Соответствующий уровень физических упражнений ослабляет дисбиоз кишечника и повышает уровень валериановой кислоты, улучшая нейропластичность и когнитивные функции после операции на мышах. Часть 3

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Протоколы и процедуры эксперимента были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Вирджинии (Шарлоттсвилль, Вирджиния, США; номер протокола: 3114).

Память — одна из способностей, которые нам часто приходится использовать в повседневной жизни. Это может сделать людей умнее, более чувствительными и более благоприятными для карьеры и межличностных отношений. Поэтому многие люди хотят улучшить свою память. Существует связь между экспериментальными протоколами и памятью. Давайте рассмотрим этот вопрос дальше.

Во-первых, экспериментальные протоколы могут помочь людям улучшить память. В эксперименте людям необходимо выполнить определенные шаги для завершения экспериментальной операции. Это пошаговое занятие может привести человеческий мозг в состояние повышенного внимания и концентрации, способствуя тем самым выполнению функций мозга. В то же время во время эксперимента необходимо запомнить некоторые экспериментальные данные и этапы эксперимента, что также будет тренировать функцию памяти мозга. Постоянно практикуя таким образом, ваша память постепенно улучшится.

Во-вторых, сенсорный опыт в процессе запоминания также тесно связан с разработкой плана эксперимента. В экспериментах дизайнеры часто ставят во время эксперимента определенные конкретные задачи, так что участникам необходимо повторять одну и ту же операцию несколько раз, например, запоминание и написание чисел, запоминание и распознавание цветовых блоков и т. д. Этот повторяющийся опыт может укрепить навыки людей. способности внимания и памяти, что облегчает людям обработку этой информации в долговременной памяти.

Кроме того, в экспериментах хорошие результаты может дать и использование репрезентативных стимульных материалов (например, изображений, звуков, запахов и т. д.). Потому что эти стимулы могут вызвать возбуждение мозга и процессы памяти, тем самым улучшая способность памяти людей. В то же время эти стимулы также могут быть связаны с окружающей средой и жизненными ситуациями, тем самым уменьшая вероятность разъединения и делая информацию более легкой для запоминания и более связной.

Подводя итог, можно сказать, что план эксперимента играет решающую роль в улучшении человеческой памяти. Проводя эксперименты, люди могут развивать свои когнитивные способности, улучшать уровень памяти и в то же время улучшать работу мозга. Поэтому нам следует продолжать изучать новые экспериментальные методы и участвовать в большем количестве экспериментов, чтобы улучшить уровень нашей памяти и внести больший вклад в нашу карьеру, отношения и здоровье. Видно, что нам необходимо улучшить память, а Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola обладает антиоксидантным, противовоспалительным и омолаживающим действием, что может помочь уменьшить окислительные и воспалительные реакции в мозге, тем самым защищая здоровье нервной системы. Кроме того, Cistanche Deserticola может также способствовать росту и восстановлению нервных клеток, тем самым улучшая связь и функцию нейронных сетей. Эти эффекты могут помочь улучшить память, способность к обучению и скорость мышления, а также предотвратить развитие когнитивной дисфункции и нейродегенеративных заболеваний.

Нажмите «Знать кратковременную память», как ее улучшить.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH № 80–23), пересмотренным в 2011 году. Источники ключевых материалов были перечислены в Таблице ключевых ресурсов в разделе «Дополнительные материалы».

Животные и экспериментальный дизайн

Восьминедельных самцов мышей C57BL/6 J массой 19–22 г содержали в помещении с постоянными условиями окружающей среды (температура 22–24 градуса, 12-часовой цикл света/темноты, влажность 50 ± 10%) со свободным доступом к пище. и вода.

Всем им дали возможность акклиматизироваться в течение одной недели перед экспериментами. В первом эксперименте они были случайным образом распределены на следующие группы: (1) контрольная группа (не подвергавшаяся анестезии и хирургическому вмешательству), (2) группа упражнений (тренировавшаяся с максимальной нагрузкой 35–40%, но не подвергавшаяся анестезии и хирургическому вмешательству). , (3) хирургическая группа (воздействие на левую сонную артерию в течение 15 минут под анестезией изофлураном в течение 2 часов) и (4)–(6) группы Exe-l+Sur, Exe-m+Sur и Exe-h+Sur: упражнения в 35 лет. –40%, 55–60% и 75–80% максимальной мощности соответственно и подвергались анестезии и хирургическому вмешательству.

Животных использовали для тестов на обучение и память, начиная с 4 дней после операции (n=20), или их мозг собирали для биохимических анализов через 6 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов и 7 дней после операции. (n=9 или 14), для иммунофлуоресцентного окрашивания через 48 часов и 19 дней после операции (n=6) и для окрашивания по Гольджи через 19 дней после операции (n=8).

Кровь и фекалии мышей первых 4 групп собирали для измерения SCFAs через 7 дней после операции (n=7) и для анализа 16 S через 3 и 7 дней после операции (n=8) или в конце 4-недельного протокола упражнений (n=8) ​​или в соответствующее время в первых двух группах (n=16). Мыши для сбора тканей представляли собой разные группы мышей, которых использовали для тестов на обучение и память. Во втором эксперименте мышей случайным образом распределяли в (1) группу Transcontrol+Sur и (2) группу Trans-exe+Sur.

Мышам в первой группе вводили 500 мкл фекального раствора из контрольной группы через желудочный зонд и 600 мкл посредством клизмы один раз в день в течение 7 дней подряд после лечения антибиотиками для устранения нативной микробиоты кишечника у реципиентов. Мыши во второй группе получали 500 мкл фекального раствора от мышей, тренирующихся при физической нагрузке, через желудочный зонд и 600 мкл посредством клизмы один раз в день в течение 7 дней подряд после лечения антибиотиком. Фекалии реципиентов собирали через 14 дней после трансплантации фекалий для анализа на 16 S. Затем мышей подвергли хирургическому вмешательству.

Обучение и память оценивали через 4 дня после операции (n=15). Мозг собирали для биохимических исследований, как и в первом эксперименте (n=10). В третьем эксперименте мышей случайным образом распределяли в (1) группу Transcontrol и (2) группу Trans-control+Sur. Мышам в обеих группах трансплантировали фекалии от контрольных мышей. Вторая группа была оперирована через 14 дней после фекальной трансплантации. Гиппокамп собирали через два дня после операции для измерения GDNF (n=10). В четвертом эксперименте мышей случайным образом распределяли в (1) контрольную группу (наивные мыши, которые не подвергались никаким экспериментальным условиям, описанным в этом исследовании); (2) группа антибиотиков, получавшая антибиотики в течение 7 дней, и (3) группа транс-контроля, получившая трансплантацию фекалий от контрольных мышей.

Обучение и память оценивали через 19 дней после завершения фекальной трансплантации (26 дней после завершения лечения антибиотиками в группе антибиотиков) (n=12). В пятом эксперименте мышей случайным образом распределяли в (1) контрольную группу, (2) транс-контрольная группа, которая получила трансплантацию фекалий от контрольных мышей, и (3) транс-хирургическая группа, которая получила трансплантированные фекалии от хирургических мышей. 

Трансплантацию фекалий проводили, как описано во втором эксперименте. Фекалии реципиентов собирали через 14 дней после трансплантации фекалий для анализа 16 S (n=10). Обучение и память оценивали через 4 дня после сбора образца фекалий (n=17). В шестом эксперименте мышей случайным образом распределяли в (1) группу хирургического вмешательства плюс физиологический раствор, которая получала 200 мкл физиологического раствора (НС) путем однократной внутрибрюшинной инъекции. в неделю в течение 4 недель, а затем операция, (2) упражнения плюс физиологический раствор плюс хирургическая группа, которая получила 200 мкл NS внутрибрюшинной инъекцией один раз в неделю во время 4-недельных упражнений при максимальной мощности 35–40%, а затем операцию, (3 ) группа упражнений плюс валериановая кислота плюс хирургическое вмешательство, которая получала валериановую кислоту (200 мг/кг в 200 мкл) внутрибрюшинной инъекцией один раз в неделю в течение 4-недели упражнений при максимальной мощности 35–40%, а затем хирургическое вмешательство.

Инъекцию вводили утром в первый тренировочный день недели. В день операции выполняли одну дополнительную инъекцию. Поведенческие (n=13) и биохимические (n=10) результаты оценивали так же, как и во втором эксперименте. В седьмом эксперименте 13-недельный (весом 23–27 г) самец C57BL/ 6 мышей J были случайным образом распределены в (1) контрольную группу, (2) группу NS, которая получала 4 мкл NS путем интрацеребровентрикулярной инъекции один раз в день в течение 4 дней подряд, и (3) группу валериановой кислоты, которая получала 4 мг/кг интрацеребровентрикулярно. инъекции один раз в день в течение 4 дней подряд. В левый и правый желудочки головного мозга вводили инъекции по чередующемуся графику. Обучение и память оценивали через 4 дня после инъекции (n=15).

В восьмом эксперименте мышей случайным образом распределяли в группу (1) хирургического вмешательства плюс диметилсульфоксид (ДМСО), которая получала ДМСО путем интрацеребровентрикулярной инъекции один раз в день в течение 4 дней подряд, начиная со дня операции, (2) группу хирургического вмешательства плюс антагонист C3ar, которая получала антагонист C3ar (SB290157). ) путем интрацеребровентрикулярной инъекции один раз в день в течение 4 дней, начиная со дня операции, (3) группа упражнений плюс ДМСО плюс операция, которая получала ДМСО путем интрацеребровентрикулярной инъекции один раз в день в течение 4 дней подряд, начиная со дня операции после 4-недельной тренировки в 35 лет. –40% от максимальной мощности и (4) упражнения плюс агонист C3ar плюс хирургическая группа, которая получала арагонист C3 путем интрацеребровентрикулярной инъекции один раз в день в течение 4 дней подряд, начиная со дня операции после 4-недельной тренировки при максимальной мощности 35–40%. . Поведенческие тесты начинали через 4 дня после операции, как указано выше (n=15).

В девятом эксперименте мышей случайным образом распределяли в (1) контрольную группу, (2) группу хирургического вмешательства, (3) группу хирургического вмешательства плюс GDNF, которая получала GDNF путем интрацеребровентрикулярной инъекции во время операции, и (4) операцию плюс GDNF, инактивированный теплом. группа, которая получила инактивированный нагреванием GDNF путем интрацеребровентрикулярной инъекции во время операции. Гиппокампы собирали через 48 часов после операции для исследования ELISA (n=12). После одной недели акклиматизации старых мышей (18-месячных самцов C57BL/6 Jmice) массой 30–36 г использовали в три исследования. В первом эксперименте старые мыши были случайным образом распределены в (1) контрольную группу, (2) группу упражнений, в которой мыши выполняли 4-недельные упражнения при максимальной мощности 35–40%, (3) хирургическую группу и (4) группа Exe+Sur, в которой мыши перед операцией выполняли 4-недельные упражнения с максимальной нагрузкой 35–40%. Животных использовали для тестов на обучение и память, начиная с 4 дней после операции (n=12), или их мозг собирали для биохимических анализов через 48 часов после операции (n=10 или 12), для иммунофлуоресцентного окрашивания через 48 часов. и через 19 дней после операции (n=6) и для окраски Гольгиста через 19 дней после операции (n=8).

Кровь и фекалии мышей из 4 групп собирали для измерения SCFA через 7 дней после операции (n=7) и для анализа 16 S через 3 и 7 дней после операции (n=8) или в конце. 4-недельного протокола упражнений или в соответствующее время в первых 2 группах (n=16). Мыши для сбора тканей представляли собой разные группы, которых использовали для тестов на обучение и память. Во втором эксперименте старые мыши были случайным образом распределены в (1) группу Trans-Old Control+Sur и (2) группу Trans-Old Exe+Sur. Этих мышей подвергли хирургическому вмешательству через 14 дней после фекальной трансплантации, как описано в второй эксперимент на молодых взрослых мышах. Обучение и память оценивали через 4 дня после операции (n =10).

В третьем эксперименте старые мыши были случайным образом распределены в группу (1) операция плюс NS; (2) группа упражнений плюс НС плюс хирургическое вмешательство; и (3) группа упражнений плюс валериановая кислота плюс хирургическое вмешательство. Эти мыши получали физическую нагрузку и валериановую кислоту, как описано в шестом эксперименте с молодыми взрослыми мышами. Поведенческие результаты проверяли, начиная с 4 дней после операции (n=11). Размеры выборки (n), описанные выше, представляли собой количество животных, которые были рандомизированы в каждую группу/состояние. Это количество животных представляло собой сумму по меньшей мере трех повторений каждого эксперимента. Животные были случайным образом распределены по группам на основе сгенерированных компьютером таблиц рандомизации в каждом эксперименте.

Определение максимальной физической нагрузки и тренировка

Перед операцией мышей {{0}}недельного и 18-месячного возраста подвергали 4-недельным аэробным упражнениям на беговой дорожке после определения максимальной физической нагрузки отдельных мышей. Это определение проводили способами, аналогичными описанным ранее [47, 48]. Вкратце, мышей акклиматизировали к беговой дорожке в первый день с начальными настройками ударной сетки на 25 В, 0,3 мА и 2 Гц, а скорость и наклон на нуле в течение 10 минут. Затем скорость беговой дорожки увеличили до 10 см/с с наклоном 50 на 10 минут. Затем скорость и наклон беговой дорожки увеличивали до 15 см/100 в течение 5 мин.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% времени в сети; и/или (3) отсутствие мотивации к ручному подталкиванию. Мышь была немедленно удалена с соответствующей дорожки, как только был соблюден один или несколько секретных критериев. На следующий день мыши бегали по той же беговой дорожке с половиной средней максимальной скорости (35 см/с у молодых мышей или 30 см/с у старых мышей) и наклоном 100°, пока снова не достигали одного из критериев утомления, и продолжительность непрерывную физическую нагрузку регистрировали как максимальную работоспособность каждой мыши. После этих двух протоколов мышей содержали отдельно на 30 минут, чтобы избежать заметного агрессивного поведения после тренировки.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >Будет исключено 3% общего времени в течение 3 дней подряд.

Группы, не выполнявшие упражнений, в той же серии экспериментов, что и группы, занимающиеся упражнениями, ежедневно помещались на неподвижную беговую дорожку примерно на 30–40 минут. Они получили 10 электрошоков общей продолжительностью 5 с — среднее количество электрошоков, которые мыши в группе упражнений получали каждый день во время их пребывания на неподвижной беговой дорожке. Если в серии экспериментов не было группы упражнений, ни одна мышь в серии экспериментов не подвергалась электрошоку.

Лечение антибиотиками

Чтобы облегчить колонизацию трансплантированной микробиоты, мышам-реципиентам давали лечение антибиотиками один раз в день в течение 7 дней подряд, чтобы уничтожить их исходную микробиоту кишечника, как описано нами и другими [11, 36]. Вкратце, после очищения желудка 10% сульфатом магния (200 мкл/10 г, дважды с 3-часовыми интервалами) через желудочный зонд в первый день мыши C57BL/6 J получали амоксициллин/клавулановую кислоту (200 мг/кг), метронидазол ( 200 мг/кг) и цефазолин (2 г/кг) через желудочный зонд и анденему (по 300 мкл для желудочного зонда и 400 мкл НС для клизмы) утром один раз в день в течение 7 дней подряд и амоксициллин/клавулановую кислоту (20 мг/кг). ), метронидазол (20 мг/кг) и цефазолин (300 мг/кг) по 200 мкл НС ежедневно внутрибрюшинно в течение тех же 7 дней (с 16:00 до 17:00). Чтобы предотвратить перекрестное бактериальное загрязнение, манипуляции с мышами, а также ежедневную замену клеток и бутылок с водой выполнялись техническими специалистами в чистом халате и перчатках под вентилируемым капюшоном. Фекалии этих мышей собирали через 24 часа после последней обработки для анализа 16 S для определения эффекта.

Трансплантация фекалий

Свежие фекальные гранулы, собранные в течение 30 минут после дефекации у контрольных мышей, мышей сразу после завершения 4-недельных упражнений или мышей через 2–8 дней после операции, разбавляли стерильным физиологическим раствором в концентрации 100 мг/мл. Все фекальные гранулы по 7 –10 доноров с каждым экспериментальным условием были смешаны и ресуспендированы в физиологическом растворе. Вкратце, фекалии перемешивали на вортексе в течение 5 минут, а затем пропускали через нейлоновый сетчатый фильтр с размером пор 70 мкм для удаления непереваренной пищи и твердых частиц. Мыши-реципиенты получали 500 мкл соответствующего фекального раствора через желудочный зонд утром и 600 мкл посредством клизмы во второй половине дня через 24 часа после последней дозы антибиотиков в течение 7 дней подряд. Пересаженных мышей содержали в течение 2 недель после трансплантации фекалий, прежде чем их подвергали сбору фекалий для анализа 16 S и хирургического вмешательства.

Анестезия и хирургия

Операция заключалась в обнажении левой сонной артерии, как мы описали ранее [6]. Вкратце, мышей подвергали анестезии 2% изофлурана и поддерживали спонтанное дыхание с помощью маски, в которую во время процедуры поступали 100% кислорода. Ректальную температуру контролировали и поддерживали на уровне 37 градусов с помощью греющего одеяла. Разрез шеи по средней линии 2- см и рассечение мягких тканей с обнажением общей артерии длиной 1- см выполняли без какого-либо повреждения блуждающего нерва после того, как мышь была анестезирована изофлураном в течение как минимум 20 минут. Затем рану промывали и закрывали хирургическим швом 4–0. Хирургическая процедура проводилась в стерильных условиях и длилась около 15 минут у молодых мышей и 12 минут у старых мышей. Общая продолжительность общей анестезии составила 2 часа. После операции всем животным вводили подкожную инъекцию 3 мг/кг бупивакаина. Во время анестезии реакции на пощипывание пальцев ног не наблюдалось.

Внутрицеребровентрикулярные инъекции

Как описано выше, некоторым группам мышей вводили интрацеребровентрикулярную инъекцию. Вкратце, этих мышей помещали в стереотаксическую головную рамку в положении лежа. Место инъекции располагалось на расстоянии: 1,00 мм медиолатерально, -0,3 мм переднезадне от Брегмы и -2,5 мм дорсовентрально в глубину. Мышам в хирургической группе плюс GDNF была сделана интрацеребровентрикулярная инъекция 1{{ 20}} мкг/кг рекомбинантного мышиного GDNF в 3 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), как описано в предыдущих исследованиях [6, 26], а мыши в хирургической группе плюс инактивированный нагреванием GDNF получали инъекцию денатурированного при нагревании (5 минут при 1000C) ) Решение GDNF. Мыши в хирургическом отделении плюс группа антагониста C3ar получали 10 мкг/кг SB290157 в 3 мкл PBS, содержащего 5% ДМСО, через 0, 24, 48 и 72 часа после операции. Мыши в группе упражнений плюс агонист C3ar и хирургической группе получали 1 мкг/кг агониста C3ar в 3 мкл PBS, содержащего 5% ДМСО, одновременно с SB290157. Мыши в группе, получавшей валериановую кислоту, в шестом эксперименте получали 4 мг/кг валериановой кислоты по 4 мкл в течение 4 дней подряд.

Поведенческое тестирование

Обучение и память оценивались с помощью распознавания новых объектов и теста лабиринта Барнса. Все поведенческие тесты проводились с 10:00 до 17:00 в звукоизолированной комнате. Мышей, использованных в тестах на обучение и память, не использовали для каких-либо биохимических исследований, чтобы избежать эффектов этих тестов.

Новый тест на распознавание объектов

Как мы и другие исследователи описали ранее [20, 49, 50], мышей помещали в камеру открытого поля на 5 минут для привыкания через 4 дня после операции. Испытание проводили следующим образом. В день обучения два одинаковых объекта располагались в соседних углах камеры. Мышей помещали в камеру спиной к предметам и позволяли свободно исследовать камеру в течение 5 мин. Животное исключалось, если общее время исследования двух объектов было<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Лабиринт Барнса

Через семь дней после операции животных подвергали воздействию лабиринта Барнса для проверки их пространственного обучения и памяти, как мы описали ранее [6, 49]. Лабиринт Барнса представляет собой круглую платформу с 20 равномерно расположенными отверстиями (SDInstruments, Сан-Диего, Калифорния). Одно из отверстий было соединено с темной камерой, которая называлась мишенью. Тест начался с помещения животных в центр лабиринта Барнса. Аверсивный шум (85 дБ) и яркий свет (200 Вт), падающий на платформу, использовались для того, чтобы побудить мышей найти этот ящик. После обучения в течение 4 дней их контрольную память проверяли на 5-й и 12-й день. В течение этого периода никаких тестов не проводилось. с 5-го дня по 12-й день. Задержку входа в целевую коробку во время каждого испытания регистрировали с помощью системы видеослежения ANYMaze (SD Instruments).

For more information:1950477648nn@gmail.com