапевтической вакцины. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Кобияма К, Исии КДж. Понимание врожденного смысла адъювантности мРНК вакцины. Нат Иммунол 2022;23:474e6.

22. Фотин-Млечек М., Дучардт К.М., Лоренц С., Пфайффер Р., Ойкич-Зрна С., Пробст Дж. и др. Вакцины на основе информационной РНК с двойной активностью индуцируют сбалансированные TLR-7-зависимые адаптивные иммунные реакции и обеспечивают противоопухолевую активность. Дж. Иммунотер 2011;34:1e15.

23. Карико К., Бакштейн М., Ни Х., Вайсман Д. Подавление распознавания РНК Toll-подобными рецепторами: влияние нуклеозидной модификации и эволюционное происхождение РНК. Иммунитет 2005;23:165e75.

24. Тахтинен С., Тонг А.Дж., Химмельс П., О Дж., Палер-Мартинес А., Ким Л. и др. IL-1 и IL-1ra являются ключевыми регуляторами воспалительного ответа на РНК-вакцины. Нат Иммунол 2022;23:532e42.

25. Ли С., Ли А., Григорян Л., Аруначалам П.С., Скотт МКД, Трисал М. и др. Механизмы врожденного и адаптивного иммунитета к вакцине PfizerBioNTech BNT162b2. Нат Иммунол 2022;23:543e55.

26. ЛоПрести С.Т., Аррал М.Л., Чаудхари Н., Уайтхед К.А. Замена липидов-хелперов заряженными альтернативами в липидных наночастицах облегчает адресную доставку мРНК в селезенку и легкие. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Чарбе Н.Б., Амнеркар Н.Д., Рамеш Б., Тамбувала М.М., Бакши Х.А., Альджабали ААА и др. Малая интерферирующая РНК для лечения рака: преодоление препятствий при родах. Акта Фарм Син Б 2020;10:2075e109.

28. Фуэртес М.Б., Ву С.Р., Бернетт Б., Фу YX, Гаевски Т.Ф. Реакция интерферона I типа и врожденная иммунная чувствительность к раку. Тенденции Иммунол 2013;34:67e73.

29. Хардинг С.М., Бенчи Дж.Л., Ирианто Дж., Дишер Д.Е., Минн А.Дж., Гринберг Р.А. Митотическая прогрессия после повреждения ДНК позволяет распознавать образы внутри микроядер. Природа 2017;548:466e70.

30. Хартлова А, Эрттманн С.Ф., Раффи Ф.А., Шмальц А.М., Реш У., Анугула С. и др. Повреждение ДНК активирует систему интерферона I типа через цитозольный ДНК-сенсор STING, что способствует развитию врожденного противомикробного иммунитета. Иммунитет 2015;42:332e43.

31. Чжан Цз, Юань Б, Бао М, Лу Н, Ким Т, Лю Ю.Дж. Хеликаза DDX41 распознает внутриклеточную ДНК, опосредованную адаптером STING в дендритных клетках. Нат Иммунол 2011;12:959e65.

32. Сивик К.Е., Десбьен А.Л., Гликман Л.Х., Райнер Г.Л., Корралес Л., Сур Н.Х. и др. Величина терапевтической активации STING определяет опосредованный CD8+ Т-клетками противоопухолевый иммунитет. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Рейкин С., Нгуен Дж.Б., Модис Ю. Распознавание образов и механизмы передачи сигналов RIG-I и MDA5. Фронт Иммунол 2014;5:342.

34. Фу Дж., Канне Д.Б., Леонг М., Гликман Л.Х., МакВиртер С.М., Лемменс Э. и др. Противораковые вакцины на основе агонистов STING могут вылечить уже сформировавшиеся опухоли, устойчивые к блокаде PD-1. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Корралес Л., Гликман Л.Х., МакВиртер С.М., Канне Д.Б., Сивик К.Е., Катиба Г.Е. и др. Прямая активация STING в микроокружении опухоли приводит к мощной и системной регрессии опухоли и иммунитету. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Мяо Л., Ли Л., Хуан Й., Делькассиан Д., Чахал Дж., Хань Дж. и др. Доставка мРНК-вакцин с гетероциклическими липидами повышает противоопухолевую эффективность за счет активации иммунных клеток, опосредованной STING. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Луо М, Ван Х, Ван З, Цай Х, Лу З, Ли Ю и др. Активирующая STING нановакцина для иммунотерапии рака. Nat Nanotechnol 2017; 12: 648e54.

38. Ван Л., Койнова Р., Парих Х., Макдональд Р.К. Трансфекционная активность бинарных смесей катионных о-замещенных производных фосфатидилхолина: гидрофобное ядро ​​сильно модулирует физические свойства и эффективность доставки ДНК. Биофиз Дж 2006;91:3692e706.