Бензилированные дигидрофлавоны и производные изохинолина алкалоиды из коры Diclinanona Calycina (Annonaceae) и их цитотоксичность

Для получения дополнительной информации свяжитесь сtina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный: Diclinanona calycina RE Картофель фри, широко известный как «enviro», является видом семейства Annonaceae, эндемичным для Бразилии. В ходе нашего продолжающегося поиска биологически активных соединений из растений амазонки Annonaceae кора D.calycina была исследована с помощью классических методов хроматографии, которые дали тринадцать соединений (алкалоиды и флавоноиды), впервые описанных в D. calycina, а также в роде Diclinanona. Структура этих выделенных соединений была установлена ​​путем обширного анализа с использованием 1D/2D-ЯМР-спектроскопии в сочетании с МС. Выделенные алкалоиды идентифицированы как принадлежащие к подклассам: простые изохинолиновые, талолиевые (1); апорфин, анонаин (2); оксоапорфин, лириоденин (3); бензилтетрагидроизохинолины, (S)-(плюс)-ретикулин(4); дегидрооксонорретикулин (3,4-дигидро-7-гидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-гидрокси-4-метоксифенил)-метанон)(5 );(плюс)-1S,2R-ретикулин-Ng-оксид (6); и (плюс)-1S,2S-ретикулин-N-оксид (7); тетрагидропротоберберин, корексимин(8); и павин, бисноаргемонин (9). В то время какфлавоноидыотносятся к бензилированнымдигидрофлавоны, изорамнетин (10), дихаманетин (11) и смесь уваринола (12) и изоуваринола (13). Соединение 5 впервые описано в литературе как природный продукт. Цитотоксическую активность основных выделенных соединений оценивали в отношении раковых и нераковых клеточных линий. Среди протестированных соединений наиболее многообещающие результаты были получены для бензилированных дигидрофлавонов дихаманетина (10) и смеси уваринола (12) и изоуваринола (13), которые проявляли умеренную цитотоксическую активность в отношении испытуемых.раковая клеткалинии(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 мкг·мл-I). Дихаманетин (11) продемонстрировал цитотоксическую активность в отношении HL-60 и HCT116 со значениями IC50 15,78 мкг·мл-I (33,70 мкмоль·LI) и 18,99 мкг∶мл-（40,56 мкмоль. L-）, соответственно, в то время как смесь уваринола（12） и изоуваринола (13) продемонстрировала цитотоксическую активность в отношении HL-60 со значением IC5 9,74 мкг/мл-1, и HCT116 с IC50 стоимость 17,31 уг. мл-I. Эта цитотоксическая активность может быть связана с наличием одной или нескольких гидроксибензильных групп, присутствующих в этих молекулах, а также с положением, в котором эти группы связаны. Цитотоксическая активность ретикулина, анонаина и лириоденина была установлена ​​ранее, причем лириоденин является наиболее сильнодействующим соединением.

Ключевые слова: диклинанона кальцина; алкалоиды и бензилированные дигидрофлавоны; цитотоксическая активность

Нажмите, чтобы узнать больше о продуктах

1. Введение

Annonaceae — большое семейство тропических и субтропических деревьев и кустарников, насчитывающее около 112 родов и 2440 видов [1]. Несколько видов известны своими съедобными плодами и лечебными свойствами]2]. Предыдущие фитохимические исследования некоторых видов Annonaceae привели к выделению и характеристике различных классов вторичных метаболитов, таких как монотерпены, дитерпены, тритерпены, лигнаны,флавоноиды, производные азарона фенилпропаноиды, ацетогенины и в основном типичные производные изохинолина алкалоиды [3-7]. Некоторые из этих вторичных метаболитов, выделенных из видов Annonaceae, проявляли важную биологическую активность, такую ​​как противовоспалительные и ингибирующие уреазу свойства [8,9], трипаноцидные [10,11], лейшманицидные [11,12], противомалярийные [4,13]. , противомикробное [4,14,15], антиоксидантное и противоревматическое действия [9,15] и, в частности, цитотоксическое действие в отношении различных линий опухолевых клеток человека [4,6,11,16-21].

Хотя семейство Annonaceae считается примитивным и хорошо изученным семейством, с его видами было проведено мало фитохимических и/или фармакологических исследований[3]. Фитохимические и/или фармакологические исследования были сосредоточены в основном на видах родов Annona, Asimina и Cananga из-за их большого экономического значения, а также на некоторых видах родов Duguetia, Guatteria и Xylopia [5]. Несмотря на большой рост за последние 20 лет в отношении фитохимических и фармакологических исследований, количество исследованных видов все еще очень мало по сравнению с большим количеством признанных видов. В настоящее время, согласно научным базам данных Web of Science, Scopus и SciFinder, только около 15 процентов описанных видов Annonaceae имеют соответствующие фитохимические и/или фармакологические исследования.

К числу малоизученных относятся виды, относящиеся к роду Diclinanona Diels. Этот род относится к трибе Annoneae подсемейства Annonoideae и встречается только в тропиках Южной Америки (главным образом в районе Амазонки). Это род, состоящий только из трех видов, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas и Diclinanona tessmannii Diels, которые встречаются в виде деревьев [22-24]. Дерево высотой 30 м, известное в народе как «энвирейра» и «энвиро», распространено по всему бассейну Амазонки в Бразилии, Перу и Венесуэле [23]. D.calycina внешне похожа на Xylopia своими цветками с удлиненными и узкими лепестками, но отличается деревянистыми, нераскрывающимися, шаровидными и толстостенными монокарпами [23,24].

В предыдущих исследованиях D. calycina сообщалось только о фармакологических исследованиях. В первой работе описано исследование антимикробной активности метанольных, хлороформных и водных экстрактов в отношении микроорганизмов Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus и Candida albicans методом гель-диффузии [25]. Во втором сообщается об исследовании антимикробной активности органических (дихлорметан:метанол 1:1) и водных экстрактов в отношении микроорганизма Enterococcus faecalis с использованием анализа бульона микроразведений (MDBA) и анализа дисковой диффузии (DDA) [26]. Таким образом, в нашем постоянном поиске новых биологически активных натуральных продуктов из Annonaceae из тропических лесов Амазонки это исследование было направлено на изучение фитохимических и фармакологических свойств коры D.calycina. В этом отчете тринадцать соединений (девять алкалоидов и четыре бензилированныхдигидрофлавоны) были выделены и идентифицированы впервые у D.calycina, а также у представителей рода Diclinanona. Кроме того, исследована цитотоксичность основных соединений в отношении B16-F10, HepG2, K562 и HL{{ 4}} линий опухолевых клеток с использованием анализа с аламаровым синим.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Структурное объяснение соединений

Обнаружив в метанольном экстракте с помощью реактива Драгендорфа наличие азотсодержащих соединений, его подвергли кислотно-щелочной обработке по методике Коста с соавт. [12] с получением алкалоидной и нейтральной фракций. Высокая концентрация азотсодержащих соединений наблюдалась в алкалоидной фракции, подвергнутой хроматографическому анализу. Последовательное хроматографическое разделение, как описано в разделе «Экстракция и выделение», привело к выделению и идентификации тринадцати химических компонентов (1-13, рис. 1), девяти производных изохинолина алкалоидов 1-9 и четырех бензилированных дигидрофлавонов. 10-13. Структуры этих выделенных соединений (рис. 1) были установлены путем обширного анализа с использованием 1D- и 2D-ЯМР-спектроскопии в сочетании с МС (дополнительные данные), а также путем сравнения с данными из литературы.

Соединение 5 было получено в виде коричневого аморфного порошка и дало положительный результат на реактив Драгендорфа. Он показал протонированную молекулу с m/z328 [M плюс H]' в LR-ESI(plus)MS-совместимом с молекулярной формулой C18H1NO5. Спектры 1H и 13C-ЯМР соединения 5 (таблица 1) соответствовали спектрам ретикулина (4) [27], за исключением отсутствия связанной азотом метильной группы (CH3-N) и сигнала метиновая группа в положении 1, которая была заменена сигналом при δc 165,1 в типичном спектре 13C-ЯМР иминной группы, сопряженной с карбонильной группой при bc 192,8. В спектре H-ЯМР три атома водорода в слабом поле при δH 6,88（1H,d, J=8,4 Гц, H-5'）, 5H7,57（1H,d, J{{33} }.0Гц, H-2'）и δH 7.60（1H, dd, J=8.4 и 2.0 Гц, H-6'） , выявил наличие системы сцепления ABX. Два синглетных сигнала при 6H 6,90 (1H, с, H-8) и 6,71 (1H, с, H-5) указывают на присутствие 1,2,4,5-тетразамещенного фенильного кольца. Кроме того, спектр H-ЯМР соединения 5 также показал сигналы двух метоксигрупп, резонирующих при bH 3,93 (3H, с) и 6H 3,95 (3H, с), и сигналы двух метиленовых групп, резонирующих при δμ 2,79 (2H, t, J=7,8 Гц） и 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Гц), приписываемые H-4 и H-3 соответственно (таблица 1). . Эти данные показали, что алкалоид 5 имеет бензилтетрагидроизохинолиновый скелет [28-30].

Эти группы были установлены на основе двух- и трехсвязной карты корреляции 'H-13C из эксперимента HMBC-NMR (рис. 2 и таблица 1). Этот анализ показал, что водород с δH 3,89 （H-3）показал трехполосную корреляцию 'H-13C с атомами углерода 6c130.1（4a） и δc165.{ {42}}（C-1）и двухсвязная корреляция lH-13C с углеродом при δc 25,4(C-4), подтверждающая наличие иминной группы в молекуле. С другой стороны, сигналы при δH 7,57 (H-2') и δH 7,60 (H-6') показали трехсвязную корреляцию lH-13C с атомами углерода при δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）и δc192.8（C-7）,and5c116.0（C-2'）,6c 151.4 (C-4') и c 192,8(C-7'), соответственно, устанавливая карбонильную группу в молекуле (рис. 2 и табл. 1). Следовательно, на основании этих данных ЯМР соединение 5

был установлен как бензилтетрагидроизохинолиновый алкалоид 34-дигидро-7-гидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-гидрокси-4-метоксифенил)метанон, который назван дегидро-оксонорретикулин. Этот алкалоид впервые описан в литературе как природный продукт. Его первая и единственная запись была описана Dörnyei et al. в 1982 г. 【31】как продукт синтетического происхождения. Только данные Н-ЯМР описаны с некоторыми неопределенными кратностями. Таким образом, полные отнесения для всех химических сдвигов 1H- и 13C-ЯМР были установлены с помощью экспериментов по корреляции H-13C-ЯМР с одной связью (HSOC) и с двумя и тремя связями (HMBC) и описаны в Таблица 1.

Соединения 6 и 7 были идентифицированы как бензилтетрагидроизохинолиновые алкалоиды (плюс)-1S,2R-ретикулин-N-оксид и (плюс)-1S,2S-ретикулин-N-оксид соответственно. Данные Н-ЯМР этих алкалоидов сравнивали с данными, описанными Lee et al. [28] с использованием того же дейтерированного растворителя (CD3OD), и наблюдались некоторые несоответствия (таблица 1), в основном в отношении H-1, H-8 и H, C-NO. Данные 13С-ЯМР, описанные для этих алкалоидов, в литературе отсутствуют. На основании ограниченных данных 1H- и 13C-ЯМР, а также неоднозначностей, наблюдаемых для этих молекул, были проведены эксперименты 1H и 13C 1D и 2D ЯМР для определения их правильного отнесения и множественности.

Правильное положение атомов водорода H{{0}} и H-1 обоих изомеров 6 и 7 было установлено на основе трехсвязной корреляционной карты 'H-13C из HMBC. -Эксперимент ЯМР (рис. 2). Для изомера 6 анализ показал, что водород при δH 5,78 (H-8) показал трехсвязную корреляцию 'H-13C с атомами углерода при 6c 79,8 (C-1), δc120 .6（4a） и δc 149,4 （C-6）, в то время как водород при δH 4,13 （H-1）показал трехсвязную корреляцию 'H-13C с углеродом при c 60,7（C-3）, 6c 115,7 （C-8）, δc 120,6（C-4a） и 131,2 （C-1'）, тем самым устанавливая правильное положение атомов водорода H-8 и H-1 для изомера 6. Это отнесение может быть дополнительно подтверждено анализом водорода при δH 6,76 (H-5), который показал наличие трех связей Корреляция H-13C с углеродом при δc 27,0 (C-4), δc 127,1 (C-8a) и δc 145,7 (C-7)） (рис. 2). Для изомера7 анализ показал, что водород при δH 6,30 (H-8) демонстрирует трехсвязную корреляцию 'H-13C с атомами углерода при δc 79,4 (C-1), δc 122,8（ 4a） и δc 148,9 （C-6）, в то время как водород при δH 4,46 （H-1）показал трехсвязную корреляцию H-13C с атомами углерода при δc 62,9 （C{ {82}}）, 5c 115,5（C-8）, bc 122.8（C-4a） и 131.4（C-1'）, таким образом установив правильное положение атомов водорода H -8 и H-1 для изомера 7. Это отнесение также было подтверждено анализом водорода при δH 6,71 （H-5）, который показал три связи lH-13C корреляции с атомами углерода при δc 26,3 (C-4), δc 126,9 (C-8a) и 6c 146,1 (C-7) (рис. 2). Был также проведен эксперимент NOESY для установления правильной стереохимии изомеров 6 и 7. В этом эксперименте сильная корреляция NOE H-1（δH 4,13）и H, CN(5 3.15) указывала на -ориентация кислорода в изомере 6. С другой стороны, в эксперименте 2D-NOESY для 7 не удалось обнаружить очевидной корреляции NOE между H-1(6H 4,46) и HAC-N(5H 3,20), что указывает на -ориентацию кислорода в изомере 7 (рис. 2). Эти небольшие различия в химических сдвигах этих изомеров четко наблюдаются из-за стереохимии азота, на которую влияют положения и кислорода. Сравнение данных Н- и 13С-ЯМР, полученных для соединений 6 и 7, с данными для молекул с близкой структурой, таких как гексапеталин А и гексапеталин В [30], однозначно подтверждает данные, приведенные в табл. 1.

Соединения 1-4 и 8-13 были идентифицированы как талифолин (1) [32], анонаин (2) [33], лириоденин (3) [10,34], (S)-(плюс)-ретикулин ( 4)[27], корексимин (8) [34,35], бисноаргемонин (9)[36], изохаманетин (10) [37], дихаманетин (11) [37] и смесь уваринола (12) и изоуваринола (13) [37] на основе их спектроскопических профилей и сравнения со значениями в литературе. Спектры 1H- и 13C 1D и 2D-ЯМР, а также масс-спектры всех выделенных соединений доступны в качестве дополнительных материалов.

С хемофенетической (новый термин для хемосистематики растений/хемотаксономии растений) точки зрения важно отметить, что присутствие С-бензилированных флаванонов и С-бензилированных дигидрохалконов представляет собой особый тип флавоноидов, полученных из хорошо известного флаванона пиноцембрина. и были описаны, в частности, у видов рода Uoaria, принадлежащих к семейству Annonaceae [3, 38-42]. Присутствие этих соединений в D. calycina предполагает тесную хемофенетическую связь с Uoaria. С другой стороны, необходимо провести дальнейшие исследования с другими частями растения, а также с другими видами Diclinanona, чтобы подтвердить эту хемофенетическую связь. Флаваноны и халконы широко распространены в высших растениях, но добавление бензильных групп встречается довольно редко и, по-видимому, ограничено у Annonaceae родом Uoaria [3, 39-42], а теперь и родом Diclinanona. Бензильные группы предположительно возникают в пути C6-C1, но о-гидрокси функциональность необычна. Отсутствие заместителей в кольце В у всех этих флавоноидов Uoaria и Diclinanona может быть связано с предыдущим наблюдением относительно флавоноидов Popowia cauliflora [38].

Алкалоиды изохинолинового происхождения, выделенные и описанные в данной работе, уже зарегистрированы у нескольких видов Annonaceae разных родов. Некоторые из них, такие как лириоденин и аноаин, считаются хемофенетическими маркерами, и присутствие этих алкалоидов в D.calycina еще больше подтверждает взаимосвязь этих хемофенетических маркеров в семействе Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Стоит отметить, что, согласно Зидорну [44], хемофенетические исследования определяются как исследования, направленные на описание множества специализированных вторичных метаболитов в данном таксоне, как это уже наблюдалось в нескольких опубликованных работах [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Таким образом, хемофенетические исследования вносят свой вклад в фенетическое описание таксонов, подобно анатомо-морфологическим и кариологическим подходам, которые уже получили признание как имеющие большое значение для установления «природных» систем и которые продолжают иметь чрезвычайно важное значение для описание классифицируемых организмов с помощью современных молекулярных методов [44].

2.2. Цитотоксический анализ

Цитотоксическую активность выделенных соединений in vitro (табл. 2), за исключением соединений 2, 3, 5 и 8 (из-за их низкого выхода), оценивали в сравнении сраковая клеткалинии HL-60 (промиелоцитарный лейкоз человека), MCF-7(аденокарцинома молочной железы человека), HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), HCT116 (карцинома толстой кишки человека) и нераковая клеточная линия MRC{{5} } (фибробласты легких человека) с использованием анализа с аламаровым синим после 72 ч инкубации.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 мкг.мл-1). Дихаманетин (11) показал цитотоксическую активность в отношении HL-60 и HCT116 со значениями IC50 15,78 мкг·мл-1 (33,70 мкмоль·л-1) и 18,99 мкг·мл-1（40,56 мкмоль.л-1） соответственно. Смесь уваринола (12) и изоуваринола (13) продемонстрировала цитотоксическую активность в отношении HL-60 со значением ICs0 9,74 мкг∶мл-1 и HCT116 со значением ICs0 17,31 мкг∶мл{ {30}}. Среди бензилированных дигидрофлавонов только изорамнетин (10) проявлял цитотоксическую активность в отношении HepG2 со значением IC50 19,79 мкг:мл-1(54,65 мкмоль.л-1). Согласно литературным данным, бензилированные дигидрофлавоны описаны с цитотоксическими свойствами [39-42]. Среди описанных в данной работе изорамнетин (10), дихаманетин (11) и уваринол (12) описаны in vitro цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеточных линий карциномы носоглотки (КБ) и P-388 лимфоцитарного лейкоза. (PS) со значениями IC50 5,3 и 4,1, 4,8 и 1,8 и 5,9 и 9,7, мкг/мл-1 соответственно [39,40]. Эти разные активности можно объяснить наличием одной или нескольких гидроксибензильных групп, присутствующих в молекулах, а также положением, в котором эти группы связаны. Однако для подтверждения этого наблюдения необходимы дальнейшие исследования.

Цитотоксическая активность in vitro производных изохинолина алкалоидов анонаина (2), лири-аденина (3) и (S)-(плюс)-ретикулина (4) была недавно описана Menezes et al. [2{{16]. }}], Souza et al. [6] и Коста и соавт. [43] с упором на лириоденин, который продемонстрировал мощную цитотоксическую активность в отношении линий раковых клеток B{{10}}F10(меланома мыши), HepG2(гепатоцеллюлярная карцинома человека), HL{{13 }} (промиелоцитарный лейкоз человека) и K562 (хронический миелоцитарный лейкоз человека) со значениями IC5s0 ниже 10,0 мкмоль.л-1【43】. Анонаин проявлял умеренную активность в отношении B16-F10, HepG2, HL60. , и K562 со значениями IC50 ниже 19,0 мкмоль л-1[20].(S)-(плюс)-ретикулин показал умеренную активность только против HepG2 со значениями IC50 15,35 мкмоль л-1【 6,20】.

3. Материалы и методы

3.1. Общие экспериментальные процедуры

Оптические вращения в метаноле (MeOH) регистрировали поляриметром P{{0}} (Jasco, Токио, Япония) при 589 нм. Эксперименты 1D и 2D ЯМР были получены в CDCl. (хлороформ-d) или CDCl плюс капля CD, OD (метанол-du и CD, COCD3 (ацетон-d6) при 298 K на ЯМР-спектрометре AVANCE I HD (Bruker, Billerica, MA, USA), работающем при 11,75 T (Hand 13C при 500 и 125 МГц соответственно) и на ЯМР-спектрометре Bruker AVANCE I 600, работающем при 14,1 Тл ('H и 13Cat 60{ {63}} и 150 МГц соответственно). Все химические сдвиги 1H- и 13C-ЯМР (δ) представлены в м.д. относительно сигнала тетраметилсилана при 0,00 м.д. в качестве внутреннего стандарта, и константы связи (D) даны в Гц. Спектрометр ЯМР был оснащен многоядерным обратным зондом 5- мм (эксперименты 1D и 2D ЯМР) с z-градиентом. Одна связь (HSQC) и две и Эксперименты по корреляции с тремя связями (HMBC)1H-13C-ЯМР были оптимизированы для средней константы связи JcH и LRJ(cH 140 и 8 Гц соответственно. Для анализа масс-спектрометрии с низким разрешением (ЖХ-МС) образцы выделенных соединений ресуспендировали в метаноле (чистота для ВЭЖХ), создавая сток. k растворов (1 мг·мл-1). Аликвоты (5 мкл) исходных растворов дополнительно разбавляли до 5 мкг·мл и анализировали путем прямого вливания в масс-спектрометр с тройным квадруполем, модель TSO Quantum Access (Thermo Scientific, Сан-Хосе, Калифорния, США), оснащенный ионизацией электрораспылением. (ESI) или источники химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Условия ESI-MS: напряжение аэрозоля, 5 кВ; газ в оболочке, 10 условных единиц (усл.); вспомогательный газ, 5 условных единиц; продувочный газ, 0 условных единиц; капиллярная температура, 250 градусов; капиллярное напряжение, 40 В; тубусная линза, 70 В; диапазон масс, m/z от 100 до 1000. Условия APCI-MS: ток разряда, 5 мкА; температура испарителя, 350 градусов; давление газа в оболочке, 25 условных единиц (усл.); давление газа ионной очистки, 0,0 усл. ед.; давление вспомогательного газа, 10 усл. ед.; капиллярная температура 250°С; смещение тубусной линзы, 70 В; смещение скиммера, 0 В; диапазон масс, m/z от 100 до 1000. В качестве газа для столкновений использовали аргон, а спектры МС/МС получали с использованием энергий столкновений в диапазоне от 25 до 30 эВ. Силикагель 60 (Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США, 70-230 меш) использовали для колоночной хроматографии (CC), а силикагель 60 F254 (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия, 0,25 мм, алюминий) использовали для аналитической и препаративной тонколаверной хроматографии (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 мм, стекло). Соединения визуализировали экспонированием в свете УФ 254/365, распылением реагента п-анисового альдегида с последующим нагреванием на плитке и распылением реактива Драгендорфа.

3.2. Растительный материал

В настоящем исследовании ботанический материал (кора) D.calycina был собран 27 мая 2017 г. в заповеднике Адольфо Даке (географические координаты: 02° 53'36,1 ю.ш. и 59° 58'28,9" з.д.), Манаус, штат Амазонас. , Бразилия, и идентифицирован профессором доктором Антонио Карлосом Уэббером, систематиком растений факультета биологии Федерального университета Амазонас (DB/UFAM). Образец ваучера номер 10810 был депонирован в Гербарии DB/UFAM. доступ (образец) был зарегистрирован в Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) с записью A70EDCD.

3.3. Извлечение и изоляция

Кору D.calycina вначале сушили при комнатной температуре в течение 24 ч, затем сушили в печи с циркуляцией воздуха в течение 48 ч при температуре 40°С, а затем измельчали ​​в четырехножевой мельнице (Marconi, Piracicaba, SP. , Бразилия) для получения порошкообразного материала (1340 г). Затем проводили исчерпывающую мацерацию гексаном (8×4 л), а затем MeOH (8×4 л). Полученные экстрактивные растворы концентрировали в роторном испарителе при пониженном давлении (40-50 градусов) с получением гексанового (24,85 г) и метанолового (199,43 г) экстрактов соответственно.

Анализ ТСХ, выявленный с помощью реактива Драгендорфа, показал высокое содержание алкалоидов в экстракте МеОН. Поэтому аликвоту экстракта МеОН (188,30 г) сначала подвергали кислотно-щелочной экстракции с получением алкалоидной (5,46 г) и нейтральной (4,47 г) фракций. Затем часть алкалоидной фракции (5,0г) подвергали хроматографической колонке (ХК) с силикагелем, предварительно обработанной 10-процентным раствором NaHCO3 [12], элюируя гексаном (100-процентным), гексаном-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 и 10:90, об./о), CH2Cl2 (100 процентов), CH2Cl 2-EtOAc (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90,0/ед), EtOAc (100 процентов), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 и 10:90, об/о), и, наконец, MeOH с получением 250 фракций (по 30 мл каждая). После оценки ТСХ с использованием смеси CH2Cl2-MeOH в пропорциях 95:05, 90:10, 85:15 и 80:20 в качестве системы элюента (об/о), аналогичные образцы объединяли, чтобы получить 16 фракций (от F1 до F16).

Фракция F5 (181,2 мг) из исходной CC, элюированная гексаном-CH,Cl2 (от 50:50 до 10:90, по объему), подвергалась воздействию нового силикагеля CC с использованием той же методики, что и выше, элюированная гексаном (100%), гексаном. -CH,Cl2 (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, об./о), CH,Cl , (100 процентов), CHCl2-EtOAc (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90 , о/), EtOAc (100 процентов), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 и 15:85, /о) и MeOH (100 процентов), что дает 118 фракций ( по 15 мл), которые были объединены в 12 подфракций (от F5.1 до F5.12), согласно оценке ТСХ с использованием смеси CH2Cl2-MeOH в пропорциях 95:05 и 90:10. Подфракция F5 .1 (28,9 мг), элюированный гексаном (100 процентов), подвергали препаративной ТСХ, элюированной CH, Cl-MeOH (95:05, об./об., два элюирования), с получением 2 (1,4 мг) и 3 (1,7 мг), соответственно. Субфракции F5.4 (21,5 мг), элюированные гексаном-CH,C(80:20,во), F5.5 (16,7 мг), элюированные гексаном-CH,Cl(80:20,70:30,60;40. и 50:50). , об/), и F5.6 (15,4 мг), элюированные смесью гексан-CHCl2 (50:50, 40:60 и 30:70, об/о), объединяли (53,6 мг) и также подвергали препаративной ТСХ. с CH,Cl-MeOH (95:05, объем/объем, два элюирования) с получением 3 (8,9 мг).

Фракция F6(2099,1 мг) исходного КК, элюированная смесью гексан-CHCl(10:90, об/)), CH2Cl, (100 процентов) и CH,Cl2-EtOAc (от 90:10 до 10:90, о/о) подвергали воздействию нового силикагеля CC с использованием той же методики, что и выше, элюируя теми же системами растворителей, что давало 140 фракций (30 мл каждая). После проведения ТСХ с использованием смеси CH2Cl2-MeOH в пропорциях 95:05, 90:10 и 85:15 в качестве элюирующей системы (о/о) аналогичные образцы были объединены в 13 подфракций (F6 .1 до F6.13). Подфракцию F6.6 (1541,3 мг) обрабатывали новым силикагелем CC с использованием той же методики, что и выше, элюируя теми же системами растворителей, что давало 120 фракций (по 30 мл каждая), которые анализировали с помощью ТСХ (используя ту же методологию, указанную выше), что давало 12 новых подфракции (от F6.6.1 до F6.6.12). Подфракцию F6.6.2 (17,0 мг), элюированную смесью гексан-CH,Cl, (60:40 и 50:50, об./об.), подвергали препаративной ТСХ с элюированием CH2Cl2-MeOH (90:10, об./о, одно элюирование), что дает 3 (1,4 мг). Подфракция F6.6.3 (643,3 мг), элюированная смесью гексан-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, о/о), CH2Cl2 (100 процентов) и CH2Cl2-EtOAc (90:10 и 80:20, о/о) подвергали препаративной ТСХ, элюированной CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, одно элюирование) с получением новой подфракции F6.6.3.1 (161,8 мг), которую подвергали новой препаративной ТСХ с элюированием EtOAc-MeOH (90:10, об./о, одно элюирование) с получением 4(148,2 мг). Подфракцию F6.6.4 (90,2 мг), элюированную CH2Cl2-EtOAc (70:30 и 60:40, о/о), подвергали препаративной ТСХ с элюированием CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, одно элюирование) с получением 1 (1,4 мг) и 4 (50,1 мг) соответственно. Подфракцию F6.6.5 (83,4 мг), элюированную CH,Cl-EtOAc (60:40 и 50:50, о/о), также подвергали препаративной ТСХ с CH,Cl2-MeOH (90:10, ufo, одно элюирование), снова давая 1 (1,5 мг) и 4 (45,5 мг) соответственно. Подфракцию F6.6.6 (101,4 мг), элюированную CH,Cl2-EtOAc (50:50 и 40:60, об./), подвергали препаративной ТСХ с элюированием CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, одно элюирование), дающее 8 (3,4 мг), и другую подфракцию F6.6.6.1 (48,8 мг). Эту подфракцию (F6.6.6.1) подвергали препаративной ТСХ, сначала элюируя смесью EtOAc-MeOH (85 :15, об., одно элюирование) и затем CHCl-MeOH (90:10, об./об., одно элюирование), что снова дает 4 (37,4 мг). Для этой процедуры хроматографическую пластину сначала элюировали подвижной фазой EtOAc-MeOH (85:15, об/о, одно элюирование). После этого элюирования хроматографическую пластину сушили для удаления растворителя, а затем подвергали новому элюированию подвижной фазой CH,Cl,-MeOH (90:10, vf, одно элюирование), получая 4. Подфракция F6.6.7 ( 109,0 мг), элюировали CH,Cl2-EtOAc (40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, vfo), подвергали препаративной ТСХ, элюировали CH,Cl2-MeOH (90:10, об., одно элюирование), что дает другую подфракцию F6.6.7.1 (24,8 мг), которую подвергают новой препаративной ТСХ, сначала элюируя смесью EtOAc-MeOH (85:15, об./об., одно элюирование), а затем CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, одно элюирование), что дает 9 (11,1 мг). Процедура выделения, использованная для соединения 9, была такой же, как описано ранее для соединения 4. Подфракцию F6.6.10 (92,0 мг), элюированную смесью EtOAc-MeOH (60:40 и 50:50, об./о), подвергали препаративной ТСХ, элюированной CH, Cl1-MeOH (90:10, об./о, одно элюирование) с выходом 5 (1,7 мг) и 6 (7,8 мг) соответственно. Подфракцию F6.6.11 (326,0 мг), элюированную EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90, об./о), подвергали препаративной ТСХ, элюированную CHCl- MeOH (90:10, об./о, одно элюирование) с 1 (2,4 мг) и 7 (12,5 мг) соответственно.

Фракция F7 (692,4 мг) из исходного CCelluted с помощью EtOAc (100 процентов) и CHCl2-EtOAc (95:05, 90:10, 85:15 и 75:25, ofo) подвергалась воздействию нового силикагеля. CC с использованием той же методологии, что и для исходного CC с теми же системами растворителей, что дает 110 фракций (по 30 мл каждая). После оценки ТСХ с использованием смеси CH2Cl2-MeOH в пропорциях 95:05, 90:10 и 85 :15 в качестве системы элюирования (о/о), аналогичные образцы объединяли, чтобы получить 12 подфракций (от F7.1 до F7.12). F7.8 (147,4 мг), элюированных CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 и 30:70, об./об. %) подвергали препаративной ТСХ с элюированием смесью CHCl-MeOH (95:05, vfo, одно элюирование), получая 10 (5,4 мг) и 11( 120,6 мг) соответственно. F7.9 (144,2 мг), элюированный CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 и 10:90, объемные проценты), также подвергали препаративной ТСХ, элюированной CH,Cl,-MeOH( 95:05, об., одно элюирование) с получением 11 (91,2 мг) и смеси 12 и 13 (39,4 мг) соответственно.

Талифолин (1): коричневый аморфный порошок; Н-ЯМР и 13С-ЯМР в соответствии с литературой [32]; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H]* плюс m/z 208.

Анонаин (2): коричневый аморфный порошок; 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР в соответствии с литературой [33]; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 266.

Лириоденин (3): желтые кристаллы (CH,Cl-MeOH 3:1); 1H-ЯМР и 13C-ЯМР в соответствии с литературой [10,34]; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 276.

(S)-(плюс)-ретикулин(4): коричневый аморфный порошок; [ ]p25 плюс 71,60(c 0,05 г/100 мл, MeOH); 1H-ЯМР и 13C-ЯМР в соответствии с литературой [27; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 30.

3,4-Дигидро-7-гидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)(3-гидрокси-4-метоксифенил)метанон (дегидрооксонорретикулин)(5 ): коричневый аморфный порошок; данные Н и 13С-ЯМР, см. таблицу 1; LR-ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 328.

(плюс){{0}}S,2R-ретикулин-N-оксид(6): коричневый аморфный порошок; [lp25 плюс 136,4 (с0,146 г/100 мл, МеОН); 1 Данные 13C-ЯМР, см. Таблицу 1; LR-APCI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/2346

(плюс){{0}}S,2S-ретикулин-N-оксид (7): коричневый аморфный порошок; [ ]p25 плюс 394,5 (c 0,03 г/100 мл, MeOH); данные 1H и 13C-ЯМР, см. таблицу 1; LR-APCI(plus)-MS [M plus H] плюс m/z346.

Корексимин (8): светло-желтый аморфный порошок; [ ]p25 плюс 201.1(c 0,08 г/100 мл, MeOH)'H-ЯМР и 13C-ЯМР в соответствии с литературными данными [34,35]; LR- ESI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 328.

Бисноаргемонин (9): коричневый аморфный порошок; 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР в соответствии с литературой [36]; LR-APCI(плюс)-МС [M плюс H] плюс m/z 328.

Изохаманетин (10): светло-желтый аморфный порошок; [ p25-12.4(c 0,5 г/100 мл, MeOH) 1H-ЯМР и 13C-ЯМР в соответствии с литературой [37; LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Дихаманетин (11): желтый аморфный порошок; [ ]D25-10.7(c0.5 г/100 мл, MeOH); 1H-ЯМР и 13C-ЯМР в соответствии с литературой [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Смесь уваринола(12) и изоуваринола(13): желтый аморфный порошок; Н-ЯМР и 13С-ЯМР в соответствии с литературой [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4. Цитотоксический анализ in vitro

3.4.1.Ячейки

HL-60 (промиелоцитарный лейкоз человека), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), HCT116 (карцинома толстой кишки человека) и MRC-5 (фибробласты легких человека) клеточные линии были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния, США) и культивированы в соответствии с рекомендациями руководства АТСС по культуре клеток животных. Все клеточные линии тестировали на микоплазму с использованием набора для окрашивания микоплазмы (Sigma-Aldrich) для проверки использования клеток, свободных от контаминации.

3.4.2. Анализ цитотоксичности

Для анализа цитотоксичности жизнеспособность клеток количественно определяли методом аламарового синего, как описано ранее [{{0}}]. Для всех экспериментов клетки высевали в 96-луночные планшеты. Химические компоненты растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Бразилия), добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 72 часов. Доксорубицин (гидрохлорид доксорубицина, чистота выше или равная 95 процентам, Лаборатория IMA SAIC, Буэнос-Айрес, Аргентина) использовали в качестве положительного контроля. В конце лечения использовали 20 мкл маточного раствора (0,312 мг/мл) резазурина. (Sigma-Aldrich Co.) добавляли в каждую лунку. Поглощение при 570 нм и 600 нм измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов SpectraMax190 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США). Полуингибирующую концентрацию (IC50) определяли методом нелинейной регрессии. с 95-процентными доверительными интервалами (CI95 процентов) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; Сан-Диего, Калифорния, США).

4. Выводы

Фитохимическое исследование коры D.calycina привело к выделению и идентификации тринадцати соединений (1-13); девять алкалоидов изохинолинового происхождения (1-9) и четырефлавоноиды(10-13). Алкалоиды относятся к следующим подклассам: простые изохинолины, талолины (1); апорфины, анонаины (2); оксоапорфин, лириоденин (3); бензилтетрагидроизохинолины, (плюс)-ретикулин(4), дегидрооксонорретикулин(3,4-дигидро-7-гидрокси-6-метокси-1-изохинолинил)({{13} }гидрокси-4-метоксифенил)-метанон)(5), 1S,2R-ретикулин-Ng-оксид(6) и 1S,2S-ретикулин-N-оксид (7); тетрагидропротоберберин, корексимин (8) и павин, бисноаргемонин (9). В то время как к флавоноидам относятся бензилированные дигидрофлавоны, изорамнетин (10), дихаманетин (11) и смесь уваринола (12) и изоуваринола (13). Выделенные соединения впервые описаны для D.calycina, а также для рода Diclinanona.

Цитотоксическую активность выделенных соединений (кроме аноонаина, лириоденина, 1,2-дигидрооксонорретикулина и корексимина) оценивали в отношении рака (HL-60, MCF-7, HepG2 и HCT116) и нераковые (MRC-5) ​​клеточные линии. Среди них наиболее многообещающие результаты наблюдались для бензилированных дигидрофлавонов дихаманетина (10) и

смесь уваринола (12) и изоуваринола (13), которая показала умеренную цитотоксическую активность в отношении протестированных линий раковых клеток (（<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 мкг·мл-'). Дихаманетин (11) продемонстрировал цитотоксическую активность в отношении HL-60 и HCT116 со значениями IC50 15,78 мкг·мл-1 (33,70 мкмоль-л-1) и 18,99 мкг·мл-I (40,56 мкмоль). .L-1） соответственно, в то время как смесь уваринола （12） и изоуваринола (13) продемонстрировала цитотоксическую активность в отношении HL-60 со значением IC50 9,74 мкг∶мл-I, и HCT116 с IC50 значение 17,31 мкг·мл-1. Эти результаты на линиях опухолевых клеток также впервые описаны для бензилированных дигидрофлавонов. Ранее была установлена ​​цитотоксическая активность ретикулина, анонаина и лириоденина, из которых лириоденин является наиболее сильным соединением.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что виды семейства Annonaceae являются перспективным источником биологически активных соединений, обладающих цитотоксическими свойствами, и предполагают продолжение их изучения в других моделях биологических тестов.

использованная литература

1. Куврёр, ТЛП; Пири, доктор медицины; Шатру, LW; Сондерс, РМК; Вс, YCF; Ричардсон, Дж. Э.; Erkens, RHJ Ранняя эволюционная история семейства цветковых растений Annonaceae: устойчивая диверсификация и бореотропическое георасселение. Дж. Биогеогр. 2011, 38, 664–680. [Перекрестная ссылка]

2. Корреа, член парламента Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1984.

3. Лебёф, М.; Кейв, А .; Бхаумик, ПК; Мукерджи, Б.; Мукерджи, Р. Фитохимия Annonaceae. Фитохимия 1982, 21, 2783–2813. [Перекрестная ссылка]

4. Рупрехт, Дж. К.; Хуэй, Ю.-Х.; Маклафлин, Дж. Л. Анноновые ацетогенины: обзор. Дж. Нат. Произв. 1990, 53, 237–278. [Перекрестная ссылка]

5. Лусио, ASSC; Алмейда, JRGDS; Да-Кунья, EVL; Таварес, Дж. Ф.; Filho, JMB Алкалоиды Annonaceae: возникновение и подборка их биологической активности. В Алкалоидах; Кнолкер, Х.-Дж., изд.; Elsevier: Амстердам, Нидерланды, 2015 г.; Глава 5; Том 74, стр. 233–409. [Перекрестная ссылка]

6. Соуза, CAS; Нарделли, В.Б.; Пас, WHP; Пинейро, MLB; Родригес, ACBC; Бомфифим, Л.М.; Соарес, MBP; Безерра, Д.П.; Чаар, Дж. С.; Кулен, ХХФ; и другие. Фенилпропаноиды, полученные из азарона, и алкалоиды, полученные из изохинолина, из коры Duguetia pycnastera (Annonaceae) и их цитотоксичность. Ким. Нова 2020, 43, 1397–1403. [Перекрестная ссылка]

7. Араужо, М.С.; Сильва, FMA; Кулен, ХХФ; Коста, Е.В. Алкалоиды, полученные из изохинолина, из коры Guatteria olivacea (Annonaceae). Биохим. Сист. Экол. 2020, 92, 104105. [Перекрестная ссылка]

8. Нгуонпе, А.В.; Мбобда, ASW; Хаппи, гроссмейстер; Мбиантча, М .; Татуэдом, ОК; Али, MS; Латиф, М .; Чуанкеу, Дж. К.; Куам С.Ф. Натуральные продукты из лекарственного растения Duguetia staudtii (Annonaceae). Биохим. Сист. Экол. 2019, 83, 22–25. [Перекрестная ссылка]

9. Сантос, Р.К.; Соуза, А.В.; Андраде-Силва, М.; Круз, KCV; Кассуя, Калифорния; Кардосо, Калифорния; Виейра, MC; Formaggio, ASN Антиоксидантное, противоревматическое и противовоспалительное исследование экстракта и дицентринона из Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Крюк. ф. Ж. Этнофармакол. 2018, 211, 9–16. [Перекрестная ссылка]

10. Коста, Э.В.; Пинейро, MLB; Соуза, АДЛ; Барисон, А .; Кампос, Франция; Вальдес, Р. Х.; Уэда-Накамура, Т.; Диас Филью, BP; Накамура, К.В. Трипаноцидная активность оксоапорфиновых и пиримидин- -карболиновых алкалоидов из ветвей Annona foetida Mart. (анноновые). Молекулы 2011, 16, 9714–9720. [Перекрестная ссылка]

11. Сильва, Д.Б.; Тулли, ЭКО; Милита, GCG; Коста-Лотуфо, Латвия; Пессоа, К.; Мораес, Миссури; Альбукерке, С.; Сикейра, Дж. М. Противоопухолевая, трипаноцидная и противолейшманиальная активность экстракта и алкалоидов, выделенных из Duguetia furacea. Фитомедицина 2009, 16, 1059–1063. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

12. Коста, Э.В.; Пинейро, MLB; Ксавьер, см; Сильва, JRA; Амарал, АКФ; Соуза, АДЛ; Барисон, А .; Кампос, Франция; Феррейра, АГ; Мачадо, GMC; и другие. Пиримидин- -карболин и другие алкалоиды Annona foetida с противолейшманиозной активностью. Дж. Нат. Произв. 2006, 69, 292–294. [Перекрестная ссылка]