Антивозрастные эффекты экстракта культуры каллуса Leontopodium Alpinum (Edelweiss) посредством профилирования транскриптома

Пожалуйста, нажмитеoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Эдельвейс (Leontopodium Alpinum) из семейства сложноцветных — полевой цветок, произрастающий в скалистых известняковых местах. Здесь мы исследовали эффективность экстракта культуры каллуса эдельвейса (экстракт культуры каллуса Leontopodium Alpinum; LACCE) с использованием нескольких анализов от in vitro до in vivo, а также профилирования транскриптома. Несколько результатов анализов in vitro показали сильную антиоксидантную активность LACCE в ответ на УФ-обработку. Более того, LACCE подавлял воспаление и образование морщин; однако увлажняющая активность была увеличена LACCE. Клинические испытания in vivo продемонстрировали, что постоянное нанесение LACCE на ткани лица и кожи улучшало антипериорбитальные морщины, эластичность кожи, плотность дермы и толщину кожи по сравнению с плацебо. Результаты секвенирования РНК показали, что не менее 16,56% генов человека экспрессируются в клетках кератиноцитов. LACCE активировал гены, кодирующие несколько белков KRT; DDIT4, BNIP3 и IGFBP3 участвуют в положительной регуляции процесса развития, запрограммированной гибели клеток, кератинизации и ороговении, формируя кожные барьеры, которые дают коже человека множество преимуществ. Напротив, гены с пониженной регуляцией были генами, реагирующими на стресс, включая металлы, окисление, ранение, гипоксию и вирусную инфекцию, что позволяет предположить, что LACCE не вызывал какого-либо вредного стресса для кожи. Наше всестороннее исследование показало, что LACCE является перспективным средством для антивозрастной косметики.

Ключевые слова:против старения; мозоль; эдельвейс;клетки кожи; транскриптом

1. Введение

Эдельвейс (Leontopodium благородный подвид Alpinum(Cass.) Greuter) из семейства сложноцветных – это полевой цветок, произрастающий в скалистых известняковых местах на больших высотах, например в швейцарских Альпах [1,2]. Из-за редкости своих недолговечных белых цветов эдельвейс олицетворяет красоту и чистоту, связанные с Альпами и Карпатами. Кроме того, многие страны, включая Австрию, Болгарию, Румынию, Словению и Швейцарию, считают эдельвейс национальным символом.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Эдельвейс долгое время использовался в народной медицине против болей в животе, бронхита, диареи, дизентерии и лихорадки [3, А]. Недавно в нескольких исследованиях была показана противовоспалительная эффективность экстрактов эдельвейса у мышей и крыс [3], а также кератиноцитов и эндотелиальных клеток человека [4]. Кроме того, экстракты корней эдельвейса содержат компоненты, которые усиливают холинергическую нейротрансмиссию, что указывает на его потенциал в качестве средств против деменции [5] и антиоксидантов, таких как

леонтоподовая кислота А и 35-кофеоилхиновая кислота, которые можно использовать в качестве антивозрастных средств [6]. Кроме того, экстракты эдельвейса проявляли антибактериальную активность в отношении Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia и Streptococcus pyogenes, что позволяет предположить их возможное этномедицинское применение при респираторных и абдоминальных заболеваниях [7].

В нескольких предыдущих исследованиях были проанализированы соединения экстрактов эдельвейса. Так, методом капиллярной хроматографии из надземных частей эдельвейса методом капиллярной хроматографии выявлено 12 фармакологически важных соединений, в том числе флавоноиды, кофейная и леонтоподовая кислоты [8]. Для извлечения антиоксидантов из растений эдельвейса разработаны методы центробежной распределительной хроматографии (ЦПК) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6]. Известно, что активные соединения экстрактов эдельвейса между надземной частью и корнями разнообразны[3]. Например, волосатые корни эдельвейса производят фармакологически активные лигнаны, такие как логин и 5-метокси-логин, которые могут стимулироваться рядом других компонентов, таких как нитрат серебра, сахароза, метилжасмонат и дрожжевой экстракт. 9].Преимущества экстракта цистанхеКроме того, метаболические паттерны 11 различных видов Leontopodium были выявлены с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (1H ЯМР) и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) в их таксономическом отношении [10].

Cistanche может омолаживать

Каллус растений можно определить как неорганизованные или недифференцированные клеточные массы, которые легко индуцируются при нанесении раны на рану растения или искусственном проведении системы in vitro. Каллус растений искусственно культивируют путем добавления питательных веществ и регуляторов роста растений в антисептических условиях роста. В настоящее время в биореакторе можно производить большое количество специфических растительных клеток одинакового качества. Кроме того, растительная клетка обладает способностью, называемой тотипотентностью, которая представляет собой генетический потенциал растительной клетки для производства всего зрелого растения [11]. Таким образом, можно получить зрелое растение из определенного растительного каллюса. Кроме того, каллус можно широко использовать для регенерации растений с целью сохранения редких и исчезающих растений [12,13].

Подобно животным клеткам, растительные клетки обладают способностью способствовать стимуляции и регенерации растений после повреждения [14]. Хотя растительные стволовые клетки считаются новыми материалами в косметической промышленности, количество доступных материалов ограничено. Важно выявить новые растительные источники и оценить их функциональные компоненты, связанные с косметикой.

Экстракты эдельвейса хорошо известны своим использованием в фармацевтических препаратах; однако о влиянии экстракта эдельвейса в качестве источника натуральных косметических средств сообщается редко. Здесь мы исследовали эффективность экстракта каллуса эдельвейса (экстракт культуры каллуса Leontopodium Alpinum; LACCE), полученного из листьев эдельвейса, с использованием нескольких анализов от in vitro до in vivo и выявили молекулярный механизм, вызываемый LACCE, с использованием профилирования транскриптома.

2. Материалы и методы

2.1. Производство Эдельвейс Каллус

Семена эдельвейса были приобретены в коммерческих целях. Семена эдельвейса замачивали в 70% этаноле на 30 с, после чего промывали дистиллированной водой. Семена снова встряхивали в 0,3% гипохлорите натрия (Waco, Осака, Япония) в течение 20 мин и промывали дистиллированной водой. Стерилизованные семена проращивали на основной среде Мурасиге и Скуга (MS) (Duchefa Biochemie, Харлем, Нидерланды). Листья эдельвейса в асептических условиях разрезали на мелкие кусочки (от 0,5 до 1 см). Мы индуцировали раннюю стадию растительных клеток в среде MS, содержащей 0,5-3 мг/мл 6-бензиламинопурина (6-BAP) (Duchefa Biochemie) и 0,3-1 мг/мл 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) (Duchefa Biochemie) в темноте при 25±2°С [15]. pH среды MS доводили до 5,8 с помощью 1 н. NaOH (Duchefa Biochemie). Индуцированный каллюс размножали в чашке Петри. Выбранную линию каллуса культивировали в биореакторе в Исследовательском институте борьбы со старением компании BIO-FD&C Co., Ltd., Инчхон, Корея. Культивированный каллюс собирали и трижды промывали дистиллированной водой.Цистанче ЧингисханКаллус обезвоживали с помощью лиофилизатора (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Корея) в соответствии с инструкциями производителя. Высушенный каллюс эдельвейса перемешивали в дистиллированной воде при 50°С в течение 8 часов. Экстракты каллуса получали путем тепловой экстракции при 98°С в течение 10 мин.

2.2. Культура клеток кожи человека

Оцениваемые эффекты экстрактов эдельвейса на клетки кожи человека, клетки кератиноцитов (HaCaT) и нормальные человеческие фибробласты Detroit 551 (ATCC, Манассас, Вирджиния, США) культивировали в модифицированной среде Игла Дульбекко (DMEM) (Welgene, Gyeongsan-si, Korea). ) с добавлением 10-процентной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и 1-процентного антибиотика-антимикотика (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при 37 градусах с 5-процентным содержанием CO2.

2.3. Оценка метаболической активности клеток с помощью анализа МТТ

Чтобы оценить цитотоксичность LACCE на клеточный рост, размножение и выживание клеток кожи человека, MTT({{0}}(45-диметилтиазол-2-ил){{3} },5-дифенилтетразолия бромид) анализ проводили, как описано ранее [16,17]. Вкратце, клетки HaCaT и Detroit 551 при плотности 5×10* клеток на лунку соответственно инкубировали в 96-луночном планшете в течение 24 ч. После этого конечные концентрации 0,1% , 0,5% и 1% LACCE обрабатывали в течение 24 часов. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. После обработки LACCE среду удаляли с последующим добавлением 4 мкл 5 мг/мл МТТ (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и инкубировали в течение 4 часов. После удаления среды добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) (Sigma) и растворяли в течение 10 мин.продление жизни цистанхеПоглощение при длине волны измеряли при 570 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Thermo Scientific Multiskan GO (Fisher Scientific Ltd., Вантаа, Финляндия). Жизнеспособность клеток получали с использованием следующей формулы. Жизнеспособность клеток (в процентах)=(количество поглощения обработанных клеток/количество поглощения контрольных клеток) × 100.

2.4. Оценка антиоксидантной активности с помощью анализа DPPH

Антиоксидантную активность LACCE измеряли в анализе DPH (2,2-дифенил-1-пикрил-гидразин-гидрат), как описано ранее [18]. Вкратце, 0,1 мл конечные концентрации 0,1%, {{10}},5% и 1% LACCE обрабатывали 0,1 мл 0,1 мМ. DPPH (Sigma-Aldrich) в присутствии 0,4 мл этанола. Мы использовали 0,001% аскорбиновой кислоты (витамин С) (Sigma-Aldrich) в качестве положительного контроля. Образцы хорошо перемешивали в течение 10 с и инкубировали при комнатной температуре в темных условиях в течение 30 мин. Поглощение при длине волны измеряли при 517 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Thermo Scientific Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Активность по удалению радикалов рассчитывали по следующей формуле. Активность по удалению (в процентах) =[1-(абсорбция тестируемого образца/абсорбция контроля)]×100.

2.5. Оценка антиоксидантной активности с помощью анализа перекиси водорода (H2O2)

Перекись водорода образует в клетках свободные кислородные радикалы, что приводит к гибели клеток. Мы проверили уровень гибели клеток, вызванный перекисью водорода, в образцах, обработанных LACCE. Клетки HaCaT при плотности 5×105 клеток на лунку инкубировали в 24-луночном планшете в течение 24 часов. После этого конечные концентрации 0,1 процента, 0,5 процента и 1 процент LACCE обрабатывали в присутствии 1 мМ H, O в течение 8 часов. В качестве положительного контроля использовали 0,033% NAC (Sigma-Aldrich). Анализ МТТ использовали для измерения выживаемости клеток образцов, обработанных LACCE, вызванных HO2. Кроме того, мы наблюдали морфологию клеток с помощью окрашивания метиленовым синим (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).

2.6. Обратная транскрипция в реальном времени (RT)-PCR

Чтобы изучить влияние LACCE на разглаживание морщин, увлажнение и противовоспалительное действие, мы провели ОТ-ПЦР в реальном времени с известными праймерами, амплифицирующими маркерные гены, с использованием анализов праймеров QuantiTect (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки Detroit 551 при плотности 5×104 клеток на лунку инкубировали в 96-луночном планшете в течение 24 часов. После этого конечные концентрации 0,1 процента, 0,5 процента и 1 процент LACCE обрабатывали в течение 24 часов. кДНК синтезировали из соответствующих клеток Detroit 551, обработанных различными концентрациями LACCE, с использованием набора SuperPrep Cell Lysis & RT Kit для количественной ПЦР (Toyobo, Osaka, Japan), содержащего реагенты для лизиса и реагенты RT, в соответствии с инструкциями производителя. Для эффекта против морщин при лечении LACCE экспрессию гена, кодирующего матриксную металлопротеиназу-2(MMP-2), количественно определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием набора Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo). на основании инструкций производителя. Для оценки увлажнения при обработке LACCE экспрессию гена, кодирующего аквапорин 3 (АОР3), исследовали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. В случае противовоспалительного анализа клетки HaCaT с плотностью 5×104 клеток на лунку инкубировали в 96-луночном планшете в течение 24 часов. После удаления среды клетки HaCaT облучали УФ-В. Для УФ-облучения использовалась УФ-камера CL-1000 (Analytik Jena AG, Йена, Германия) с мощностью 5 мДж/см2. После этого конечные концентрации 0,1%, 0,5% и 1% LACCE обрабатывали в течение 4 часов. Мы использовали дексаметазон (Dex) (Sigma-Aldrich) в качестве положительного контроля. Для противовоспалительного эффекта лечения LACCE экспрессия генов, кодирующих COX2 и iNOS, соответственно, была количественно определена с помощью RT-PCR в реальном времени. Экспрессию отдельных генов нормализовали по экспрессии гена GAPDH. 2.7. Клиническая оценка LACCE как агента для косметики в Vioo

Клиническое исследование по оценке эффективности LACCE в подтяжке лица и уменьшении периорбитальных морщин, эластичности кожи, плотности дермы и толщины кожи было проведено компанией Ellead после одобрения на основе стандартных операционных процедур (версия 3.{{1} }) (Ellead, Соннам, Корея) Ellead IRB в соответствии с руководством по надлежащей клинической практике Кореи (B1-2015-4-002), описанным Министерством безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств (MFDS) и стандартными операционными процедурами Ellead (EL-P{ {4}}).

Чтобы изучить эффект LACCE in vivo, мы провели клиническую оценку LACCE по четырем различным факторам: подтяжка лица и уменьшение периорбитальных морщин, эластичность кожи, плотность дермы и толщина кожи. Для этого в общей сложности 21 женщина-доброволец со средним возрастом 48,04 ± 4,28 года, которые далее были разделены на 12 добровольцев в возрасте 40 лет и девять добровольцев в возрасте 50 лет, участвовали в клинической оценке в течение четырех недель.

Клинический тест проводился в трех разных временных точках: исходный уровень, 2 недели и 4 недели для всех добровольцев. За неделю до начала исследования и до его окончания все добровольцы не проходили дополнительных процедур по улучшению состояния кожи, косметических и санитарно-гигиенических мероприятий, которые могли бы повлиять на результаты. После мытья лиц добровольцев с помощью очищающей пены добровольцы выдерживались не менее 30 минут в контролируемом помещении с постоянной температурой (20-24 градусов) и влажностью (относительная влажность 40 процентов -60 процентов). . Мы проводили измерения случайным образом на левой или правой стороне лица добровольцев. Наш тест был двойным слепым, в котором ни испытуемые, ни исследователи не знали, какой продукт является тестовым образцом. Составы для расчета сниженной и увеличенной скоростей описаны в таблице 1.

2.8. Измерение лифтинга лица и уменьшение периорбитальных морщин

На исходном уровне у всех добровольцев измеряли периорбитальные морщины, эластичность кожи, плотность дермы, толщину кожи на щеках и подтяжку лица в уголках рта. После этого два разных образца, LACCE и плацебо (контроль), наносили на обозначенную область лица два раза в день (утром и вечером). Добровольцев разделили на две разные группы: группу I (LACCE наносили на левую область лица, а плацебо наносили на правую область лица) и группу II (плацебо наносили на левую область лица, а LACCE наносили на правую). правая область лица). Через две и четыре недели после лечения были проведены те же измерения для оценки эффекта LACCE по сравнению с эффектом плацебо.

Периорбитальные морщины анализировали с помощью оптической системы трехмерного измерения кожи PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Парсиппани, Нью-Джерси, США), которая идеально подходит для исследования микроструктуры кожи и морщин. Два различных параметра шероховатости: Ra (средняя шероховатость), которая представляет собой среднее абсолютных значений высот профиля профиля шероховатости, и Rg (среднеквадратичная шероховатость), которая представляет собой среднеквадратичное значение высот профиля шероховатости. профиля шероховатости, были измерены.

Эта статья взята из Genes 2020, 11, 230; doi: 10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes