Противоаллергическое и противовоспалительное действие неферина на клетки RBL-2H3

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Тучные клетки играют очень важную роль в кожных аллергиях и воспалениях, включая атопический дерматит и псориаз. В прошлом было установлено, что референс оказывает противовоспалительное и омолаживающее действие на кожу, но его влияние на тучные клетки еще детально не изучено. В этом исследовании мы использовали тучные клетки (клетки RBL-2H3) и мышиные модели для изучения противоаллергических и воспалительных эффектов эталона. Во-первых, мы обнаружили, что эталон ингибирует дегрануляцию тучных клеток и экспрессию цитокинов. Кроме того, мы наблюдали, что при стимуляции тучных клеток A23187/форбол 12-миристат-13-ацетатом (PMA) повышение уровня внутриклеточного кальция ингибировалось в сравнении с эталоном. Фосфорилирование пути MAPK/NF-KB также снижается при предварительной обработке эталона. Результаты исследований in vivo показывают, что эталон может улучшить проявления дерматита и инфильтрации тучных клеток, вызванных динитрохлорбензолом (DNCB). Кроме того, экспрессия барьерных белков в коже также восстанавливается.цистанхНаконец, было обнаружено, что эталон может уменьшать царапанье, вызванное соединением 48/80. В совокупности наши результаты показывают, что референс является очень хорошим противоаллергическим и противовоспалительным натуральным продуктом. Его влияние на тучные клетки способствует его фармакологическому механизму.

Ключевые слова:ссылка; натуральный продукт; тучная клетка; дерматит; зуд

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

Многие исследования подтвердили, что аллергические заболевания являются результатом не только активации врожденного, но и адаптивного иммунитета. Среди них тучные клетки играют очень важную роль при различных аллергических заболеваниях, таких как аллергический ринит, астма и аллергический дерматит. Тучные клетки экспрессируют рецепторы IgE (FceRI) на своих клеточных мембранах, а рецепторы FceRI обладают высокой аффинностью к антителам IgE [1,2]. Когда антиген-специфический IgE связывается с FceRI, происходит взаимодействие и возникает аллергическая реакция. Агрегация FceRI может активировать рецепторные тирозинкиназы, инициировать последующие реакции и способствовать фосфорилированию различных ключевых белков (таких как митоген-активируемая протеинкиназа; MAPK), что в конечном итоге приводит к притоку ионов кальция (Ca2 плюс), что является ключевое событие в дегрануляции тучных клеток [3].цистанчеАктивированные тучные клетки дегранулируют и высвобождают химические медиаторы. Эти химические медиаторы, используемые при аллергических реакциях, могут вызывать воспаление [4], поэтому для лечения аллергических симптомов используют ингибиторы дегрануляции тучных клеток. Поэтому ингибирование IgE-опосредованной дегрануляции тучных клеток часто используется для выявления новых соединений для профилактики и лечения аллергических заболеваний. Было установлено, что антитела и антигены антидинитрофенила (DNP)IgE могут индуцировать реакции пассивной кожной гиперчувствительности (PCA) в качестве типичной модели гиперчувствительности in vivo и в качестве исследовательского препарата для потенциальных антиантигенных аллергий [5,6]. ]. Кроме того, дегрануляция тучных клеток также может быть вызвана неиммунными стимуляторами, такими как соединения 48/80 и A23187. Давно известно, что ионофор кальция A23187 стимулирует секрецию тучных клеток с высвобождением предварительно образованных медиаторов, таких как гистамин, из их гранул, что служит примером [4] Соединение 48/80 представляет собой смешанный полимер п-метокси-N-метилфенетиламина. сшиты формальдегидом, который широко используется для независимой стимуляции тучных клеток [7,8]. Поэтому соответствующие количества соединения 48/80 и A23187 обычно используются в качестве реагентов для изучения механизма аллергических реакций. По статистическим оценкам около 15-20 процентов населения страдает атопическим дерматитом. Будь то дети или взрослые, страдающие этим заболеванием, без надлежащего лечения атопический дерматит может вызывать психологический дискомфорт у пациентов и обременять их семейные и социальные расходы на здоровье [9]. К сожалению, не существует подходящего метода лечения аллергического дерматита. Текущие варианты лечения по-прежнему избегают болезнетворных аллергенов, а непрерывное использование стероидов является золотым стандартом лечения. Неизбежные аллергены и побочные эффекты лекарств побудили к срочной разработке новых терапевтических препаратов. Природные соединения, выделенные из лекарственных трав и растений, являются потенциальными источниками терапевтических средств для профилактики и лечения воспалительных заболеваний и улучшения качества жизни пациентов с аллергическими заболеваниями.

Цистанхе может омолаживать

Ссылка происходит от сердцевины лотоса (зародыш семени) растения Nelumbo nucifera и является основным бисбензилизохинолиновым алкалоидом. Имеются данные о том, что референс обладает широким спектром фармакологических свойств, таких как противораковое, антиоксидантное, противовоспалительное и нейропротекторное действие при многих заболеваниях [10-15].преимущества цистанхеХан и др. обнаружили, что референс оказывает действие против фотостарения, ингибируя опосредованное УФ-излучением увеличение уровней АФК и малонового диальдегида (МДА) в кератиноцитах и ​​фибробластах человека [16,17]. Недавно мы обнаружили, что референс обладает потенциалом в качестве альтернативного лекарства для лечения атопического дерматит или другие кожные воспалительные заболевания[18]. Тем не менее, остается неясным, оказывает ли эталон антикожное аллергическое действие на тучные клетки. В этом исследовании мы стремились изучить влияние эталона на аллергические заболевания, опосредованные тучными клетками, с использованием линий тучных клеток человека (клетки RBL-2H3) и соединения 48/80-, а также анафилаксию, вызванную DNCB. модель мыши.

La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un важный алкалоид бисбенцилизохинолина. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, антиоксиданты, противовоспалительные y нейропротекторы, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia производит эффекты anti-fotoenvejecimiento al inhibir el Aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] де атопический дерматит у других enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la allergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue Investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitas, utilizando lineas de mastocitos humanos (целулас RBL-2H3) и модель ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Результаты

2.1. Тест на цитотоксичность неферина на тучных клетках крысы (RBL-2H3)

Поскольку клетки базофильного лейкоза крыс (RBL)-2H3, аналог тучных клеток, высвобождающих гистамин, являются подходящими клетками для изучения эффектов воспаления, опосредованного тучными клетками [19], мы использовали эти клетки для исследования антиаллергического Эффекты ссылки. Во-первых, мы проверили, может ли эталон оказывать цитотоксическое действие на тучные клетки. Когда клетки предварительно обрабатывают эталоном от 1 до 30 мкМ в течение 24 ч, жизнеспособность клеток не будет зависеть от лечения эталоном (рис. 1).

2.2. Неферин снижает эффект дегрануляции RBL-2H3, стимулированный различными активаторами.

Клетки RBL-2H3 обычно используются для исследований дегрануляции in vitro [20-22]Стимуляция клеток RBL-2H3 антидинитрофенольным (DNP)IgE и сывороточным альбумином человека, конъюгированным с DNP. (HSA) вызывает дегрануляцию. Кроме того, известно, что тучные клетки дегранулируют в ответ на синтетические соединения, такие как соединение 48/80 и ионофор кальция A23187, и эти соединения использовались в качестве удобных реагентов для прямых исследований механизмов аллергических реакций in vitro [23, 24]. Результаты показали, что цитоплазма RBL-2H3, не активированная активатором, содержала ограниченное количество секреторных гранул.цистанхе холестеринОбработка только эталоном (10 мкМ) не влияла на активность RBL-2H3 (рис. 2А, В). Однако добавление различных активаторов, включая соединение 48/80, A23187 и анти-DNP/IgE плюс DNP/HSA, явно заполнило цитоплазму секреторными гранулами. Под электронным микроскопом видно, что в цитоплазме находится большое количество секреторных гранул, причем некоторые секреторные гранулы даже сливаются с клеточной мембраной, что приводит к дегрануляции (рис. 2В-Д). После предварительной обработки эталонной концентрацией 10 мкМ количество секреторных гранул в цитоплазме значительно уменьшилось (рис. 2F-H). Эти результаты показывают, что эталон может эффективно ингибировать активацию и дегрануляцию RBL-2H3, стимулируемых активатором.

2.3. Неферин ингибирует PMA/A23187-индуцированный рост внутриклеточного кальция в RBL-2H3

Ионы кальция играют роль вторичного мессенджера в процессе активации клеток. А23187 является наиболее эффективным средством для увеличения проникновения ионов кальция через клеточные мембраны и стимуляции активации тучных клеток. Ацетат форболмиристата (PMA) может активировать протеинкиназу Cand и увеличивать внутриклеточные ионы кальция для усиления эффекта A23187. Увеличение ионов кальция в тучных клетках также считается важным фактором, вызывающим активацию тучных клеток, так как он влияет на дегрануляцию тучных клеток и высвобождает больше воспалительных цитокинов и хемокинов.побочные эффекты цистанхе пустынного,Таким образом, это исследование было направлено на изучение того, может ли эталон подавлять концентрацию ионов кальция в RBL-2H3, когда он ингибирует воспаление. Экспериментальная группа была разделена на группы с предварительной обработкой эталоном или без нее в течение 20 минут, и были добавлены 1 мМ CaClz и PMA/A23187 для стимуляции и активации RBL-2H3. Экспериментальные результаты показали, что обработка RBL-2H3 только различными концентрациями эталона не влияла на увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция. В группе, получавшей PMA/A23187-индуцированный приток Ca2t, внутриклеточная концентрация ионов кальция значительно увеличилась. Клетки RBL-2H3 были предварительно обработаны в течение 20 минут эталоном (3 мкМ и 10 мкМ), и концентрация ионов кальция значительно снизилась (рис. 3).

2.4. Неферин снижает экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов в PMA/A23187, стимулированную RBL-2H3.

Иммунный ответ кожи увеличит количество тучных клеток в организме, а затем тучные клетки будут вырабатывать провоспалительные цитокины и ускорять прогрессирование заболевания. Провоспалительные цитокины, особенно TNF-a, IL-6, IL-1 и IL-8, не только вызывают воспаление, но также вызывают лейкоцитарную инфильтрацию, образование гранулем и фиброз тканей. PMA/A23187 воздействует на тучные клетки и побуждает их вырабатывать IL-16, IL-6, TSLP и TNF-, вызывая воспаление, связанное с аллергией. Поэтому мы предварительно обрабатывали RBL-2H3 эталоном в течение 20 минут и стимулировали PMA/A23187 в течение 6 часов, чтобы определить, может ли эталон подавлять экспрессию мРНК IL-1 , IL{{ 19}}, TSLP и TNF-a. Результаты показали, что в группе, получавшей только эталон, экспрессия мРНК цитокинов не была затронута, а экспрессия мРНК в группе, которая индуцировала воспаление с помощью PMA/A23187, значительно увеличилась. В группе, обработанной эталоном, было отмечено, что уровни экспрессии мРНК IL-1, IL-6, TSLP и TNF-a были значительно подавлены (фиг. 4).

2.5. Неферин ингибирует PMA/A23187-индуцированное фосфорилирование пути MAPK в RBL-2H3

Предыдущие исследования показали, что тучные клетки должны высвобождать внутриклеточные ионы кальция для активации MAPK. Кроме того, сигнальный путь MAPK регулирует экспрессию моноцитов, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, цитокинов и хемокинов и вызывает аутоиммунитет. Этот механизм аналогичен пути активации PMA/A23187. В этом исследовании мы исследовали, может ли эталон участвовать в регуляции путей MAPK. Мы обрабатывали различные концентрации эталона (1, 3 и 10 мкМ) RBL-2H3 в течение 20 минут, а затем стимулировали PMA/A23187 в течение 30 минут, чтобы вызвать воспаление. Результаты показали, что когда RBL-2H3 обрабатывали только эталоном в различных концентрациях, активация белков p38, JNK и ERK не влияла. В группе, получавшей только PMA/A23187, мы обнаружили, что белки p38, JNK и ERK были активированы и имели значительное фосфорилирование. В группе, предварительно обработанной эталоном, было замечено, что при более высоких концентрациях эталона фосфорилирование белков p38, JNK и ERK значительно снижалось (фиг. 5A-C).

2.6. Неферин ингибирует PMA/A23187-индуцированное фосфорилирование пути NF-B в RBL-2H3

Экспрессия провоспалительных цитокинов зависит от активации фактора транскрипции NF-kB в тучных клетках. Когда белок IKB фосфорилировался и разрушался, NF-kB высвобождался и мигрировал в ядро, связываясь с соответствующими ДНК-чувствительными элементами и способствуя транскрипции провоспалительных медиаторов. Было произведено много цитокинов и хемокинов, которые регулируют иммунный ответ, дифференцировку и воспаление. Поэтому мы исследовали, влияет ли предварительная обработка эталоном на фосфорилирование белка, индуцированное PMA/A23187. Мы обработали различные концентрации эталона (1, 3 и 10 мкМ) с RBL-2H3. Через 20 минут PMA/A23187 стимулировал RBL-2H3 в течение 1 или 2 часов, вызывая воспаление. Результаты показали, что обработка RBL-2H3 только различными концентрациями эталона не влияла на фосфорилирование IKBa и NF-KB. Когда для стимуляции использовали PMA/A23187, наблюдалось значительное увеличение фосфорилирования IkBo и NF-KB. В группе, предварительно обработанной эталоном, было обнаружено, что фосфорилирование IkBa (фиг. 6A) и NF-KB (фиг. 6B) было значительно снижено.

2.7. Влияние неферина на 2,4-динитрохлорбензол(DNCB), индуцированный атопическим дерматитом

Модель животных для исследования заболеваний, DNCB является репрезентативным раздражителем, вызывающим атопический дерматит [25]. В нашем эксперименте используется 1-процентный динитрохлорбензол (DNCB), растворенный в 75-процентном спирте, чтобы вызвать первую стадию реакции сенсибилизации. Эталон (3 мг/кг и 10 мг/кг) и дексаметазон (Dexa,{{10}}.2 мг/кг), растворенные в ДМСО, вводили внутрибрюшинно на пятый день в течение десяти дней. . На 8-й, 1-й и 14-й дни в качестве второго этапа индукции воспаления применяли 0,5% DNCB. Мышей разделили на четыре группы — контрольную группу, группу DNCB, группу сравнения и группу лечения дексаметазоном — и затем, после сравнения между группами, отметили различия. Мы наблюдали, что DNCB индуцировал реакцию атопического воспаления кожи на коже мышей. После применения DNCB было обнаружено, что на коже мышей усилилось покраснение и шелушение. Все это происходит из-за аномальной пролиферации кератиноцитов, инфильтрации и агрегации иммунных клеток. В группе, получавшей референс в дозе 3 мг/кг и дексаметазон в дозе 0,2 мг/кг в течение четырех дней, покраснение уменьшилось. Мы продолжали наблюдать за состоянием спинной кожи мышей до 15-го дня. По сравнению с контрольной группой, у группы DNCB были сильно покрасневшие и опухшие кожные покровы, а также перхоть и раны, которые, по-видимому, были вызваны зудом и болью. . Мы можем найти тенденцию к снижению степени после лечения эталоном и дексаметазоном (рис. 7А). Окрашивание толуидиновым синим использовали для наблюдения за количеством агрегированных тучных клеток. Тучные клетки казались фиолетовыми при наблюдении под микроскопом. Количественно можно показать, что количество тучных клеток, инфильтрированных и накопленных в дерме в экспериментальной группе DNCB, значительно увеличилось по сравнению с контрольной группой. В группе, получавшей референс и дексаметазон, инфильтрация, агрегация и количество тучных клеток были снижены (рис. 7В, С).

2.8. Неферин улучшает экспрессию мРНК барьерных молекул после лечения DNCB

Связанное с кожей воспаление, вызванное атопическим дерматитом, может привести к нарушению барьерной функции кожи. Если кожный барьер неисправен, антигенам или раздражителям легче проникнуть через эпидермис кожи и попасть в организм, вызывая иммунные реакции. При этом будет подавлена ​​продукция дифференцировочных белков, в том числе филаггрина, лорикрина и инволюкрина. Поэтому восстановление поврежденного кожного барьера очень важно для профилактики и лечения АтД [26]. В нашем исследовании мы использовали ссылки для вмешательства в животную модель атопического дерматита, вызванного DNCB. После умерщвления мышей дорсальная ткань кожи была заземлена для анализа RI-qPCR, чтобы оценить, может ли эталон улучшить снижение экспрессии мРНК филаггрина, лорикрина и инволюкрина после лечения DNCB. Результаты показали, что в экспериментальной группе DNCB значительно снижена экспрессия мРНК филаггрина, лорикрина и инволюкрина по сравнению с контрольной группой. Экспрессия мРНК филаггрина, лорикрина и инволюкрина была значительно повышена в группе, получавшей референс и дексаметазон, по сравнению с группой, получавшей DNCB (рис. 8).

Мы также доказали, что референс обладает антиаллергическим эффектом царапанья. Мы использовали агент дегрануляции тучных клеток, соединение 48/80, чтобы вызвать царапанье у мышей BALB/c. Как показано на Фигуре 9, мы обнаружили, что обработка эталоном ингибировала расчесывание, вызванное соединением 48/80 (50 мкг/участок). Повторное введение более низких и более высоких доз эталона (3 и 10 мг/кг) в течение 5 дней подряд значительно уменьшало количество царапин, вызванных соединением 48/80.