Кратковременная ингаляция севофлурана может уменьшить образование глиальных рубцов после гипоксически-ишемического повреждения головного мозга у новорожденных крыс. Часть 1

Абстрактный

Предыдущие исследования показали, что посткондиционирование севофлураном может обеспечить нейропротекцию после гипоксически-ишемического повреждения и улучшить функции обучения и памяти у развивающегося мозга грызунов.

Под гипоксически-ишемическим повреждением понимают патологическое состояние, обусловленное ишемией головного мозга, гипоксией, нарушением обмена веществ и повреждением нервных клеток вследствие нарушений сердечно-сосудистой и цереброваскулярной систем. С социальным прогрессом и изменением образа жизни гипоксически-ишемические повреждения становятся все более распространенными. Это состояние может нанести много вреда здоровью человека, в том числе повлиять на его интеллект и память.

Хотя гипоксия и ишемия могут вызвать снижение функции мозга, это не означает, что это повлияет отрицательно на память. Напротив, мы можем улучшить память и повысить эффективность мозга с помощью правильных методов. Вот несколько способов улучшить память:

1. Здоровое питание. Влияние диеты на память очень важно. Продукты, богатые белком, витаминами и минералами, помогают поддерживать здоровье нервной системы и функции мышления.

2. Больше занимайтесь спортом. Физические упражнения улучшают кровообращение, увеличивают приток кислорода, повышают иммунитет организма и снижают риск заболеваний. С помощью упражнений вы можете улучшить свою память.

3. Укрепить уверенность в себе. Уверенность является важным фактором памяти человека. Если вы верите, что сможете выполнить определенную задачу, вы легко добьетесь желаемых результатов, а также сможете эффективно улучшить свою память.

Видно, что гипоксически-ишемическое повреждение не является состоянием, которое неизбежно повредит память человека. Если мы освоим правильные методы и хорошо позаботимся о своем мозге, мы сможем построить здоровое будущее с позитивным настроем. Видно, что нам необходимо улучшить память, а цистанхе пустынный может значительно улучшить память, потому что цистанхе пустынный — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность Cistanche Deserticola обусловлена ​​множеством содержащихся в нем активных ингредиентов, включая дубильную кислоту, полисахариды, флавоноидные гликозиды и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными путями.

Нажмите «Узнай 10 способов улучшить память»

Классическую модель Райса-Ваннуччи использовали для индукции гипоксически-ишемического повреждения, а новорожденных (7-й день после рождения) крыс обрабатывали 2,4% раствором севофлюрана в течение 30 минут после гипоксически-ишемического повреждения.

Наши результаты показали, что посткондиционирование севофлураном значительно улучшило функции обучения и памяти крыс, уменьшило образование астроглиоза и глиальных рубцов, увеличило количество дендритных шипиков и защитило гистоморфологию гиппокампа. Механистически посткондиционирование севофлураном уменьшало экспрессию фактора фон Хиппеля-Линдау, индуцируемого гипоксией-1, и увеличивало экспрессию DJ-1.

Инъекция 1,52 мкг ингибитора индуцируемого гипоксией фактора -1 YC-1 (Лифицигуат) в левый боковой желудочек за 30 минут до гипоксически-ишемического повреждения обратила вспять нейропротекцию, вызванную севофлураном. Это открытие предполагает, что севофлуран может эффективно облегчить астроглиоз в гиппокампе и уменьшить нарушения обучения и памяти, вызванные образованием глиальных рубцов после гипоксически-ишемического повреждения.

Основной механизм может быть связан с усилением экспрессии DJ-1, снижением убиквитинирования фактора, индуцируемого гипоксией-1, и стабилизацией экспрессии фактора, индуцируемого гипоксией-1. Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за лабораторными животными Китайского медицинского университета, Китай (одобрение № 2016PS337K) 9 ноября 2016 г.

Ключевые слова: черепно-мозговая травма; мозг; Центральная нервная система; в естественных условиях; рана; модель; пластичность; крыса; восстановление; регенерация; ремонтКитайская библиотечная классификация № R453; Р741; Р614.2+1.

Введение

Неонатальная гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) — частое осложнение в неонатальном периоде, обусловленное многими факторами, такими как неонатальная асфиксия, внутриутробный дистресс и заболевание гиалиновых мембран (Douglas-Escobar and Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

ГИЭ является основной причиной детской смертности и основным источником неврологических осложнений (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). Девяносто процентов выживших с ГИЭ имеют долгосрочные неврологические дисфункции, такие как нарушения обучения, когнитивные и двигательные дисфункции, а также эпилепсия (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Текущее лечение ГИЭ в основном сосредоточено на симптоматическом лечении, включая механическую вентиляцию легких, коррекцию гипотонии, добавление глюкозы и ограничение потребления жидкости, если это необходимо.

Однако требуется эффективное лечение, способное обратить вспять или уменьшить долгосрочное повреждение головного мозга (Stankowski and Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). В качестве ключевой части обучения и распознавания гиппокамп, включая зубчатую извилину (DG), является ключевым элементом обучения и распознавания. Области СА1, СА3 и СА3 участвуют в преобразовании и интеграции периферической информации в нервные центры (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Гиппокамп гиперчувствителен к гипоксически-ишемическому (ГИ) повреждению, которое может провоцировать апоптоз нейронов гиппокампа, стимулировать чрезмерный реактивный глиоз и приводить к образованию глиального рубца (Hopkins and Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Пролиферация астроцитов имеет решающее значение для закрытия места инфаркта, ремоделирования структуры гиппокампа и временного контроля местных иммунных реакций во время острой фазы (Rolls et al., 2009).

Однако гипертрофия и образование глиальных рубцов способствуют аберрантному нейрогенезу, препятствуют росту дендритных отростков и затрудняют форму синапсов, еще больше ухудшая функции обучения и распознавания (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda and Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Ши и др., 2017).

Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и хондроитинсульфат-протеогликаны, такие как нейрокан, являются патологическими маркерами астроглиоза и глиального рубцевания, экспрессия которых может регулироваться высокоактивированными астроцитами (Pekny and Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Таким образом, подавление астроглиоза и рубцевания глии может быть терапевтической целью при ГИЭ и его долгосрочных неврологических последствиях.

Было продемонстрировано, что применение севофлурана смягчает повреждение HI у грызунов. Исследования, изучающие значимость посткондиционирования севофлураном (SPC) для облегчения повреждения HI путем активации фактора, индуцируемого гипоксией-1 (HIF-1) у взрослых грызунов и новорожденных крыс, выявили несколько потенциальных механизмов (Wang et al., 2019b; Yanget др., 2019; Ду и др., 2020;

В качестве ключевого физиологического сенсора гипоксии HIF-1 представляет собой транскрипционный фактор с сотнями нижестоящих молекул, участвующих в механизмах ишемической толерантности, таких как фактор роста эндотелия сосудов и эритропоэтин (Na et al., 2015). Было подтверждено, что гипоксическое посткондиционирование снижает активацию астроцитов и микроглии после HI в мозге неонатальных крыс (Teo et al.,2015).

Поэтому мы предположили, что HIF-1 может способствовать ослаблению образования глиальных рубцов и астроглиоза. HIF-1 может конститутивно существовать в нейронах, благодаря чему его экспрессия быстро увеличивается и накапливается в условиях гипоксии. Однако, когда уровень кислорода возвращается к норме, экспрессия HIF1 не может поддерживаться на достаточно высоком уровне, чтобы постоянно оказывать нейропротекторное действие, из-за зависимой от кислорода деградации белками пролилгидроксилазы и последующего убиквитилирования белками фон Хиппеля-Линдау (VHL) (Berra et al., 2003; Чжан и др., 2018).

Сообщается, что DJ-1 (кодируемый Park7) является нейропротекторным белком, особенно в окислительных условиях (Aleyasin et al., 2007, 2010). Белок VHL физически взаимодействует с DJ-1, что было определено с помощью объективного масс-спектрометрического скрининга и подтверждено на модели болезни Паркинсона (БП). Кроме того, Parsanejad et al. (2014) показали, что DJ-1 ингибирует VHL-зависимое убиквитилирование и стабилизирует экспрессию HIF-1.

Таким образом, мы предположили, что севофлюран стабилизирует белок HIF-1 в гиппокампе путем усиления DJ-1, чтобы ингибировать убиквитилирование HIF-1, тем самым улучшая долговременное обучение и функцию памяти.

Чтобы исследовать роль HIF-1 во взаимосвязи между севофлураном и астроглиозом, мы использовали YC-1 (Lificiguat), селективный антагонист HIF-1, чтобы полностью ингибировать экспрессию HIF-1 в посттранскрипционный уровень. В этом исследовании мы исследовали роль HIF-1a в нейропротекции новорожденных крыс HIE, получавших SPC.

Материалы и методы

Животные
Исследования на животных проводились на синаптической стадии развития крыс, которая начинается на 7-й день постнатального развития (P7), что соответствует периоду роста человеческих младенцев от поздних сроков беременности до 3 лет после рождения (Jevtovic-Todorovic et al.,2003). Семидневных крыс Спраг-Доули массой 12–16 г отбирали из 20 беременных крыс (приобретенных в лаборатории больницы Шэнцзин Китайского медицинского университета, Китай; соотношение самцов и самок 1:1).

Все крысы имели свободный доступ к воде и пище, и в лаборатории их поддерживали при стандартной влажности и температуре с 12-часовым циклом света/темноты (8 утра/8 вечера). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения (Бетезда, Мэриленд, США) по уходу и использованию лабораторных животных.

Комитет по уходу за лабораторными животными Китайского медицинского университета официально одобрил описанные эксперименты (Шэньян, Китай; разрешение № 2016PS337K) 9 ноября 2016 г.

Из 25 беременных крыс были выбраны 249 крыс P7, которые случайным образом были разделены на группы на основе таблицы случайных чисел (Wang etal., 2019a). В наш окончательный анализ была включена в общей сложности 201 новорожденная крыса; уровень смертности после лечения HI составил 19%.

Эти 201 новорожденные крысы были случайным образом разделены на четыре группы: имитация (n=54), HI (n=54), HI + севофлюран (HIS) (n=54) и HIS + YC{{ 6}} (n=39) групп. В каждой группе 24 крысы использовали для вестерн-блоттинга, 5 - для иммуногистохимии и окрашивания по Гольджи, а 10 - для поведенческого тестирования. Оставшиеся 45 крыс в группах имитации, HI и HIS использовали для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT- ПЦР).

Экспериментальный дизайн и воздействие анестетика

Используемая модель HIE была описана ранее (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). По расстоянию между анусом и репродуктивными органами была завершена идентификация пола постнатальных крыс. Для создания модели HIE голову каждой крысы P7 помещали в прозрачную пластиковую трубку, которая закрывалась ватой перед выпуском севофлурана (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Левую общую сонную артерию каждой крысы постоянно перевязывали, а между двумя перевязками артерию перерезали; каждая операция была завершена в течение 5 минут. Впоследствии крысы просыпались без воздействия анестезии и помещались обратно в клетки своих матерей на 2 часа. Для введения SPC крыс помещали в прозрачную камеру (Lingzhi Company, Ханчжоу, Китай), соединенную с испарителем асевофлурана; один канал обеспечивал вентиляцию, а другой транспортировал пробу газа из камеры к монитору.

Камеру вентилировали 30% O2 и 70% N2 в течение 2 часов в группе имитации, а в группе HI в течение 2 часов вводили 8% O2 и 92% N2. SPC устанавливали сразу после HI: 2,4% севофлурана (1 минимальная альвеолярная концентрация) вдыхали крысы в ​​камере с атмосферой 30% O2 и 70% N2 и скоростью воздушного потока 2 л/мин в течение 30 минут. Бассейн с подогревом стабилизировал температуру внутри камеры на уровне 37 градусов.

Прием лекарств

Ровно за 30 минуты до HI в левый боковой желудочек было введено 1,52 мкг ингибитора HIF-1 (YC1; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) (Paxinos and Franklin, 2013) с использованием шприц 5-μLHamilton (Yingweida Technology, Пекин, Китай). Как описано ранее, YC-1 растворяли в искусственной спинномозговой жидкости в концентрации 0,304 мкг/мкл (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Вестерн-блот-анализ

Крыс P7 анестезировали 2% севофлураном и ткани гиппокампа извлекали из крысят через 12, 24, 48 часов и 28 дней после операции. После экстракции ткани немедленно помещали на лед.

Тотальные белки супернатанта выделяли путем добавления агента для радиоиммунопреципитации (Beyotime, Хаймен, Китай). Концентрации белка определяли с помощью набора One BCA Kit (Beyotime).

Далее препараты разделяли на 12,5%-ном додецилсульфатно-полиакриламидном геле натрия и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования 5% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) при 4 степени мембрану инкубировали с соответствующими первичными антителами, включая антиглицеральдегид3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology). , Дэнверс, Массачусетс, США), анти-DJ-1 (1:1000; Cat# ab18257; Abcam, Кембридж, Великобритания), анти-VHL (1:5000; поликлональный; Cat# ab77262; Abcam), анти-VHL (1:5000; поликлональный; Cat# ab77262; Abcam), анти-VHL -HIF-1 (1:900; поликлональный; Cat# ab2185; Abcam), анти-нейрокан (1:200; моноклональный; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США) , белок антипостсинаптической плотности 95 (PSD95; 1:1000; моноклональный; Кат. № 3409S; Cell Signaling Technology), антирост-ассоциированный белок 43 (GAP43; 1:2000; поликлональный; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Чикаго, Иллинойс, США) и анти-GFAP (1:5000, поликлональный, Cat# ab53554;Abcam).

После этого блоты инкубировали с антикроличьим IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Чжуншаньцзиньцяо, Пекин, Китай) или антимышиным IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Чжуншаньцзиньцяо). в течение 2 часов при комнатной температуре.

Белковые блоты визуализировали с помощью усиленных реагентов для обнаружения хемилюминесценции (SuperSignal West Pico; Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США). Белковые полосы определяли количественно с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения). Для анализа вестерн-блоттинга данные нормализовали по GAPDH.

Иммуногистохимия

Через двадцать восемь дней после операции крысам вводили анестетик по описанному выше методу, перфузировали 4% формалином и извлекали мозг для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Мозг погружали в 4% параформальдегид при температуре 4 градуса на 48 часов, затем обезвоживали в ступенчатом этаноле и, наконец, заливали в парафин. Затем залитые в парафин ткани разрезали на срезы толщиной 2,5- мкм с помощью вибратома и полученные срезы хранили при комнатной температуре.

Каждый мозг делал срезы непрерывно, и три прерывистых среза мозга отбирали для окрашивания NeuN (маркер нейронов), GFAP (маркер астроцитов) и нейрокана (маркер глиальных рубцов). Для двойного мечения срезы тканей инкубировали с двумя смешанными первичными антителами, включая козлиные анти- GFAP (1:250; поликлональный; Cat# ab53554; Abcam), кроличьи антигены (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) и/или мышиный анти-нейрокан (1:200; моноклональный; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) при температуре 4 градуса в течение ночи во влажной камере.

Затем срезы промывали 0.1-фосфатно-солевым буферным раствором и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами, включая антикроличий IgG, конъюгированный с Alexa Fluor-594 (1:200;Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), антимышиные IgG, конъюгированные с Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies), и антикозьи IgG, конъюгированные с изотиоцианатом флуоресцеина (1:200; Life Technologies).

Контрастное окрашивание ядер клеток осуществляли 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (Beyotime) в течение 5 минут.

Для наблюдения окрашенных срезов использовали микроскоп Olympus BX51 (Olympus Corporation, Токио, Япония). Для фотографирования из каждого среза случайным образом были выбраны три поля зрения левого гиппокампа. Программное обеспечение ImageJ использовалось для оценки количественной колокализации и, следовательно, расчета коэффициента перекрытия Мандерса.

For more information:1950477648nn@gmail.com