Антиоксидантная нанолента на основе оксида графена как новый отбеливающий агент ингибирует механизм меланогенеза

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Синь-Ю Чжоу, Хуэй-Мин Дэвид Ван,* Чиа-Хэн Куо, Пей-Сюань Лу, Линь Ван, Веньи Кан и Цзя-Лян Сунь*

АННОТАЦИЯ:В процессе синтеза меланина окислительные реакции играют существенную роль, и хорошей стратегией является ингибирование выработки меланина за счет уменьшения окислительного стресса. Фуллерен и его производные или комплексы считались сильными поглотителями свободных радикалов, и мы дополнительно применили многослойные наноуглероды sp2, чтобы обнаружитьмеланинМеханизмы ингибирования синтеза. В настоящем исследовании мы использовали новые наноматериалы, такие как многослойные углеродные нанотрубки (MWCNT), MWCNT короткого типа, наноленты оксида графена (GONR) и GONR короткого типа, в качестве антиоксидантов для регулирования выработки меланина. Результаты показали, что GONR обладают лучшими антиоксидантными способностями в платформах анализа внутриклеточного и внеклеточного окислительного стресса, чем другие. Мы предположили, что GONR имеют кислородсодержащие функциональные группы. В анализе диацетата 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина мы обнаружили, что GONR может хелатировать ионы металлов для удаления активных форм кислорода. С точки зрения молекулярного понимания мы наблюдали, что эти наноматериалы подавляли синтез меланина за счет снижения экспрессии генов, связанных с фактором транскрипции, связанным с микрофтальмом, и были аналогичные последствия в экспрессии белков. Подводя итог, можно сказать, что GONR являются потенциальным агентом в качестве нового антиоксиданта и отбеливающего кожу косметологического материала.

Цистанхе такжепотенциальный агент как романантиоксиданти отбеливание кожикосметологический материал.

1. ВВЕДЕНИЕ

Кожа – это орган, покрывающий внешнюю поверхность тела человека. Поскольку интерфейс находится в контакте с окружающей средой, слой кожи играет важную роль в защите организма от патогенов, предотвращении чрезмерной потери воды, регулировании температуры тела и так далее. Меланоциты растут в базальной мембране эпидермиса кожи и составляют от 5 до 10 процентов клеточного содержимого. Они были охарактеризованы как одноклеточные «железы» с тонкими, длинными, похожими на ленты дендритами и разветвлениями. Меланоциты перемещаются через эпидермальные клетки в непосредственной близости от них, создавая созвездие эпидермальных клеток вокруг каждого меланоцита. Существует множество внутренних и внешних причин старения кожи, и одним из таких факторов является ультрафиолетовое (УФ) излучение солнечного света.1 Во время воздействия УФ-излучения уровни активных форм кислорода (АФК) в коже резко возрастают, что известно как окислительный стресс. Несколько экологических факторов токсичности также усиливают окислительный стресс на коже, например, пестициды, четыреххлористый углерод, тяжелые металлы, ароматические амины и твердые частицы 2,5 (PM2,5).2 В биохимическом механизме внутриклеточные оксиданты образуются из не- ферментативной системы, превращая их в АФК, чтобы запустить путь меланогенеза.3

Помимо АФК, существует множество факторов, влияющих напроизводство меланина, включая экспрессию генов, воспаление, эндокринные изменения и поглощение пигмента.1 На первых этапах производства меланина тирозиназа играет роль в катализе тирозина в феномеланин и эумеланин. Механизмы производства обоих пигментов аналогичны и включают гидроксилирование L-тирозина в 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин (L-DOPA) и окисление L-DOPA в допахинон. На следующем этапе дофамин окисляется родственным тирозиназе белком 1 (TRP-1) и родственным тирозиназе белком 2 (TRP-2) в меланосоме, который регулируется фактором транскрипции, ассоциированным с микрофтальмом ( MITF) для образования меланина. Наконец, меланин созревает и осаждается в роговом слое.4,5 Они проникают в соседние кератиноциты базального слоя и защищают их ДНК от любых мутаций или модификаций, вызванных УФ-излучением. Созревший меланин в меланосомах переносится на кератиноциты6-9 и в конечном итоге приводит к длительной пигментации. Лентиго, веснушки и коричневые/черные пятна иногда вызывают социальные проблемы у мужчин и женщин. Блокирование окислительного стресса или подавление активности тирозиназы является одной из стратегий подавления синдрома гиперпигментации и дерматологических нарушений. Антиоксиданты излечивают вызванную АФК гиперпигментацию и повреждение клеток.10,11 Таким образом, синтезированные антиоксидантные соединения имеют множество биофункциональных применений в средствах по уходу за кожей.

Фуллерен (C60), углеродные нанотрубки (CNT), графен и графеновые наноленты (GNR) — это четыре вида наноуглерода sp2, которые широко исследуются во всем мире.12 Фуллерен и его производные или комплексы считаются прочными.поглотители свободных радикаловдолгое время. Йод и др. использовали водорастворимый C60 в качестве защитного агента от дегенерации, вызванной катаболическим стрессом. Инжект и др. пришли к выводу, что C60(OH)24 является сильным антиоксидантным соединением, когда окислительный стресс слишком высок. Окуда и др. предположили, что комплексы C60 могут предотвращать опосредованное NO повреждение клеток.13,14 Tong et al. показали, что комплексы C60 могут быть многообещающими кандидатами для лечения заболеваний головного мозга, вызванных повышенным уровнем супероксида. На самом деле, в 2006 году японская компания идентифицировала фуллерены с сильной антиоксидантной активностью для использования в косметике. Lucente-Schultz et al. продемонстрировали, что способность функционализированных однослойных УНТ (ОУНТ) поглощать кислородные радикалы почти в 40 раз выше, чем у дендритных C60.15-19 Fenoglio et al. обнаружили, что многостенные УНТ (МУНТ) обладают замечательной способностью поглощать радикалы при контакте с внешним источником гидроксильных или супероксидных радикалов.20 Расчеты теории функционала плотности также выявили модель ОУНТ как поглотителей свободных радикалов. В 2004 г. Новоселов и соавт. впервые продемонстрировали, что графен проявляет сильный амбиполярный электрический эффект и может быть многообещающим для электронных приложений.21 После этого они продолжали показывать, что графен обладает электронными свойствами, которые характерны для двумерного газа частиц, описываемого уравнением Дирака.22,23 Поскольку после этих двух новаторских статей все больше и больше внимания уделялось исследованиям на основе графена.24–30 Например, Qiu et al. в 2014 г. показали, что оксид графена и малослойный графен проявляют значительную антиоксидантную активность и могут защищать различные биомолекулярные молекулы от окисления.31 Han et al. экспериментально продемонстрировал в 2007 г., что энергетическая щель ЗНС может контролироваться в процессе литографии путем изменения ширины ленты.32 Среди четырех наноуглеродов ЗНС привлекли наименьшее внимание. Насколько нам известно, существует мало исследований антиоксидантных свойств нанолент оксида графена (GONR).31,33 Поэтому в этом исследовании мы тщательно подготовили MWCNT, короткие MWCNT, GONR и короткие GONR и стремились сравнить их антиоксидантные свойства и соответствующие результаты систематически.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Морфология MWCNT и GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >от 10 мкм до 2-3 мкм. Одновременно было замечено, что обработка азотной кислотой делает гладкие поверхности труб шероховатыми. На изображении с большим увеличением видны некоторые выемки и неправильные формы. Кроме того, использование МУНТ и коротких МУНТ посредством микроволновых реакций позволяет получить GONR и короткий GONR соответственно. Мы также проиллюстрировали ПЭМ-изображения с малым и большим увеличением GONR и короткого GONR. Из-за большого продольного распаковывания и небольшого горизонтального разреза кажется, что GONR были короче, чем MWCNT. С другой стороны, изображения с большим увеличением показали больший диаметр, то есть 0,11–0,18 мкм, GONR, чем у MWCNT, что указывает на то, что процесс распаковки прошел успешно. Точно так же короткие GONR имели меньшую длину и больший диаметр, чем короткие MWCNT. В воздушном компрессоре нашего нового процесса распаковки тонкие слоистые структуры GONR были меньше, чем то, что мы получили в раннем отчете для той же микроволновой мощности 250 Вт, при сохранении более толстых центральных МУНТ.12 Это означало, что МУНТ ядро-оболочка /ГОНР, скорее всего, появится вместо полностью расстегнутой структуры нанолент во всех микроволновых мощностях в новом процессе. Для сравнения с короткой GONR в наших предыдущих исследованиях,34 более высокая мощность микроволн приводила к образованию большего количества зазубрин на сторонах лент и не формировала красивых гладких краев лент. Обратите внимание, что на рис. 1а мы использовали два разных типа медных сеток. Для MWCNT и GONR достаточной длины использовалась сетка Gu с формваром Лейси, стабилизированным углеродом (продукт № 01881-F, Ted Pella, Inc., США). Открытые отверстия в ажурной углеродной пленке предотвратили наложение изображения передачи между наноуглеродом и углеродной пленкой. Темно-серые сети принадлежат ажурной углеродной пленке. Однако для коротких MWCNT и коротких GONR требовалась сетка Gu с формваром, стабилизированным углеродом (номер продукта 01800-F, Ted Pella, Inc., США). Это было связано с тем, что большие отверстия в кружевной углеродной пленке создавали проблемы для эффективного удерживания короткой MWCNT и короткой GONR. Как показано на рисунке 1, светло-серый контраст под короткими МУНТ и короткими GONR представляет собой светлый слой углерода. Этот углеродный слой стабилизировал формваровую пленку под воздействием электронного луча благодаря своим тепло- и электропроводным свойствам.

2.2. Конфигурации связывания MWCNT и GONR.

Спектры комбинационного рассеяния четырех наноуглеродов представлены на рисунке 1b; полоса D GONR была выше, чем у MWCNT после процесса распаковки. Это было связано с более высоким уровнем окисления и большим количеством краевых структур GONR по сравнению с МУНТ. Это явление также похоже на то, что мы наблюдали в 2{8}}11.12. Из-за высокого уровня графитизации G-полоса МУНТ имела наименьшую полную ширину на половине максимума. Отношения ID/IG для четырех наноуглеродов составляли {{10}}.0.076, 0,502, 0,483 и 0,700 соответственно. Вкратце, уменьшенная длина и окисление поверхности увеличили уровень дефектов и, таким образом, повысили отношение ID/IG. Пик D' присутствует во всех дефектных графенах и рассматривается как мера качества.35 Как показано на рис. 1b, пики D' в четырех спектрах становятся более заметными после процесса разрезания или распаковки, что позволяет предположить, что они являются разрушительными. процессы, которые вносят много дефектов. На рис. 1c,d показаны спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии четырех наноуглеродов. По-видимому, пик D' наиболее четкий для коротких GONR. Как показано на рисунке 1c, уровень O значительно увеличился с 7,6% (МУНТ) до 19,9% (ГОНР) из-за сильной окислительной способности KMnO4 в кислой среде. С другой стороны, уровень O немного увеличился на 0,8 процента от МУНТ к коротким МУНТ. Важно отметить, что самый высокий уровень O составляет 38,3 процента для короткого GONR, что означает, что концы нанолент будут легче присоединять кислородные функциональные группы, чем плоские поверхности sp2. Большее число полной ширины на половине максимума и сдвиг к высокой энергии связи пиков C 1s после процесса распаковки как МУНТ, так и коротких МУНТ показаны на рисунке 1d. Для оксидов графена деконволюционные пики на стороне высокой энергии связи могут быть отнесены к связям C-C(C-C), C-O, C-O и COOH.36 Мы охарактеризовали GONR (200 Вт) в 2013 г. ,37 и результаты были аналогичны результатам этого исследования. В этом исследовании был сделан вывод о явлениях спектров комбинационного рассеяния, а это означает, что во время преобразования трубки в ленту образовалось больше кислородсодержащих функциональных групп (рис. 2).

2.3. Антиоксидантные свойства МУНТ и GONR.

2.3.1. Определение активности поглощения свободных радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил.

1,1- Дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH) поглощающая свободные радикалы активность представляет собой антиоксидантную платформу, применяемую для определения антиоксидантной способности; результаты для четырех наноуглеродов описаны в таблице 2. В анализе DPPH в качестве положительного контроля использовали витамин С в концентрации 100 мкМ. Для проверки антиоксидантной активности МУНТ, коротких МУНТ, GONR и коротких GONR в реакционном растворе инкубировали дозы 1, 5 и 1 0 мг/л для измерения свойств. МУНТ, короткие МУНТ, GONR и короткие GONR обладали умеренной ингибирующей способностью при 10 мг/л (19,2 ± 0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 и 30,0 ± 0,4 процента), в то время как витамин С имел аналогичные условия при 100 мкМ (93,4 ± 0,1 процента) для подавления.

2.3.2. Анализ ионно-хелатной активности.

В условиях окислительного стресса феррозин может образовать комплекс с Fe2 плюс, который можно измерить количественно. В присутствии хелатирующих медиаторов комплекс разрушается, в результате чего ионы двухвалентного железа восстанавливаются из темно-красного цвета комплекса Fe2+. Мы использовали ЭДТА в качестве положительного контроля. В таблице 2 показано, что МУНТ, короткие МУНТ, GONR и короткие GONR обладают хелатирующей активностью при 10 мг/л (29,2 ± {{10}},8, 28,7 ± 0. 0,7, 69,7 ± 0,6 и 68,9 ± 0,3 процента), в то время как положительный контроль имел аналогичные условия при 100 мкМ (93,4 ± 0,1 процента).

2.3.3. Измерение мощности антиоксидантов, восстанавливающих железо.

Анализ железовосстанавливающего потенциала представляет собой простой и надежный тест, используемый для количественной оценки синтеза комплекса Fe(III)-феррицианид. В этом анализе восстанавливающую способность четырех наноуглеродов, образующих комплекс двухвалентного железа Fe(III)-TPTZ, определяли по изменению цвета раствора с желтого на зеленый и синий. Таблица 2 демонстрирует, что восстанавливающая способность МУНТ, коротких МУНТ, GONR и короткого GONR составляла оптическую плотность (ОП) 1,11, 1,13, 1,15 и 1,11 при 10 мг/л.

2.3.4. MWCNT и GONR ингибируют внутриклеточное накопление АФК.

Во многих сообщениях показано, что АФК разрушают структурную целостность клеточных мембран, включая клеточные мембраны и ядерные мембраны, что приводит к повреждению клеток и потере нормальной функции. меланина, а ингибирование продукции АФК является хорошей стратегией для подавления синтеза меланина. В этом исследовании мы использовали анализ окрашивания 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетатом (DCFDA) для анализа уровня внутриклеточного окислительного стресса в клетках, обработанных MWCNT и GONR. Форбол 12-миристат 13-ацетат (ФМА) индуцировал окислительную стимуляцию в группах MWCNT и GONR и использовался в качестве отрицательного контроля.41 Когда концентрация ФМА составляла 20 нг/мл, он вызывал окислительный стресс, увеличивая значение до 38 процентов; после лечения GONR и MWCNT уровни ROS снижались до нормального уровня. Данные показали, что оба материала ингибируют уровни окислительного стресса, а антиоксидантный эффект GONR был выше, чем у MWCNT (рис. 3). В таблице 1 показан аналогичный список последствий. Мы утверждали, что есть три причины для наших новых результатов: во-первых, порядок растворимости этих материалов был следующим: короткие GONR > GONR > короткие MWCNT > MWCNT, что означает, что площадь контакта коротких GONR была наибольшей, поэтому она была превосходит по очистке АФК. Во-вторых, GONR и MWCNT были sp2-углеродными структурами, которые могли разрушать электричество АФК посредством образования аддуктов или переноса электронов.42 Мы обнаружили, что антиоксидантные эффекты структур нанолент были лучше, чем у структур нанотрубок, поэтому легче переносить электроны, чем нанотрубки. Наконец, на рисунке 1b мы видим, что углеродный центр sp2- GONR содержит больше кислородных функциональных групп, чем МУНТ, группы карбоновой кислоты могут хелатировать ионы металлов, а гидроксильные группы могут быть H-донором для удаления АФК и подавляют выработку меланина.

2.4. Цитотоксичность MWCNT и GONR, обработанных в клетках дермальных фибробластов человека.

Для оценки цитотоксические свойства GONR на клетках Hs68 (рис. 3), и клетки культивировали в различных дозах 1, 5 и 10 мкг/мл. Мы проверили, что жизнеспособность клеток MWCNT составляла 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 и 94,1 ± 4,7 процента при концентрациях 1, 5 и 10 мг/л соответственно; жизнеспособность коротких MWCNT была рассчитана в том же порядке и составила 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 и 98,9 ± 2,1 процента. Мы наблюдали, что клетки B16-F10 инкубировали в высоких концентрациях, а выживаемость клеток Hs68 составляла более 80 процентов, что свидетельствует о том, что МУНТ и короткие МУНТ не оказывали токсического действия на клетки дермальных фибробластов человека. Жизнеспособность клеток GONR и короткого GONR составляла 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 и 90,64 ± 2,5 процента. На рисунке 4а также указано, что GONR и короткий GONR не оказывали заметного цитотоксического действия на клетки HS68. В предыдущих отчетах использование непроверенных наноматериалов в косметических целях могло быть сочтено сомнительным,43,44 и обычно это было связано с атакой ДНК после того, как наночастицы проникали в клетки. После теста на цитотоксичность мы обнаружили, что наши материалы не оказывают токсического действия на нормальные клетки кожи. Мы пришли к выводу, что после того, как наноматериалы проникли в клетки, наноматериалы просто ингибируют выработку меланина, уменьшая окислительный стресс и хелатируя ионы металлов, и не повреждают митохондрии или ДНК, а это означает, что MWCNT и GONR безопасны для использования.

2.5. Два типа MWCNT и GONR в активности клеточной тирозиназы B16-F10 и содержании меланина.

В пути синтеза меланина решающую роль играет тирозиназа. Тирозиназа окисляет и образует эумеланин и феомеланин посредством ряда биохимических реакций. Чтобы определить, ингибируют ли GONR и MWCNT активность тирозиназы и вызывают ли снижение выработки меланина, мы проанализировали активность тирозиназы в клетках B16-F10. Мы обнаружили, что МУНТ и короткие МУНТ ингибируют активность тирозиназы примерно на 17,1% и 23% при концентрации 10 мг/л. GONR и короткие GONR лучше подавляли активность тирозиназы при тех же концентрациях по сравнению с другим GONR. Они также были дозозависимыми и ингибировали 49,8% и 44,7% активности тирозиназы, как показано на рисунке 4b.

Меланин является незаменимым пигментом в организме человека, но чрезмерная экспрессия меланина часто вызывает ряд заболеваний. В предыдущих исследованиях Xiao et al. использовали аналогичный материал, Radical Sponge, фуллереновые наночастицы, в качестве антимеланинового агента.45 Были получены хорошие результаты; около 20 процентов выработки меланина может быть подавлено. Чтобы повысить его эффективность, мы дополнительно улучшили тестируемый материал для измерения скорости ингибирования меланина и его молекулярного механизма, как показано на рисунках 4c и 5. МУНТ и короткие МУНТ снижали содержание меланина на 17,6 ± 5,5 и 13,2 ± {{ 16}}.2 процента при 10 мг/л и в зависимости от дозы. GONR и короткие GONR сильно снижали значения до 32,0 ± 2,3 и 35,3 ± 3,4 процента при 10 мг/л. Экспериментальные результаты показали, что все четыре типа могут ингибировать синтез меланина, а GONR обладают более сильным эффектом. С другой стороны, мы также заметили, что короткий GONR лучше ингибирует выработку меланина. Мы пришли к выводу, что короткие GONR имеют больше функциональных групп и могут эффективно предотвращать катализируемую ионами металлов тирозиназу, дополнительно ингибируя выработку меланина (рис. 2). В Таблице 1 мы видим, что усилие короткого типа, хелатирующего ионы металлов, выше, чем у нормального типа; это означает, что эти короткие GONR потенциально могут применяться в области косметики в качестве средств по уходу за кожей.

2.6. Механизм MWCNT и GONR ингибирует содержание клеточного меланина B16-F10.

Клетки реагируют на внешний окислительный стресс, регулируя экспрессию белка. Клетки B16-F10 усиливают экспрессию гена c-myc и активируют AMPK для снижения уровня окисления,46 и в этой работе MITF является специфическим фактором транскрипции тирозиназы, регулирующим сигнальный путь молекулярного синтеза меланина.47-49 На рисунке 5а, MWCNT и GONR подавляют фактор транскрипции, связанный с микрофтальмом, за счет уменьшения окислительного стресса, а затем нижестоящие гены TRP-1 и TRP-2 также подавляются. На уровне белка было обнаружено аналогичное явление, при котором MWCNT и GONR подавляли связанный с MITF путь меланогенеза, а затем, наконец, снижали содержание меланина (рис. 5b).

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Подготовка MWCNTs и GONRs.

Соответствующий процесс изготовления GONR описан в предыдущей статье.12 МУНТ (0.05 г) суспендировали в H2SO4/H3PO4, 9:1, и обрабатывали в микроволновом реакторе (CEM-Discover). при установленной мощности 250 Вт в течение 2 мин. После добавления KMnO4 (0,25 г) к растворам растворы обрабатывали такой же мощностью микроволн при 65 градусах в течение 4 мин12. Затем мы модифицировали этот процесс, используя более короткое время микроволн второй стадии 8 мин, используя воздушный компрессор. Здесь воздушный компрессор используется для контроля температуры микроволнового реактора во время процесса. В предварительных испытаниях мощность микроволн была установлена ​​на уровне 250 Вт.

3.2. Подготовка коротких MWCNT и коротких GONR.

Соответствующий процесс изготовления коротких GONR был описан в нашей предыдущей статье.34 Время кислотной обработки было выбрано равным 8 часам. Мощность микроволн была установлена ​​на уровне 250 Вт, что соответствует мощности для получения ГОНР.

3.3. Активность по удалению радикалов DPPH.

DPPH часто использовали для определения поглощающей способности образцов и антиокислительных свойств. 50 DPPH — это пурпурный реагент, который меняет цвет с пурпурного на желтый, если свободный радикал переносится на аналит. К раствору добавляли положительные антиоксидантные образцы с подходящими концентрациями, и образцы анализировали при 517 нм в течение 30 минут. Мы использовали процентное содержание оставшегося DPPH помимо тестируемых образцов для измерения количества антиоксиданта, необходимого для восстановления предыдущих радикалов DPPH. В качестве положительного контроля использовали витамин С в концентрации 100 мкМ. Активность очистки (в процентах) измеряли как

Способность к очистке (в процентах)=(образец – холостой контроль) / (контроль – холостой контроль) × 100 процентов (1)

3.4. Металлохелатирующая активность.

Ион металла является фактором, который вызывает чрезмерное окисление липидов, а Fe2 плюс является одним из наиболее влияющих ионов.50 Различные концентрации нанобиоматериала (1 мкл) загружали в 96-луночный планшет, который содержал 2 мМ FeCl2·4H2O. (10 мкл), а затем загружали в феррозин (5 мМ, 20 мкл). Смесь полностью смешивали с 69 мкл ментола и выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем реакционный раствор образца наблюдали при 562 нм. ЭДТА использовали в качестве положительного контроля в концентрации 100 мкМ, а формула расчета металлохелатирующей активности основывалась на уравнении 1.

3.5. Снижение мощности.

Расчет восстановительной способности основан на предыдущем исследовании.50 Сначала 2,5 мкл графеновых материалов смешивали с буфером PBS (67 мМ, pH 6,8) и K3Fe(CN)6 (2,5 мкл, 20 процентов), а затем инкубировали при 50°С. в течение 20 мин. Затем 10% трихлоруксусную кислоту (160 мкл) смешивали с реагентами при 300 g и центрифугировали в течение 20 мин. Длину поглощения определяли при 700 нм после смешивания с 25 мкл FeCl3 (2 процента). Бутилированный гидроксианизол (BHA) использовали в концентрации 100 мкМ.

3.6. Исследование пролиферации клеток.

Линия клеток дермальных фибробластов человека HS68 была использована для анализа степени пролиферации клеток. HS68 инкубировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки и 1 % смеси пенициллина и стрептомицина. 8000 клеток высевали в 96-луночные планшеты и обрабатывали образцами в течение 24 часов. Раствор супернатанта удаляли, и мы использовали раствор МТТ для культивирования в течение 2 часов при 37°С. После инкубации мы удаляли среду, содержащую МТТ, и растворяли ее в диметилсульфоксиде (ДМСО). Раствор считывали при OD 590 нм и скорость рассчитывали по уравнению 1.

3.7. Оценка содержания клеточного меланина.

Мы использовали метод с небольшими изменениями, основанный на предыдущем анализе. N NaOH и 10% ДМСО. Затем образец нагревали в течение 1 ч при 90° и центрифугировали при 10,000g в течение еще 10 мин для получения осветленного супернатанта. Количество меланина определяли путем мониторинга оптической плотности супернатанта при 475 нм.

3.8. Активность клеточной тирозиназы B16-F10.

В отношении клеточной тирозиназной активности B16-F10 мы ссылались на предыдущую работу с некоторыми модификациями.50 Клетки культивировали в 12-луночных планшетах по 105 клеток в каждой лунке. После обработки образцами клетки лизировали в 1-процентном тритоне X-100/PBS и 2 мМ L-тирозине (50 мкл) в течение 3 часов. После инкубации среду удаляли и измеряли оптическую плотность при OD 590 нм. Формула активности тирозиназы была рассчитана по уравнению 1.

Цистанхе является ингибитором тирозиназы.

3.9. Обнаружение АФК окрашиванием DCFDA.

Ссылаясь на предыдущее исследование,54 1.2 1.105 Клетки B16-F10 высевали в 6-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями образцов. Клетки суспендировали в PBS, а затем загружали DCFDA (5 мкМ) в среде DMEM без фенолового красного в течение 30 мин при 37°С. Проточный цитометр (Guava, Merck, Германия) использовали для обнаружения флуоресцентного сигнала DCFDA. Длины волн возбуждения и излучения DCFDA составляли 488 и 535 нм соответственно.

3.10. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени.

Мы следовали методам Lin et al. (2018).1 Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR) состояла из эксклюзивного праймерного зонда для генерации флуоресценции. В нем использовалась методика обнаружения флуоресценции, определяющая каждый цикл с использованием системы 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, США). Он обнаружил цикл на основе количества выпущенной флуоресценции, а затем продукт каждого цикла был рассчитан для сгенерированного содержимого, что привело к достижению количественных целей в реальном времени. Тризол (Invitrogen, США) использовали для выделения полной РНК легочной ткани в соответствии с инструкцией производителя. Впоследствии для получения ДНК использовали набор для обратной транскрипции (Takara, Япония). В qRT-PCR с использованием праймеров, перечисленных в Таблице 1, сначала образец нагревали до образования одноцепочечной ДНК; затем происходило связывание праймера с образованием двухцепочечной ДНК (дцДНК), после чего дцДНК SYBR Green объединяли, для чего использовали набор реагентов SYBR green plus (Roche, Basel, Swiss), что приводило к выделению флуоресценции. Полученный продукт пропускали через систему обнаружения флуоресценции. Обнаружение флуоресцентных сигналов происходило во время фазы удлинения или отжига каждого цикла; после обнаружения содержимое образца подвергалось обратному воздействию обнаруженной интенсивности флуоресценции.55 Уровни экспрессии генов-мишеней были нормализованы к уровням -тубулина с использованием метода 2-ΔΔCt.

мирицетин

3.11. Вестерн-блот-тест.

Клетки B16-F10 лизировали при 4 градусах в течение ночи буфером для радиоиммунопреципитации (Thermo Scientific Co., США), содержащим ингибиторы протеаз. Набор для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA, Sigma-Aldrich Corp., США) использовали для количественного определения количества белка. Образцы белков разделяли на 10-процентном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и переносили на мембрану из поливинилидендифторида (ПВДФ) (PALL Life Science, Анн-Арбор, Мичиган, США). Мембрану PVDF блокировали блокирующим буфером (Thermo Scientific) в течение 1 ч и инкубировали со специфическими первичными антителами в течение ночи при 4°С. Далее мембрану дважды промывали трис-буферным раствором-буфером Tween 20 и инкубировали со вторичными антителами в течение 1,5 ч. После этого мембрану погружали в реагенты для детектирования хемилюминесценции (Thermo Scientific) и анализировали с помощью хемилюминесцентного имидж-сканера MiniChemi (Beijing Sage Creation Science, Китай). Источники антител включали кроличьи анти-MITF, кроличьи анти-TRP-1, кроличьи анти-TRP-2 и -актин (Thermo Scientific).

3.12. Анализ материалов.

ПЭМ (JEOL JEM -1230, 100 кВ) использовали для наблюдения за морфологией наноуглеродов. Для проверки резонансных режимов наноуглеродов применяли микрорамановский спектрометр (PTT, RAMaker). Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) также была проведена для определения композиционного анализа.12,34

3.13. Статистический анализ.

Все образцы и стандартные опыты повторяли не менее трех раз. Мы применили критерий Стьюдента для сравнения и статистического выражения среднего значения средних значений ± стандартное отклонение.

4. ВЫВОДЫ

Подводя итог, мы заметили, что короткий GONR был потенциальным материалом для продуктов по уходу за кожей из-за его многочисленных биофункциональных свойств (рис. 6). Результаты показали, что наноуглероды играют роль внеклеточного и внутриклеточного антиоксиданта. Между тем, наноуглерод ингибировал активность тирозиназы и содержание меланина и не вызывал серьезного повреждения пигментных клеток. Эта работа установила антимеланогенные функции четырех типов наноуглеродов; будущие исследования будут изучать механизм воздействия этих соединений на экспрессию специфических генов и белков, связанных с созреванием, транспортировкой и накоплением меланина.

Цистанхе улучшает отбеливание.

Пожалуйста, нажмите на картинку и получите более подробную информацию.