Повышение противораковой активности таксола Aspergillus Favus, «эндофита жожоба», посредством конъюгации с наночастицами золота, опосредованного облучением

Таксол Альтернативные китайские травы Cistanche

Ключевые слова:Aspergillus favus · Жожоба · Эндофитные грибы · Наночастицы золота · Таксол · Облучение · Оптимизация питания

Введение

Таксол является одним из наиболее коммерциализируемых препаратов широкого спектра действия.противораковые препараты[1]. Активность таксола обусловлена ​​его уникальной специфичностью связывания с клеточным гетеродимером субъединиц тубулина, что способствует полимеризации тубулина, нарушая тем самым митотическое деление опухолевых клеток [2]. Таксол проявлял сильную активность в отношении рака молочной железы, легких, головы и шеи, рака матки и запущенных форм саркомы Капоши [3]. Таксол впервые был получен из коры тиса Taxus brevifolia «семейства Taxaceae» [4, 5]; однако более низкий выход таксола, который<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as астма,воспаление, ирак[32]. Таким образом, основной целью данной работы было изучение нового грибкового изолята из растения жожоба с уникальной метаболической стабильностью для производства таксола, оценка различных подходов для максимизации их выхода таксола, а также для усиления антипролиферативной активности экстрагированных соединений таксола. через конъюгацию с наночастицами золота, опосредованную гамма-облучением.

Материал и методы

Выделение и культивирование эндофитных грибов.

Различные части жожоба (Simmondsia chinensis) в виде листьев, коры, веток и почек были собраны на сельскохозяйственном факультете Каирского университета и использованы в качестве источника эндофитных грибов. Части растений собирали и промывали под проточной водопроводной водой, стерилизовали поверхность 70-процентным этанолом в течение 1 мин, а затем промывали стерильной водой [28]. Поверхностно стерилизованные части растений разрезали на мелкие кусочки в стерильных условиях и помещали на чашки со средой с картофельно-декстрозным агаром (PDA), средой Чапека-Докса и агаровой средой с солодовым экстрактом [33–36], и чашки инкубировали при 30 градусах в течение 10 дней. Эффективность поверхностной стерилизации частей растений оценивали путем центрифугирования промывной воды, затем к осадку добавляли 500 мкл стерильной воды и высевали на среду PDA [37]. Очищенные изоляты эндофитных грибов инокулировали на скошенные участки КПК в течение 7 дней и хранили при 4°С.

Скрининг, экстракция и количественная оценка таксола из эндофитных грибов

Восстановленные эндофитные грибы, населяющие жожоба, были проверены на продукцию таксола путем выращивания на картофельно-декстрозном бульоне (PDB) [38]. По одной пробе каждого из 7-дневных изолятов грибов инокулировали в 100 мл PDB/250 мл Эрленмейера, инкубировали в течение 15 дней при 30±1°С в условиях встряхивания (120°С). об/мин). После инкубации культуры фильтровали и в фильтрат добавляли 0,2% бикарбоната натрия для осаждения жирных кислот. Таксол экстрагировали дихлорметаном, органическую фазу собирали и упаривали досуха, а остаток повторно растворяли в метаноле [17, 39]. Таксол отделяли и идентифицировали с помощью ТСХ с использованием предварительно покрытых пластин силикагеля Merck 1 мм (20×20 см) (ТСХ Силикагель 60 F254, Дармштадт, Германия), обнаруживая УФ-освещением при 254 нм [39]. Предполагаемые пятна таксола соскребали с пластин силикагеля для ТСХ и растворяли в метаноле, интенсивно встряхивали в течение 10 мин и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осажденные частицы кремнезема удаляли, а надосадочную жидкость отбирали для количественного определения таксола и проверки его чистоты методом ВЭЖХ (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quaterary Pump, Корея) на колонке с обращенной фазой С18 (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 мм, 3,5 мкм, № по каталогу 959,963–902). В качестве подвижной фазы использовали смесь метанол/ацетонитрил/вода (25:35:40, об./об./об.) при скорости потока 1,0 мл/мин в течение 20 мин [40], фракции таксола измеряли при 227 нм, а их химическая идентичность и концентрации были подтверждены по времени удерживания и площади пика поглощения по сравнению с аутентичным образцом.

Морфологическая и молекулярная идентификация выделенных эндофитных грибов.

Изоляты эндофитных грибов идентифицировали до их видового уровня на основании их макро- и микроморфологических признаков путем выращивания на средах PDA, Czapek's-Dox и солодового экстракта в соответствии с эталонными ключами [33–36]. Идентичность наиболее мощных изолятов грибов, продуцирующих таксол, была дополнительно подтверждена на молекулярном уровне на основе последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) [41, 42]. Геномную ДНК грибов (гДНК) экстрагировали путем измельчения мицелия (~0,2 г) в жидком азоте с последующим распределением в 1 мл буфера для экстракции CTAB (2% CTAB, 2% PVP40, { {21}}.2% 2-меркаптоэтанол, 20 мМ ЭДТА, 1,4 М NaCl в 100 мМ Трис-HCl, pH 8,0). Наборы праймеров для ПЦР представляли собой ITS4 5'-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3' и ITS5 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'. ПЦР-реакция содержит 10 мкл 2×мастер-смеси для ПЦР (i-Taq™, № по каталогу 25027), 2 мкл гДНК, 1 мкл каждого праймера (10 пмоль/мкл) и доведена до 20 мкл стерильной дистиллированной вода. ПЦР была запрограммирована на начальную денатурацию при 94 градусах в течение 2 минут, денатурацию при 94 градусах в течение 30 секунд, отжиг при 55 градусах в течение 10 секунд, удлинение при 72 градусах в течение 30 секунд в течение 35 циклов и окончательное удлинение при 72 градусах в течение 2 циклов. мин. Ампликоны ПЦР анализировали в 1,5% агарозном геле в буфере 1×TBE (Ambion, номер по каталогу AM9864), используя цепочку ДНК длиной 1 т.п.н. (кат. № PG010-55DI), и визуализировали с помощью системы документирования геля. Ампликоны очищали и секвенировали с помощью Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Version 6.0 с теми же наборами праймеров. Полученные последовательности были подвергнуты неизбыточному поиску BLAST в базе данных NCBI, импортированы в программное обеспечение MEGA 6.0 и выровнены с алгоритмом мышц Clustal W [43], а филогенетическое дерево было построено с помощью метода соседнего соединения MEGA 6.0 [44].

Химическая структура экстрагированного таксола

Предполагаемые пятна таксола соскабливали с пластин силикагеля для ТСХ и очищали, а чистоту и концентрацию определяли с помощью УФ-видимого анализа при λ 227 нм (RIGOL, серия Ultra-3000) по сравнению с аутентичным таксолом. [39]. Пустые среды в тех же условиях использовали в качестве отрицательной базовой линии для спектрофотометрического анализа. ИК-Фурье-спектр очищенных образцов таксола анализировали на спектрофотометре JASCO FT-IR 3600. Образец таксола растирали с таблетками KBr, прессовали в диски под вакуумом и измеряли поглощение в диапазоне от 400 до 4000 см–1 [3] по сравнению с аутентичным. Химическая структура экстрагированного таксола была подтверждена HNMR-спектроскопией (JEOL, ECA-500II, 500 МГц ЯМР) по сравнению с аутентичным таксолом. Образцы растворяли в CDCl3, химические сдвиги даны в м.д. (δ-шкала), константы связи выражены в герцах (Гц).

Влияние различных типов сред на продукцию таксола

Две агаровые пробки (9 мм) из 7-дневных культур каждого грибкового изолята инокулировали в трех повторностях в 100 мл среды/250 мл колбу Эрленмейера с картофельной декстрозой (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D и солодовым экстрактом (ME). ) бульонная среда. Незасеянные контроли из каждой среды, свободные от грибковых спор, использовали в качестве отрицательного контроля, инкубировали при 30°С в течение 15 дней в тех же условиях. После инкубации культуры грибов фильтровали, таксол экстрагировали и определяли, как указано выше.

Биотехнологическая оптимизация условий питания для максимального выхода таксола

Оптимизацию состава среды для максимизации выхода таксола с помощью сильнодействующего грибкового изолята проводили с помощью методологии поверхности отклика с использованием дизайна Плакета-Бермана с последующим центральным композитным дизайном [17–20, 45]. Из дизайнов RSM положительные и значимые переменные, влияющие на продукцию таксола сильнодействующим грибковым изолятом, оценивали с использованием пакета статистического программного обеспечения Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Миннеаполис, США). Каждый эксперимент проводили в трех биологических повторах, учитывали средние значения. После инкубации при желаемых условиях грибковую биомассу фильтровали, экстрагировали таксол и количественно определяли с помощью ТСХ и ВЭЖХ, как описано выше.

Плакет-Берман Дизайн

Схема Плакета-Бермана часто использовалась для оптимизации компонента среды для роста грибов и продукции биоактивных вторичных метаболитов, оценивая важные переменные, влияющие на продукцию таксола [18, 20, 46]. Выбор фактора был основан на средах, используемых в качественном и количественном скрининге. Были включены одиннадцать факторов; экстракт солода, пептон, сахароза, соевый тон, глутамин, экстракт говядины, а также значения и факторы температуры, pH, времени инкубации и скорости встряхивания, которые варьировались на двух уровнях, и были выбраны диапазоны минимального и максимального уровней. Для создания набора из 12 экспериментов использовали статистическую программу Design-Expert 7.0. Для каждого эксперимента определяли продукцию таксола в трех биологических повторностях и учитывали среднее значение выхода таксола.

Регрессионный анализ данных был проведен с использованием статистического программного обеспечения. Эффект каждой переменной был рассчитан (Биометрика, 2020) с использованием следующего уравнения:

где Е — влияние тестовой переменной, М плюс и М- — концентрация таксола в опытах, при которых параметр находился на более высоком и более низком уровнях соответственно, а N — количество проведенных опытов. Влияние каждой переменной на производство определялось путем расчета их соответствующих E-значений.

Где Tot high — это общее количество ответов на высоком уровне, Tot low — это общее количество ответов на низком уровне, а No — количество попыток.

Центральный композитный дизайн и взаимодействие между факторами, влияющими на производство таксола

Наиболее значимые положительные факторы, влияющие на продукцию таксола выбранным грибковым изолятом, были оптимизированы с использованием экспериментального плана модели CCD типа поверхности отклика [47]. С помощью CCD были оптимизированы концентрации компонентов среды, и их изученные взаимодействия были использованы для создания в общей сложности 20 экспериментов для трех переменных. Чтобы определить оптимальные уровни переменных для продукции таксола из сильнодействующего грибкового изолята, были построены трехмерные (3D) кривые поверхности отклика для изучения взаимодействия между различными факторами и для определения изменчивого состояния каждого фактора, влияющего на продукцию таксола. Трехмерные графики были построены путем удерживания констант трех факторов на идеальном уровне и построения графика полученной реакции выхода таксола на различные уровни двух других факторов.

Влияние гамма-облучения на выход таксола

Мощные эндофитные изоляты, продуцирующие таксол, подвергались -облучению источником 60кобальта (гамма-клеткой 4000-A-Индия) при различных дозах гамма-излучения (0,25–3,0 кГр) по сравнению с к контролю необлученной культуры; мощность дозы 1,2 кГр/ч на момент экспериментов. Оптимизированные среды инокулировали облученной культурой в стандартных условиях культивирования по сравнению с инокулятом необлученных спор в качестве контроля. Культуры инкубировали при 30±2 градуса в течение 15 дней на ротационном шейкере (120 об/мин). После инкубации культуры фильтровали и таксол экстрагировали, очищали и количественно определяли с помощью ТСХ и ВЭЖХ, как описано выше.

Синтез и характеристика наночастиц золота (AuNP); Конъюгация с таксолом

Противораковая активность таксола

Активность очищенного таксола и конъюгатов таксол-PVP-AuNP в отношении карциномы печени (HPG2) и карциномы молочной железы (MCF7) определяли с помощью 3- (4,5-диметилтиазол- 2-ил) Анализ -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) [48]. В 96-луночный планшет засевали 103 клетки на лунку и инкубировали в течение ночи при 37°С, затем добавляли различные концентрации препарата и повторно инкубировали планшеты в течение 48 часов. Добавляли реагент МТТ (25 мкл), инкубировали в течение 2 ч и измеряли пурпурную окраску проявленного комплекса формазана при λ 570 нм. Величину IC50 выражали количеством лекарственного средства, уменьшающим рост 50% исходного количества опухолевых клеток, нормализующим до положительного контроля.

Антимикробная активность таксола и конъюгатов таксол-AuNPs

Антимикробную активность таксола и конъюгатов таксол-AuNP оценивали в отношении различных бактериальных изолятов; Bacillus subtilis ATCC 6633 и Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Enterobacter agglomerans, в дополнение к Candida albicans. Исследуемые бактериальные клетки суспендировали в стерильной пептонной воде с получением стандартного инокулята ~0,5 McFarland (1–1,5)× 1{{10}}8 КОЕ/мл при λ6{{18 }}0 нм. Ингибирование роста (мм) микробных патогенов оценивали методом диффузии в дисках с агаром. В качестве положительных контролей использовали стерильные стандартные диски с антибиотиками диаметром 6,0 мм. Стерильные диски с антибиотиками (6,0 мм) загружали 20 мкл метанола и амоксициллин-клавулановой кислоты (АМС) в качестве отрицательного и положительного контроля. На диски наносили одинаковую концентрацию таксола, таксол-ПВП-AuNP и AuNP (1,0 мкг/мл). Были приготовлены три биологические повторности. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 ч и измеряли зоны ингибирования. Для нормализации антимикробной активности таксола применяли амоксициллин клавулановую кислоту (АМК) и нистатин. Зону задержки роста определяли штангенциркулем (мм).

Статистический анализ

Морфологическая и молекулярная идентификация потенциальных продуцентов таксола

Морфологические особенности сильнодействующего грибкового изолята, продуцирующего таксол, исследовали по макроскопическим и микроскопическим описательным ключам, как описано в разделе «Материалы и методы», и выявили его морфологическую близость с A. favus (рис. 2). Изолят гриба выращивали на PDA при 30 градусах в течение 10 дней, и макроскопические и микроскопические признаки показали его идентичность, такую ​​как конидиальные головки, способ ветвления, идентичность рыльца и конидиальную онтологию, а также формирование плодовых тел в соответствии с универсальным морфологические ключи [33] и оказались идентичными Aspergillus favus. Изолят A. favus, способный продуцировать таксол, далее идентифицировали на основе их последовательностей ITS с использованием гДНК в качестве матрицы. Ампликоны ПЦР (~550 п.н.) A. favus были разрешены, очищены и секвенированы (рис. 2). Последовательность ITS A. favus была подвергнута неизбыточному поиску по базе данных NCBI, показавшему 99-процентное сходство с A. favus, с нулевыми значениями E. и 95-процентным охватом запросов. Таким образом, на основании микроскопического и молекулярного анализов целевой изолят был подтвержден как A. favus и депонирован в банке GenBank под инвентарным номером MW485934.1, а также изолят был депонирован в Микологическом центре Университета Асьюта (AUMC), Египет, с регистрационным номером MW485934.1. номер депонирования AUMC13892. Текущий изолят имел 99-процентное сходство с изолятами A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Рис. 1 Морфологический вид растения жожоба. B Чашечные культуры сильнодействующих эндофитных грибов, продуцирующих таксол; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) и A. oryzae Bd (25) на КПК после 8 дней инкубации при 30°С. Изоляты грибов выращивали на PDB и инкубировали в стандартных условиях, экстрагировали таксол и проверяли с помощью ТСХ (С). D ВЭЖХ-хроматограмма таксола из сильнодействующих изолятов грибов. E Выход таксола, определенный количественно с помощью ВЭЖХ. F — УФ-видимый спектральный анализ таксола, выделенного из изолятов грибов. G ИК-Фурье-анализ экстрагированного таксола по сравнению с аутентичным

Рис. 2 А. Макроморфологические особенности эндофита жожоба A. favus после 3, 5 и 8 сут роста на КПК. Микроморфологические особенности, конидиальная головка A. favus при увеличении в 400 раз. C ПЦР-ампликон ITS-области A. favus размером 500 п.н., нормализованный до лестницы 1 т.п.н. (кат. № SM0312). D Филогенетический анализ ИТС A. favus методом максимального правдоподобия [44]