Антивозрастное и ингибирующее действие тирозиназы бутанолового экстракта цветка свища кассии, часть 2

Влияние экстракта цветков C. fistula на цитотоксичность клеток фибробластов

Тестирование цитотоксичности экстракта цветков C. fistula на клетках фибробластов измеряли с помощью анализа SRB. Клетки фибробластов обрабатывали экстрактом цветка в различных концентрациях или без него ({{0}}–200 мкг/мл). Было обнаружено, что после обработки в течение 48 часов экстракт цветка не влияет на рост клеток фибробластов кожи (0–200 мкг/мл). Было обнаружено, что IC20 и IC50 экстракта цветков составляют более 200 мкг/мл, что также можно применять в других экспериментах без токсичности (рис. 2).

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и может улавливать активные формы кислорода, предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение анионов свободных радикалов тимина.

Нажмите «Где я могу купить Цистанхе».

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Влияние экстракта цветков C. fistula на синтез коллагена в клетках фибробластов кожи человека

Коллаген играет ключевую роль как в заживлении кожных ран, так и в процессе омоложения кожи. Синтез коллагена из клеток фибробластов кожи осуществляли с использованием набора для окрашивания коллагена Sirius Red/Fast Green. Было обнаружено, что синтез коллагена из клеток фибробластов значительно увеличивался дозозависимым образом после обработки клеток различными концентрациями (100–150 мкг/мл) экстракта цветка (рис. 3).

Влияние экстракта цветков C. fistula на активность коллагеназы

Коллагеназы — это ферменты, расщепляющие нативный коллаген в области тройной спирали. Следовательно, ингибирование активности коллагеназы может защитить от разрушения коллагена. Коллагеназную активность измеряли с использованием флуорогенного анализа DQ™-желатина. Коллагеназная активность резко снижалась в зависимости от дозы после обработки фибробластов цветочным экстрактом. В высоких концентрациях экстракт цветов (200 мкг/мл) мог полностью ингибировать активность коллагеназы (рис. 4).

Влияние экстракта цветков C. fistula на активность MMP-2

MMP-2 представляет собой фермент, участвующий в разрушении внеклеточного матрикса (ECM) и играющий важную роль во влиянии на нормальный гомеостаз, старение и заживление ран кожи. Активность MMP-2 измеряли с помощью желатиновой зимографии. Было установлено, что MMP-2, секретируемый клетками фибробластов кожи, может переваривать желатин в геле. Однако после инкубации геля с различными концентрациями экстракта цветков (50–200 мкг/мл) уровень активности ММП-2 достоверно снижался дозозависимым образом (рис. 5).

Влияние экстракта цветков C. fistula на синтез ГК в клетках фибробластов кожи человека

Синтез ГК из клеток фибробластов кожи оценивали с помощью набора ELISA. После обработки клеток экстрактом цветка в различных концентрациях в течение 48 ч синтез ГК значительно увеличился дозозависимым образом (50–200 мкг/мл). После обработки фибробластов цветочными экстрактами в концентрации 200 мкг/мл синтез ГК индуцировался на четырехкратном уровне по сравнению с необработанными клетками (рис. 6).

Влияние экстракта цветков C. fistula на активность тирозиназы

Тирозиназа представляет собой фермент, участвующий в лимитирующей стадии контроля выработки меланина. Следовательно, ингибирование активности тирозиназы имеет тенденцию вызывать отбеливание кожи из-за снижения синтеза меланина. Когда фермент тирозиназу инкубировали с экстрактом цветка, он мог ингибировать активность тирозиназы дозозависимым образом при концентрации 50–200 мкг/мл (рис. 7).

Антиоксидантная активность экстракта цветков C. fistula

Затем активность экстракта цветков C. fistula по удалению свободных радикалов исследовали с помощью анализа DPPH и ABTS. Экстракт цветков C. fistula дозозависимо ингибирует активность оксиданта. В качестве положительного контроля в каждом эксперименте использовали витамин Е и тролокс. Экстракт цветков C. fistula проявлял очищающую активность (анализ DPPH) на уровне 65 процентов при 100 мкг/мл. Было обнаружено, что при 25 мкг/мл экстракта цветка активность по удалению радикалов по-прежнему составляет примерно 33 процента, а IC50 экстракта цветка и витамина Е были зарегистрированы на уровне 70 и 72 мкг/мл соответственно. Эти данные показывают, что экстракт цветков C. fistula является мощным антиоксидантом и по этой способности сравним с витамином Е (рис. 8а). Для подтверждения антиоксидантной активности цветочного экстракта был определен анализ ABTS, который показал процентное ингибирование 47 процентов при 4 мкг/мл, а IC50 цветочного экстракта и тролокса составило 4,8 и 3 мкг/мл соответственно, что соответствует данные, полученные в результате анализа DPPH (рис. 8b).

Обсуждение

Внешние факторы и/или факторы окружающей среды вызывают признаки старения кожи, которые могут включать морщины и образование пигментных пятен [30]. В предыдущих исследованиях УФ-излучение, которое, как известно, вызывает старение кожи, было основной темой исследований, поскольку основное внимание уделялось патогенезу и молекулярным механизмам. Генерация АФК может стимулировать воспаление кожи, что приводит к активации факторов транскрипции, которые регулируют деградацию кожного коллагена и внеклеточного матрикса (ECM) [30]. Эти события приводят к потере способности кожи сопротивляться растяжению, что в конечном итоге приводит к старению кожи.

Экстракт цветков C. fistula традиционно используется для лечения кожных заболеваний, болей в животе и заживления ран [17]. Наши результаты показывают, что основными фитохимическими веществами, представленными в экстракте цветка C. fistula, были фенольные соединения и флавоноиды. Основными фенольными компонентами экстракта цветков C. fistula были протокатеховая кислота, за которой следовали ванилиновая кислота, хлорогеновая кислота и феруловая кислота. Кроме того, Баорун Т. и др. сообщили, что цветки C.fistula содержат различные типы флавоноидов, включая кемпферол, реин, фистулу, алкалоиды и тритерпены. Было доказано, что среди этих фитохимических соединений кемпферол, катехины, феруловая кислота, хлорогеновая кислота и протокатеховая кислота проявляют антивозрастную активность. В этом исследовании изучалась омолаживающая активность экстракта цветков C. fistula, чтобы определить влияние экстракта на выработку коллагена, ГК и меланина. Наши результаты показывают, что высокие концентрации экстракта цветков C. fistula (200 мкг/мл) не влияли на жизнеспособность клеток фибробластов кожи человека. Следовательно, экстракты цветков C. fistula могут быть безопасными при нанесении на кожу человека.

Синтез коллагена в фибробластах кожи играет важную роль в омоложении кожи. Снижение синтеза проколлагена типов I и III является важной особенностью стареющей кожи, ведущей к ее истончению и повышенной хрупкости. [31]. Следовательно, ингибирование синтеза коллагена или потеря функции коллагена приводит к хронологическому старению кожи. Наши результаты показывают, что экстракт цветка C. fistula значительно индуцирует синтез коллагена из фибробластов кожи, а также резко ингибирует активность коллагеназы, фермента, участвующего в распаде коллагена. Хронологически стареющая кожа, вызванная УФ-излучением, также происходит за счет увеличения продукции ММР, в том числе ММР-1, ММР-2, ММР-3 и ММР-9, что вызывает дисбаланс синтеза коллагена за счет индукции коллагена или деградации ВКМ [32]. Это первое сообщение, указывающее на то, что экстракты цветков C. fistula значительно ингибируют активность MMP-2 дозозависимым образом. Для применения в косметических препаратах следует рассматривать экстракт C. fistula в концентрации 50 мкг/мл. Эти данные свидетельствуют о том, что экстракт цветка C. fistula обладает полезным стимулятором коллагена, который приносит пользу коже за счет уменьшения распада коллагена.

Гликозаминогликаны (ГАГ) или гиалуроновая кислота (ГК), основной компонент внеклеточного матрикса, индуцируются во время заживления ран и регенерации кожи и поддерживают ее гидратацию [33]. Факторы окружающей среды, такие как УФ-излучение, вызывают тип старения кожи, который приводит к потере эластичности кожи, вызывая появление морщин из-за снижения синтеза ГК [34]. Этот результат указывает на то, что экстракт цветка C. fistula значительно увеличивал синтез ГК дозозависимым образом. Следовательно, экстракт цветка может повысить влажность кожи и может привести к тому, что кожа станет менее сухой за счет увеличения синтеза ГК.

Гиперпигментация вызывает старение кожи человека и возникает в результате как внутренних, так и внешних факторов, в том числе связанных с гормонами, воздействием УФ-излучения, лекарствами и присутствием различных химических веществ [4]. Биосинтез меланина - это путь, который появляется в меланоцитах. Гиперпигментация особенно заметна на темной коже и часто трудно поддается лечению. Ученые-косметологи провели различные исследования осветляющих кожу агентов in vivo и in vitro. Ключевым ферментом, регулирующим синтез меланина, является тирозиназа, которая участвует в двух стадиях синтеза меланина, включая гидроксилирование тирозина до -3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и окисление ДОФА до ДОФА-хинона. 4]. Наши результаты показывают, что экстракт цветка C. fistula может успешно снижать активность тирозиназы. Этот результат был аналогичен результатам некоторых предыдущих исследований, которые показали, что стручки C. fistula продемонстрировали активность отбеливания кожи in vitro и in vivo с использованием активности тирозиназы в качестве конечной точки биоанализа [35]. Следовательно, можно сделать вывод, что этот экстракт цветка C. fistula может уменьшить гиперпигментацию кожи человека. Предыдущие исследования показали, что некоторые части растения C. fistula проявляют антиоксидантную активность [36–38]. Водные и метанольные экстракты коры C. fistula продемонстрировали эффект DPPH по удалению свободных радикалов в зависимости от дозы [38]. Водно-спиртовой экстракт цветков и мякоти плодов C. fistula проявлял антиоксидантную активность, ингибируя ДФПГ и гидроксильные радикалы [36, 37]. Кроме того, наше исследование антиоксидантной активности бутанолового экстракта цветка C. fistula аналогичным образом продемонстрировало эффект удаления свободных радикалов DPPH и ABTS в зависимости от дозы.

Выводы

Эти результаты показывают, что экстракт цветков C. fistula обладает высоким антивозрастным потенциалом в нормальных клетках фибробластов кожи, как с точки зрения подавления морщин, так и уменьшения количества пигментных пятен. Экстракт цветка C. fistula может предотвратить старение кожи за счет увеличения выработки коллагена и ГК. Кроме того, экстракт цветка также ингибирует активность коллагеназы, MMP-2 и тирозиназы, которые участвуют в старении кожи. Таким образом, экстракт C. fistula, демонстрирующий нетоксичный эффект, может быть альтернативным ингредиентом для использования в косметике или добавках, которые разрабатываются для омолаживающих целей.

Сокращения

АБТС: азино-бис (этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота); Деионизированная вода: деионизированная вода; DMEM: модифицированная среда Игла Дульбекко; DPPH: дифенил-2- пикрилгидразил; ECM: внеклеточный матрикс; ERK: киназы, регулируемые внеклеточным сигналом; FBS: эмбриональная бычья сыворотка; г: грамм; ГА: галловая кислота; ч: час; ГК: гиалуроновая кислота; ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография; JNK: N-концевая протеинкиназа c-Jun; мг: миллиграмм; мин: Минута; мл: миллилитр; мМ: миллимолярный; MMP-2: матриксмеллопротеиназа-2; ММП: металлопротеиназы; нм: нанометр; PBS: фосфатно-солевой буфер; об/мин: раундов в минуту; SDS: додецилсульфат натрия; SRB: сульфородамин B; TCA: трихлоруксусная кислота; TFA: трифторуксусная кислота; мкг: микрограмм; мкл: микролитр

Благодарности

Это исследование получило финансовую поддержку со стороны Агентства по развитию сельскохозяйственных исследований (общественная организация) (ARDA), Национального исследовательского совета Таиланда (NRCT) и кафедры биохимии медицинского факультета Чиангмайского университета, Таиланд.

Финансирование

Это исследование получило финансовую поддержку Агентства по развитию сельскохозяйственных исследований (общественной организации) (ARDA) и Национального исследовательского совета Таиланда (NRCT).

Наличие данных и материалов

Все необработанные данные этого исследования были размещены в соответствующем репозитории. Данные предоставляются по запросу авторов.

Вклад авторов

PL разработал все эксперименты в этом исследовании, проанализировал и интерпретировал данные и написал рукопись. SY, WP и PT экспериментировали с данными и интерпретировали их. JS предоставила образцы кожи, которые были обработаны для этической процедуры. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись для представления.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Согласие на публикацию

Непригодный.

Этическое одобрение и согласие на участие

Это исследование получило этическое одобрение Комитета по этике медицинских исследований Чиангмайского университета (код исследования: BIO-2558-035490). Первичные фибробласты кожи человека были асептически выделены из рубца на животе после хирургической процедуры, включающей кесарево сечение, в хирургическом отделении госпиталя CM Maharaj Университета Чиангмая (Чиангмай, Таиланд).

Сведения об авторе

Кафедра биохимии медицинского факультета Чиангмайского университета, Чиангмай 50200, Таиланд. 2 Кафедра акушерства и гинекологии медицинского факультета Чиангмайского университета, Чиангмай 50200, Таиланд.

Рекомендации

1. Граньяни А., Корник С.М., Хомински В., Рибейро де Норонья С.М., Алвес Корреа де Норонья С.А., Феррейра Л.М. Обзор основных теорий старения кожи. Adv Aging Res. 2014;03:265–84.

2. Цюань Т., Цинь З., Ся В., Шао И., Вурхиз Дж.Дж., Фишер Г.Дж. Металлопротеиназы, разлагающие матрикс, при фотостарении. J Investig Dermatol Symp Proc. 2009; 14:20–4.

3. Нагасе Х., Весснер-младший Дж.Ф. Матриксные металлопротеиназы. Дж. Биол. Хим. 1999; 274: 21491–4.

4. Костин Г.Е., Слух В.Дж. Пигментация кожи человека: меланоциты модулируют цвет кожи в ответ на стресс. FASEB J. 2007; 21: 976–94.

5. Bae-Harboe YSC, Park HY. Тирозиназа: центральный регуляторный белок кожной пигментации. Джей Инвест Дерматол. 2012; 132:2678–80.

6. Сломински А., Тобин Д., Шибахара С., Вортсман Дж. Пигментация меланина в коже млекопитающих и ее гормональная регуляция. Physiol Rev. 2004; 84: 1155–228.

7. Папаконстантину Э., Рот М., Каракиулакис Г. Гиалуроновая кислота: ключевая молекула в процессе старения кожи. Дерматоэндокринол. 2012;4:253–258.

8. Вайгель П.Х., Фуллер Г.М., ЛеБёф Р.Д. Модель роли гиалуроновой кислоты и фибрина в ранних событиях воспалительной реакции и заживления ран. Дж Теор Биол. 1986; 119: 219–34.

9. Bai KJ, Spicer AP, Mascarenhas MM, Yu LY, Ochoa CD, Garg HG, et al. Роль гиалуроновой синтазы 3 в повреждении легких, вызванном вентилятором. Am J Respir Crit Care Med. 2005; 172:92–8.

10. Терли Э.А. Роль связанного с клеткой гиалуронан-связывающего белка в поведении фибробластов. Сиба нашел симптом. 1989; 143: 121–33. Обсуждение 33-7, 281-5.

11. Мортеза-Семнани К., Саиди М., Шахнаваз Б. Сравнение антиоксидантной активности экстракта корней солодки (Glycyrrhiza glabra L.) с коммерческими антиоксидантами в 2-процентном креме гидрохинона. J косметика наук. 2003; 54: 551–58.

12. Джанети М.Д., Меркурио Д.Г., Кампос PMBGM. Использование экстракта зеленого чая в косметических рецептурах: не только антиоксидантный активный ингредиент. Дерматол Тер. 2013; 26: 267–71.

13. Дурайпандиян В., Игнасимуту С. Антибактериальная и противогрибковая активность Cassia fistula L.: этнолекарственное растение. J Этнофармакол. 2007; 112: 590–4.

14. Луксимон-Рамма А., Бахорун Т., Сообратти М.А., Аруома О.И. Антиоксидантная активность фенольных, проантоцианидиновых и флавоноидных компонентов в экстрактах Cassia fistula. J Agric Food Chem. 2002; 50: 5042–7.

15. Manonmani G, Bhavapriya V, Kalpana S, Govindasamy S, Apparanantham T. Антиоксидантная активность цветков Cassia fistula (Linn.) у крыс с диабетом, вызванным аллоксанами. J Этнофармакол. 2005; 97: 39–42.

16. Бхалодия Н.Р., Шукла В.Дж. Антибактериальная и противогрибковая активность экстрактов листьев Cassia fistula l.: этнолекарственное растение. J Adv Pharm Technol Res. 2011;2:104–9.

17. Бахорун Т., Неергин В.С., Аруома О.И. Фитохимические составляющие Cassia fistula. Afr J Биотехнология. 2005;4:1530–40.

18. Бхалодия Н.Р., Нария П.Б., Ачарья Р.Н., Шукла В.Дж. In vitro антибактериальная и противогрибковая активность Cassia fistula Linn. экстракты мякоти плодов. Аю. 2012;33:123–9.

19. Ханнинен, Каартинен К., Раума А.Л., Ненонен М., Торронен Р., Хаккинен А.С. и соавт. Антиоксиданты в веганской диете и ревматические заболевания. Токсикология. 2000; 155:45–53.

20. Mangmeesri P, Wonsuphasawad K, Viseshsindh W, Gritsanapan W. Сравнение слабительной эффективности экстракта мякоти стручка Cassia fistula и Cassia angustifolia у тайских пациентов с запорами. Планта Мед. 2014;80:1404.

21. Сакулпанич А., Грицанапан В. Определение содержания антрахинона в листьях свищей кассии для альтернативного источника слабительных препаратов. Планта Мед. 2009;75:994.

22. Zhishen JMT, Jianming W. Определение содержания флавоноидов в шелковице и их очищающее действие на супероксидные радикалы. Пищевая хим. 1999; 64: 555–9.

23. Vichai V, Kirtikara K. Колориметрический анализ сульфородамина B для скрининга цитотоксичности. Нат Проток. 2006; 1:1112–6.

24. Vandooren J, Geurts N, Martens E, Van den Steen PE, Jonghe SD, Herdewijn P, et al. Анализ деградации желатина выявляет ингибиторы MMP-9 и функцию O-гликозилированного домена. World J Biol Chem. 2011;2:14–24.

25. Toth M, Sohail A, Fridman R. Оценка желатиназ (MMP-2 и MMP-9) с помощью зимографии желатина. Методы Мол Биол. 2012; 878: 121–35.

26. Ган С.Д., Патель К.Р. Иммуноферментный анализ и иммуноферментный анализ. Джей Инвест Дерматол. 2013;133:e12.

27. Moon JY, Yim EY, Song G, Lee NH, Hyun CG. Скрининг ингибирующей активности эластазы и тирозиназы растений острова Чеджу. ЕврАзия J Biosci. 2010;41.

28. Брака А., Сортино С., Полити М., Морелли И., Мендес Дж. Антиоксидантная активность флавоноидов из Licania licaniaeflora. J Этнофармакол. 2002; 79: 379–81.

29. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Антиоксидантная активность с использованием улучшенного анализа обесцвечивания катион-радикалов ABTS. Свободный Радик Биол Мед. 1999; 26:1231–7.

30. Pillai S, Oresajo C, Hayward J. Ультрафиолетовое излучение и старение кожи: роль активных форм кислорода, воспаление и активация протеазы, а также стратегии предотвращения вызванной воспалением деградации матрикса — обзор. Int J Cosmet Sci. 2005; 27:17–34.

31. Ритти Л., Фишер Г.Дж. Сигнальные каскады, индуцированные УФ-светом, и старение кожи. Aging Res Rev. 2002; 1: 705–20.

32. Уэст М.Д., Перейра-Смит О.М., Смит Дж.Р. Репликативное старение фибробластов кожи человека коррелирует с потерей регуляции и гиперэкспрессией активности коллагеназы. Разрешение ячейки опыта. 1989; 184: 138–47.

33. Tammi R, Pasonen-Seppanen S, Kolehmainen E, Tammi M. Индукция гиалуроновой синтазы и накопление гиалуроновой кислоты в эпидермисе мыши после повреждения кожи. Джей Инвест Дерматол. 2005; 124: 898–905.

34. Радаева И.Ф., Костина Г.А., Змиевский А.В. Гиалуроновая кислота: биологическая роль, структура, синтез, выделение, очистка и применение (обзор). Прикл Биохим Микробиол 1997;33:133–7.

35. Хан Б.А., Ахтар Н., Хуссейн И., Аббас К.А., Расул А. Отбеливающая эффективность растительных экстрактов, включая экстракты облепихи рамновидной и кассии фистулы, на коже азиатских пациентов с меланодермией. Постерий Дерматол Алергол. 2013; 30: 226–32.

36. Бхалодия Н.Р., Нария П.Б., Ачарья Р.Н., Шукла В.Дж. Антиоксидантная активность водно-спиртового экстракта из мякоти плодов Cassia fistula Linn in vitro. Аю. 2013; 34:209–14.

37. Бхалодия Н.Р., Нария П.Б., Ачарья Р.Н., Шукла В.Дж. Оценка in vitro антиоксидантной активности цветков Cassia fistula Linn. Int J PharmTech Res. 2011;3:589–99.

38. Илаварасана Р., Маллика М., Венкатараман С. Противовоспалительная и антиоксидантная активность экстрактов коры Cassia fistula Linn. Afr J Trad CAM. 2005; 2: 70–85.

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】