Может ли экстракт Cistanche Deserticola стимулировать иммунный ответ?

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Шуаншуан Фэн а, 1, Сюмей Ян а, Сян Вэн а, 1, Бинь Ван б, Айлиан Чжан а, *

Синьцзянская ключевая лаборатория биологических ресурсов и генной инженерии, Колледж биологических наук и технологий, Синьцзянский университет, Урумчи, 830046, Синьцзян, Китай

b Ключевая лаборатория медицинской молекулярной вирусологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Шанхайский медицинский колледж, Фуданьский университет, Шанхай, 200032, Китай

Этнофармакологическая значимость:Растительные полисахариды продемонстрировали большой иммуностимулирующий потенциал. Адъюванты являются ключевым инструментом для разработки эффективных вакцин. В нашем предыдущем исследовании водорастворимый полисахарид, извлеченный из дикихЦистанхепустыняYC Ma показал мощную иммуностимулирующую активность.

Цель исследования:В этом исследовании иммунные профили и эффективность водных экстрактов культурныхЦистанхепустыняИсследовали YC Ma (AECCD) на мышах ICR против овальбумина (OVA). В экспериментах in vitro оценивали возможный механизм активации ДК с помощью AECCD.

Материалы и методы:AECCD экстрагировали горячей водой, после чего неочищенные полисахариды осаждали этанолом. Мышей сначала иммунизировали подкожно только OVA (10 мкг на мышь) или OVA (10 мкг на мышь), соответственно содержащих разные дозы AECCD (200, 400 и 800 мкг на мышь) в дни 1 и 14, а также величину и кинетику иммунизации. Затем оценивали антитела и клеточно-опосредованные ответы.

Полученные результаты:AECCD вызывал сильные и длительные ответы IgG со смешанными ответами Th1/Th2 и повышением уровней Th-ассоциированных цитокинов (CD4 плюс IL -4, CD4 плюс IFN- и CD8 плюс IFN-). Более того, AECCD индуцировал сильный клеточныйиммунныйоткликхарактеризуется повышенной пролиферацией спленоцитов, а также активированным Т-клеточным ответом. Примечательно, что AECCD значительно усиливал созревание дендритных клеток (DC) и ингибировал Treg. Эксперименты in vitro. Предварительные тесты показали, что AECCD индуцирует активацию DC, способствуя фенотипическому созреванию, разделу цитокинов и аллостимулирующей активности. Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) был важным рецептором DC для прямого связывания AECCD. Ингибиторы NF-κB снижали уровни экспрессии CD40, CD80, CD86 и MHC-II и продукцию IFN-, TNF- и IL-6 через DCS.

Выводы:Наконец, эти результаты свидетельствуют о том, что AECCD может вызывать мощные и стойкие антиген-специфическиеиммунныйответычерез активацию DC, которая участвует в регуляции маркеров созревания и экспрессии цитокинов через TLR4-связанный путь NF-κB. Исследование показывает, что AECCD является потенциальным иммуномодулятором.

Ключевые слова:Полисахаридный адъювантЦистанхепустыня, Иммуномодулятор, Дендритные клетки Toll-подобный рецептор 4, сигнальный путь NF-κB

Цистанхе пустыняэкстракт продвигатьиммунныйотклик

1. Введение

Многие исследования показали, что адъюванты могут повышать эффективность вакцин против различных инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ, COVID-19, грипп и ящур (Cao et al., 2020; Giuseppe et al., 2018). ). Адъюванты могут индуцировать различные типы и величиныиммунныйответы, поэтому правильно подобранный адъювант может индуцироватьиммунныйоткликтребуется для данного патогена или антигена (Reed et al., 2013). Экстракты натуральных трав уже давно широко используются в повседневной жизни и здравоохранении. Во многих случаях традиционная китайская медицина (ТКМ) и ее активные компоненты, особенно множественные адъюванты, полученные из полисахаридов ТКМ, значительно повысили эффективность вакцин. Полисахариды ТКМ (Advax™, полисахарид астрагала, полисахарид женьшеня, полисахарид Lycium barbarum и полисахарид Ganoderma lucidum) имели ряд преимуществ по сравнению с другими адъювантами, такие как лучшая безопасность, биосовместимость, сильное усиление иммунитета и низкая реактогенность (Li and Wang, 2015; Schijns). и др., 2020). Таким образом, соединения и составы на основе полисахаридов ТКМ потенциально могут использоваться в качестве кандидатов в качестве адъювантов.

Цистанхе пустыняYC Ma (Роуконгронг по-китайски) — это традиционная китайская медицина, зарегистрированная в Китайской фармакопее, которая сотни лет использовалась в Китае в качестве тонизирующего продукта (Китайская фармакопея, 1992). Современные фармакологические исследования показали его многочисленные фармакологические и иммуномодулирующие применения (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). В нашем предыдущем исследовании сырые полисахариды, полученные из дикихЦистанхепустыняYC Ma способствует антигенспецифическим гуморальным и клеточным ответам и регулирует созревание дендритных клеток (ДК) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). Однако дикийЦистанхепустыняYC Ma был тщательно изучен и занесен в список исчезающих видов.ЦистанхепустыняYC Ma был посажен в больших масштабах и широко используется в разработке и применении ресурсов традиционной китайской медицины. Однако адъювантный потенциал культивируемыхЦистанхепустыняYC Ma до сих пор неясно.

DCS являются важными регуляторами инфекционных заболеваний. После активации ДК поверхностные молекулы и провоспалительные цитокины на ДК взаимодействуют с соответствующими рецепторами, активируя Т-клетки и вызывая антиген-специфические ответы и выработку цитокинов, направляющих адаптивные реакции.иммунныйответы(Баншеро и Штейнман, 1998). Сообщалось, что толл-подобный рецептор 4 (TLR4) на ДК функционирует как важный полисахаридный рецептор (Park et al., 2014; Qi et al., 2016). Действительно, многие полисахариды могут прямо или косвенно взаимодействовать с TLR4 на ДК, чтобы активировать нижестоящий ядерный фактор каппа-В (NF-κB), который может индуцировать экспрессию различных провоспалительных генов, таких как IFN-, TNF- и IL{{11}. }} и воспалительная реакция для устранения патогенов (Tian et al., 2019; Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2013). Таким образом, DCS и NF-κB широко изучались в качестве потенциальных мишеней для терапии заболеваний.

В исследовании со стратегией in vivo (мыши ICR) мы сначала оценили иммуностимулирующие эффекты водных экстрактов культивируемыхЦистанхепустыняYC Ma (AECCD) с различными дозами (низкими, средними и высокими), чтобы вызватьиммунныйоткликпротив OVA и объяснить in vitro способ активации DCs и нижестоящих путей, связанных с рецепторами. На мышиной модели мы обнаружили, что AECCD способствует долговременному ответу антител с увеличением титров IgG и клеточныхиммунныйотклик. Важно отметить, что AECCD индуцировал Th-ассоциированные цитокины, особенно продукцию IFN-, что приводило к Th1-ответу на инфекции. Индукционный эффект тесно коррелировал с усилением созревания DC и снижением Tregs. Механически AECCD способствовал активации DC через TLR 4-связанный путь NF-κB. Таким образом, исследование подтвердило мощную адъювантную активность AECCD в стимулировании адаптивного ответа. Исследование заложило основу для разработки полисахаридных адъювантов AECCD.

2. Материалы и методы

2.1. Реагенты

Овальбумин (OVA), 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолия бромид (MTT), полимиксин B (PMB), конканавалин А (КонА), липополисахарид (ЛПС), митомицин С и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) были получены от Sigma (США). Фетальную бычью сыворотку (FBS) приобретали у Biological Industries. Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был приобретен у Biosharp (Китай). Конъюгаты козьего антимышиного IgG/IgG1/IgG2a-HRP были получены от Southern Biotech (США). Квасцы для инъекций были произведены компанией Thermo Scientific Pierce (США). GM-CSF был от Peprotech (США). Флуоресцентно-меченые антитела (анти-CD3-PE, анти-CD4-APC, анти-CD8a-FITC, анти-CD44-PE, анти-CD62L-PE, анти-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, анти-IL-4-PE, анти-IFN- -PE, анти-CD86-APC, анти-CD40-FITC/PE, анти- CD11c-PE/FITC, анти-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm и Perm/Wash буфер были получены от BD Bioscience (США). Набор для окрашивания регуляторных Т-клеток был получен от eBiosciences (США). TAK-242 был получен от MedchemExpress (Шанхай, Китай). PDTC был от Beyotime Biotechnology (Китай). Набор для проточного анализа с несколькими аналитами производства Biolegend (США).

2.2. Приготовление AECCD C. Deserticola

(Образец ваучера № CD10041602) был идентифицирован профессором Цзян Хэ. AECCD получали водной экстракцией, осаждением этанолом и методом депротеинизации с некоторыми незначительными модификациями (Zhang et al., 2018). Короче говоря, культивируетсяЦистанхепустынясначала многократно экстрагировали водой, а затем неочищенные полисахариды осаждали в течение ночи добавлением этанола в объемном соотношении 1:4. Затем полученные неочищенные полисахариды депротеинизировали по методу Севага (Liu et al., 2012). Антрон-сернокислотным методом установлено общее содержание сахара 76,82% (Дюбуа и др., 1951).

2.3. Инфракрасный спектроскопический анализ

Для анализа органических функциональных групп AECCD с KBr прессовали в таблетки для измерения инфракрасных (ИК) спектров. ИК спектры образцов определяли в диапазоне 4000–400 см–1.

Цистанхетравапродвигатьиммунныйотклик

2.4. Эксперименты в естественных условиях

2.4.1. Иммунизация животных

Самок мышей C57BL/6 и мышей ICR (6-недельного возраста) из Синьцзянского медицинского университета (Урумчи, Китай) акклиматизировали в течение 3 дней. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с правилами Комитета по этике экспериментов на животных Синьцзянской ключевой лаборатории биологических ресурсов и генной инженерии Синьцзянского университета (BRGE-AE001).

Мышей подкожно иммунизировали только OVA или OVA с различными концентрациями AECCD и бустировали на 14-й день в соответствии с различными группами следующим образом (по 6 мышей в каждой группе): контрольная группа (0,9% NaCl), группа OVA ( 10 мкг OVA), группа AECCD-H (800 мкг AECCD), группа OVA/AECCD-L (10 мкг OVA, 200 мкг AECCD), группа OVA/AECCD-M (10 мкг OVA, 400 мкг AECCD) ), группа OVA/AECCD-H (10 мкг OVA, AECCD 800 мкг) и группа OVA/квасцы (10 мкг OVA, квасцы 100 мкг). Композиции вакцины в 100 мкл 0,9% NaCl инъецировали в два разных места (по 50 мкл в каждое место) в кожу спины каждой мыши. После вакцинации образцы крови были взяты из ретроорбитального сплетения, а сыворотка была получена и хранилась при -80 ◦C для дальнейшего анализа на выявление IgG. Пролиферацию спленоцитов и обнаружение цитокинов, субпопуляций Т-клеток, поверхностных маркеров ДК и Treg проводили после того же протокола вакцинации.

2.4.2. Анализ антител

Титры IgG в сыворотке против OVA определяли с помощью ИФА на 14, 28, 42 и 56 дни после упомянутой ранее первичной вакцинации (Zhang et al., 2018). IgG1 и IgG2a измеряли на 21-й день. Поглощение при 450 нм/630 нм определяли с помощью ридера (Bio-Rad, США). Результаты ответа антител выражены в виде титров IgG, а изотипы IgG1 и IgG2a выражены в виде соответствующих значений поглощения.

2.4.3. Анализ пролиферации спленоцитов

Анализ пролиферации спленоцитов у мышей проводили с помощью набора для анализа CCK-8 в соответствии с инструкциями производителя. На 21-е сутки после первой иммунизации из селезенки иммунизированных мышей выделяли спленоциты и лизировали эритроциты после измельчения. Спленоциты (1 × 106 клеток/лунку) стимулировали OVA (10 мкг/мл), OVA323-339 (10 мкг/мл), ConA (10 мкг/мл) и LPS (10 мкг/мл) для два дня и пустые клетки использовали в качестве контроля. Активность пролиферации выражали как индекс стимуляции (SI), который рассчитывали как отношение поглощения стимулированной клетки к нестимулированной клетке при длине волны 570/630 нм.

2.4.4. Анализ фенотипирования Т-лимфоцитов в дренирующих лимфатических узлах и селезенке

Суспензии спленоцитов из лимфатических узлов и селезенки иммунизированных мышей получали по указанной выше методике (Zhang et al., 2018). После промывки образцы (1 × 106 клеток/лунку) окрашивали в течение 30 мин антителами к поверхностным маркерам, включая анти-CD3-PE, анти-CD4-APC, анти-CD8a-FITC, анти-CD44-PE и анти-CD62L-PE. Уровни Т-лимфоцитов исследовали с помощью проточной цитометрии. Результаты фенотипов Т-лимфоцитов выражают в процентах CD4 плюс Т-клетки (в процентах), CD8 плюс Т-клетки (в процентах), CD44 плюс Т-клетки (в процентах) и CD62L плюс (в процентах) Т-клетки.

2.4.5. Проточно-цитометрический анализ уровня цитокинов

Для анализа внутриклеточного окрашивания цитокинов селезеночные лимфоциты отделяли и перерабатывали в одноклеточную суспензию на 21-й день после первой иммунизации (Zhang et al., 2017). Образцы (2 × 106 клеток/мл), стимулированные OVA (10 мкг/мл), инкубировали в течение 4 часов. Затем был добавлен голгистоп на 12 часов. Затем образцы промывали, блокировали и окрашивали антителами против CD4-APC или против CD8a-FITC в течение 30 минут. После фиксации и пермеабилизации с помощью Cyto fix/Cytoperm образцы метили анти-IL-4-PE или анти-IFN--PE антителами. Проточный анализ проводили для определения уровня цитокина.

2.4.6. Оценка активации DC и Treg-клеток в селезенке

Чтобы выяснить, играют ли DC и Tregs роль в усиленномиммунныйоткликпротив OVA, на 3-й день после первой вакцинации у иммунизированных мышей собирали лимфоциты селезенки для оценки созревания ДК (Zhang et al., 2017). Клетки соответственно блокировали и инкубировали с анти-CD11c-PE/FITC, анти-CD40-PE, анти-CD86-APC, анти-CD80-APC и анти-MHCII- ФИТЦ в течение 30 мин. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. На 21-й день после первой иммунизации Treg тестировали с помощью набора для окрашивания регуляторных Т-клеток мыши. Спленоциты окрашивали анти-CD4-FITC для маркеров клеточной поверхности с последующим внутриклеточным окрашиванием анти-CD25-APC и анти-Foxp3-PE в соответствии с инструкциями производителя. Уровень клеток CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс определяли с помощью проточной цитометрии.

Цистанхе завод экстракт способствуетиммунныйотклик

2.5. Эксперименты in vitro

2.5.1. Генерация DC, жизнеспособность клеток и уровень эндотоксина

ДК, происходящие из костного мозга мышей линии C57BL/6, получали по описанной ранее методике (Inaba et al., 1992). Вкратце, клетки культивировали в полной среде RPMI-1640 (20 нг/мл GM-CSF и 5 нг/мл IL-4). Через шесть дней все взвешенные клетки собирали в виде незрелых ДК для последующих анализов. Процентное содержание CD11c плюс DC в неприкрепленных клетках было определено как 94% с помощью проточной цитометрии.

Жизнеспособность клеток ДК и спленоцитов мышей при AECCD определяли с помощью набора CCK{{0}} в соответствии с инструкциями производителя. Клетки из DCS и спленоцитов получали и затем стимулировали различными концентрациями AECCD (0, 10, 100, 400, 800 и 1600 мкг/мл). Жизнеспособность клеток выражали как отношение поглощения обработанной группы к поглощению контрольной группы) × 100 процентов.

С целью исключения влияния эндотоксина при АЭЦЗ после предварительной обработки АЭЦЗ (100, 200 и 400 мкг/мл) и ЛПС (100 нг/мл) ФМБ (100 мкг/мл) в течение 60 мин, ДК (5 × 105 клеток/мл) инкубировали с предварительно обработанными AECCD (100, 200 и 400 мкг/мл) и LPS в течение 12 часов. После вышеуказанного лечения оценивали уровни CD40, CD86, CD80 и MHCII.

2.5.2. Анализ фенотипа DC

Уровни костимулирующих молекул определяли для оценки созревания в экспериментах in vitro. На шестой день DC обрабатывали AECCD (20, 100, 200 и 400 мкг/мл) или LPS (100 нг/мл) в течение 12 часов. Затем ДК окрашивали поверхностными молекулами и анализировали методом проточной цитометрии.

2.5.3. Продукция цитокинов DCs in vitro

Супернатант клеточной культуры собирали для измерения уровня цитокинов с использованием набора ELISA или набора для проточного анализа с несколькими аналитами методом СВА. Все этапы эксперимента проводились в соответствии с инструкциями производителя.

2.5.4. Аллогенная смешанная лимфоцитарная реакция (MLR)

Спленоциты мышей BALB/c получали в асептических условиях в среде RPMI- 1640 (Zhang et al., 2018). Зрелые ДК C57BL/6 (созревшие в присутствии различных концентраций AECCD или LPS) предварительно обрабатывали 50 мкг/мл митомицина С в течение 60 мин при 37°С. После отмывки ДК смешивали со спленоцитами в соотношении 1:5 или 1:10 в течение 2 сут. Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ.

2.5.5. Эксперименты по нейтрализации ингибиторов

Для исследования пути NF-κB, связанного с TLR4-, собранные DC загружали на 24-луночный планшет, а затем предварительно обрабатывали TAK-242 (5 мкМ) или PDTC (5 мкМ). , соответственно. После 1-часовой инкубации клетки стимулировали различными концентрациями AECCD (100, 200 и 400 мкг/мл) или LPS (100 нг/мл) в течение 24 часов. Затем определяли уровни экспрессии поверхностных молекул и цитокинов в культуральных супернатантах по методикам, описанным выше.

3. Результаты

3.1. FTIR-спектроскопия

Основные пики поглощения AECCD на рис. 1 представляют собой характерные пики поглощения гликозидных структур, соответствующие валентному колебанию O–H при 3342,95 см–1. Полоса при 2933,54 см–1 имеет характерное слабое поглощение валентных колебаний C–H. Пик при 1657,39 см-1 был приписан изгибным колебаниям O-H. Поглощение при 1411.00 см-1 было приписано валентным колебаниям О-Н или С-Н и С-О. Пики при 1018,38 см-1 также указывают на колебания гликозидных полос СО и С-О-С.

Рис. 1. FTIR-спектры AECCD.

3.2. OVA-специфический ответ сывороточных антител

Сыворотки иммунизированных мышей тестировали для проверки наличия образованных антител (IgG, IgG1 и IgG2a) против OVA. Как показано на рис. 2А, титры IgG у мышей, иммунизированных OVA/AECCD-M, вызывали более высокие уровни общего IgG (титры: 220, 000, 25{{30}}, 000 и 250,000) относительно группы OVA (титры: 100,000, 100,000 и 120,000), и был близко к группе Alum (титры: 250,000, 250,000 и 270,000) на 28, 42 и 56 дни после первичной вакцинации. OVA/AECCD-M/H значительно повышал уровни IgG1 по сравнению с группой OVA (P <0,05), а="" разница="" между="" группой="" ova/aeccd-m/h="" и="" группой="" alum="" была="" незначительной="" (p="">0,05). OVA/AECCD-M/H также заметно повышал уровни IgG2a по сравнению с группой OVA и группой квасцов (рис. 2B и C) (P <0,05). повышенный="" уровень="" igg2a="" может="" предотвратить="" заболевание,="" требующее="">иммунныйотклик.

Рис. 2. Титры OVA-специфических антител и изотипы IgG в сыворотке крови. Образцы сыворотки отбирали после первичной и бустерной иммунизации на антитела с помощью ИФА. (A) Титры IgG объединенной сыворотки оценивали на 14, 28, 42 и 56 дни после первой иммунизации. (B–C) IgG1 и IgG2a измеряли на 21-й день после первой иммунизации. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=6). *P < 0,05="" по="" сравнению="" с="">

3.3. Клеточные иммунные реакции

Пролиферацию лимфоцитов селезенки исследовали методом МТТ при повторной стимуляции OVA или OVA{{0}}. Анализ пролиферации показал, что OVA/AECCD-M заметно увеличивали пролиферацию спленоцитов после воздействия OVA, OVA323-339, Con A или LPS по сравнению с группой OVA. OVA и OVA 323-339 значительно улучшили более высокий ответ пролиферации, чем в группе квасцов (рис. 3) (P <>

Рис. 3. Пролиферация спленоцитов при обработке AECCD in vivo. Спленоциты повторно стимулировали OVA, OVA323-339, ConA или LPS и измеряли методом МТТ на 21-й день после первой иммунизации. Пролиферацию клеток выражали в виде индекса стимуляции (SI): (A–B) индекс стимуляции OVA и OVA323-339. (C–D) Индекс стимуляции ConA и LPS. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=5). *П<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Активация субпопуляций Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах и селезенке

Лимфатические узлы и селезенку иммунизированных мышей собирали для обнаружения субпопуляций Т-клеток на 21 день после первичной вакцинации. Процент подмножеств Т-клеток (CD4 плюс, CD8 плюс, CD44 плюс Т-клетки) из лимфатических узлов в группе OVA/AECCD-M был значительно выше, чем в группе OVA и группе квасцов (рис. 4A-D) (P < 0.05).="" процент="" подмножеств="" т-клеток="" (cd4="" плюс,="" cd8="" плюс,="" cd44="" плюс="" и="" cd62l="" плюс="" т-клетки)="" в="" селезенке="" был="" значительно="" выше,="" чем="" в="" группе="" ova="" (рис.="" 4e-j)="" (p=""><0,05). эти="" данные="" показали,="" что="" aeccd="" способствует="">иммунныйотклик.

Рис. 4. Уровни субпопуляций Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах и селезенке in vivo. На 21-й день после первой вакцинации клетки из лимфатических узлов и селезенки использовали для выявления субпопуляций Т-клеток с помощью проточной цитометрии. (A-D) Процент CD4 плюс, CD8 плюс и CD44 плюс Т-клетки в лимфатических узлах. (E–J) Процентное содержание CD4 плюс, CD8 плюс, CD44 плюс и CD62L плюс Т-клеток в селезенке. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" и="" ***p=""><0,001 по="" сравнению="" с="" ova;=""><0,05 и=""><0,01 по="" сравнению="" с="">

3.5. Цитокины, секретируемые рестимулированными спленоцитами in vivo

Цитокины Th1/Th2 из селезенки иммунизированных мышей определяли внутриклеточным окрашиванием на 21-й день после первой вакцинации. Уровни CD4 плюс IL-4, CD4 плюс IFN- и CD8 плюс IFN- в группе OVA/AECCD-M были значительно выше, чем в группе OVA и группе квасцов (P < 0="" .05,="" рис.="" 5).="" различия="" показали,="" что="" aeccd="" может="" стимулировать="" ответы="" th1/th2,="" особенно="" опосредованные="">иммунныйотклик.

Рис. 5. Анализ антигенспецифических цитокинов в Т-клетках in vivo. Спленоциты иммунизированных мышей исследовали на 21-й день после первой иммунизации путем окрашивания внутриклеточных цитокинов. (A) Процент CD4 плюс IL-4. (B-C) Процентное содержание CD4 плюс IFN- и CD8 плюс IFN-. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=5). *P < {{10}}.05="" и="" **p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" ova;=""><0,05 по="" сравнению="" с="">

3.6. Созревание DC и Tregs in vivo

Активация постоянного тока может инициировать адаптивный иммунитет. Влияние AECCD на созревание ДК у иммунизированных мышей оценивали на 3-й день после первой иммунизации. OVA/AECCD-M индуцирует самые высокие уровни CD40, CD80, CD86 и MHCII на ДК по сравнению с группой OVA, и разница между OVA/AECCD-M группа и группа квасцов были значительными (рис. 6A-D) (P <0,05). частота="" cd4="" плюс="" cd25="" плюс="" foxp3="" плюс="" treg="" в="" группе="" ova/aeccd-m="" была="" значительно="" ниже,="" чем="" в="" группе="" ova="" (рис.="" 6e)="" (p=""><0,05). эти="" данные="" свидетельствуют="" о="" том,="" что="" aeccd="" может="" активировать="" dc="" и="" снижать="" частоту="">

Рис. 6. Влияние AECCD на созревание DC и Tregs in vivo. Спленоциты мышей ICR использовали для выявления костимулирующих молекул на ДК и Трег на 3-й или 21-й день после первой иммунизации. (A–D) Процентное содержание CD40, CD86, CD80 и MHCII на CD11c плюс DC. (E) Процентное содержание CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс Tregs. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n {{10}}). *P < 0,05="" и="" **p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" ova;=""><0,05 и=""><0,01 по="" сравнению="" с="">

3.7. Анализы цитотоксичности и загрязнения эндотоксинами

После обработки различными концентрациями AECCD в течение 2 дней клетки DCS и спленоциты мышей использовали для определения потенциальной цитотоксичности с помощью набора CCK-8. Не было значительного ингибированного ответа пролиферации жизнеспособности клеток ДК и спленоцитов по сравнению с контрольными группами (рис. 7A-B) (P> 0.05). Эти результаты показали, что AECCD в концентрации 10–1600 мкг/мл не проявлял значительной цитотоксичности в отношении ДК и спленоцитов по сравнению с контролем (P > 0,05). Таким образом, концентрация AECCD в последующих экспериментах была установлена ​​ниже 1600 мкг/мл.

Чтобы исключить вмешательство загрязнения эндотоксином в эффекты AECCD на активацию ДК, для исключения загрязнения эндотоксином использовали ПМБ, антибиотик, широко известный благодаря его нейтрализующему ЛПС эффекту (Morrison and Jacobs, 1976). Как показано на рис. 7C–F, уровни экспрессии CD40, CD80, CD86 или MHC-II в ДК, обработанных AECCD, в присутствии PMB не показали значительных изменений ( Р > 0,05). Однако резкое снижение уровней экспрессии CD40, CD80 CD86 и MHC-II наблюдалось в обработанных LPS DC в присутствии PMB (P <0,001). эти="" результаты="" показали,="" что="" aeccd="" не="" содержит="">

Рис. 7. Цитотоксичность и влияние ПМБ на индуцированное созревание ДК при АЭЦЗ. (A–B) DCS и спленоциты мышей культивировали в присутствии AECCD в течение 2 дней для определения жизнеспособности клеток методом МТТ. (C–F) DC инкубировали в течение 12 ч с AECCD или LPS, предварительно обработанными в присутствии/отсутствии PMB в течение 60 мин. Определяли процентное содержание CD40, CD80, CD86 и MHCII на CD11c плюс DC. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n =3). **P <0,01 и=""><0,001 по="" сравнению="" с="" группой="" с="">

3.8. Фенотипическое созревание и функциональная активация ДК in vitro

Основываясь на вышеприведенных экспериментах по иммунизации, фенотипическое созревание DC дополнительно исследовали после обработки AECCD in vitro. На 6-й день незрелые ДК стимулировали заданной концентрацией AECCD или LPS для анализа поверхностных молекул. AECCD индуцировал созревание клеток, характеризующееся значительным увеличением процентного содержания CD40, CD80 CD86 и MHC II дозозависимым образом (P <0,001, рис.="" 8a-d).="" подобное="" фенотипическое="" созревание="" дк="" наблюдалось="" и="" после="" стимуляции="" 100="" нг/мл="" лпс.="" данные="" анализа="" показали,="" что="" aeccd="" улучшает="" созревание="">

Исходя из приведенных выше результатов, AECCD усиливал фенотипическое созревание DC. Чтобы проследить влияние AECCD на функцию ДК in vitro, исследовали способность ДК, обработанных AECCD, стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток в MLR при соотношении ДК и спленоцитов 1:5 или 1:10. расследовано. ДК, обработанные различными концентрациями AECCD, индуцировали значительную пролиферацию Т-клеток по сравнению с необработанными ДК (рис. 8E-F) (P < 0,001).="" созревание="" дк="" может="" индуцировать="" продукцию="" цитокинов.="" затем="" супернатанты="" дк,="" обработанных="" aeccd="" или="" lps,="" выявляли="" с="" помощью="" набора="" elisa.="" уровни="" il-12="" и="" tnf-="" в="" супернатантах="" дк="" были="" резко="" повышены="" в="" зависимости="" от="" дозы="" (p=""><0,001, рис.="">

Рис. 8. Фенотипическое созревание и функциональная активация ДК при воздействии AECCD in vitro. (A-D) На 6-й день ДК обрабатывали заданной концентрацией AECCD или LPS в течение 12 часов. Клетки окрашивали антителами и определяли с помощью проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD40, CD80, CD86 и MHCII на CD11c плюс DC. (E–F) ДК C57BL/6, обработанные различными концентрациями AECCD или LPS, смешивали со спленоцитами мышей BALB/c в соотношении 1:5 или 1:10 в MLR в течение 2 дней. Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ. (G-H) Супернатанты культур DC были проанализированы на IL -12 и TNF-a с помощью набора ELISA. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n =3). *P < 0,05,="" **p=""><0,01 и="" ***p=""><0,001 по="" сравнению="" с="" необработанными="" дк;="" #p=""><0,05 по="" сравнению="" с="">

3.9. TLR4, рецептор AECCD на DC

DCS может инициировать клеточную передачу сигналов мембранными рецепторами. Копределятьроль TLR4 в участии в созревании ДК, обработанных AECCD, после предварительной обработки ингибитором TLR4 TAK-242, ДК стимулировали заданной концентрацией AECCD, а затем состояние активации ДК исследовали с помощью проточного цитометра. . Уровни экспрессии цитокинов в культуральных супернатантах анализировали с помощью набора для проточного анализа с несколькими аналитами. Повышающая регуляция CD40, CD80, CD86 и MHC-II, индуцированная AECCD, значительно ингибировалась путем блокирования путей TLR4 (P <0,01, рис.="" 9a-d).="" более="" того,="" по="" сравнению="" с="" необработанным="" контролем="" блокирование="" tlr4="" с="" помощью="" tak-242="" оказывало="" более="" значительное="" ингибирующее="" действие="" на="" продукцию="" ifn-,="" tnf-="" и="" il-6="" (p=""><0,01, рис.="" 9e-g).="">

Рис. 9. Активация передачи сигналов TLR4 в ДК, обработанных AECCD. После того как незрелые ДК обрабатывали AECCD в отсутствие или в присутствии ТАК-242 в течение 12 ч, фенотипическое созревание исследовали с помощью проточного цитометра, а уровни цитокинов в супернатантах определяли методом СВА. (A–D) Процентное содержание CD40, CD80, CD86 и MHCII на CD11c плюс DC. (E–G) Уровни IFN-, TNF- и IL-6. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n=3). **Р < 0,01="" и=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. Активация DC с помощью AECCD через TLR 4-связанный путь NF-κB

Чтобы исследовать, регулируются ли экспрессии поверхностных молекул и цитокинов ДК, обработанных AECCD, с помощью NF-kB после того, как незрелые DC, предварительно обработанные ингибитором NF-kB PDTC, стимулировали с помощью AECCD в течение 12 часов, уровни экспрессии костимулирующих молекул и цитокинов измеряли с помощью проточный цитометр. Уровни CD40, CD80 CD86 и MHC-II, индуцированные AECCD, были значительно снижены по сравнению с необработанным контролем за счет блокирования путей NF-κB соответствующими ингибиторами (P < 0,001,="" рис.="" 10a–d).="" одновременно="" экспрессия="" ifn-,="" tnf-="" и="" il-6="" также="" значительно="" ингибировалась="" pdtc="" (p=""><0,05, рис.="">

Рис. 10. Участие NF-κB в AECCD-индуцированной активации DC. ДК обрабатывали AECCD в отсутствие или в присутствии PDTC в течение 24 часов. (A-D) Процентное содержание CD40, CD80, CD86 и MHCII на CD11c плюс DC определяли с помощью проточной цитометрии. (E–G) Уровни IFN-, TNF- и IL-6 в супернатанте определяли методом CBA. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n=3). * P <0,05, **="" p=""><0,01 и="" ***="" p=""><0,001 по="" сравнению="" с="" группой="" с="">

4. Дискуссия

В настоящее время различные полисахариды из традиционной китайской медицины исследовались в качестве адъювантов для вакцин для человека и животных (Sun et al., 2018; Rey-Ladino et al., 2011). В этом исследовании иммуномодулирующие эффекты AECCD и первичный механизм активации DC были исследованы in vivo и in vitro с помощью серии экспериментов для оценки адаптивногоиммунныйоткликпротив OVA и статус активации DCS. Эксперименты in vivo показали, что AECCD заметно способствует продукции OVA-специфических изотипов IgG и IgG, усиливает пролиферацию спленоцитов и индуцирует активацию Т-клеток и цитокинов (IL-4/IFN-). Кроме того, AECCD улучшал созревание DC и демонстрировал уменьшение Tregs. Эти данные свидетельствуют о том, что функция AECCD как эффективного адъюванта реализуется за счет стимуляции созревания DC и ингибирования Treg. Эксперименты in vitro показали, что AECCD способствует фенотипическому созреванию DC, цитокиновой секции и аллостимулирующей активности через TLR 4-связанный путь NF-κB. Эти экспериментальные результаты показали, что AECCD обладает значительным потенциалом в качестве иммуностимулятора.

Каждый адъювант обладает уникальными иммунными характеристиками против различных антигенов, что указывает на то, что адъюванты могут применяться при различных заболеваниях. Во-первых, адъювантные свойства совместного введения AECCD с OVA были протестированы путем определения их влияния на адаптивныеиммунныйотклику мышей. Многие исследования показали, что иммуностимулирующая активность прямо пропорциональна дозе в определенном диапазоне (Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017). Точно так же в исследовании анализ антител и изотипа показал, что AECCD в определенном диапазоне доз усиливал OVA-специфические ответы IgG, IgG1 и IgG2a, и что средняя доза AECCD была оптимальной дозой. В последующих экспериментах мы в основном исследовали стимулирующий эффект АЭЦКД в оптимальной средней дозе. Средняя доза AECCD значительно увеличивала ответ пролиферации спленоцитов у иммунизированных мышей, указывая на то, что AECCD стимулировал клеточный рост.иммунныйответыпротив ОВА. Эти результаты свидетельствуют о том, что AECCD усиливает как гуморальные, так и клеточныеиммунныйответы, которые были связаны с адъювантным потенциалом.
Вызванная значительная активность Т-клеток может способствовать ликвидации болезни. Во времяиммунныйоткликактивированные Т-клетки могут достигать вторичных лимфоидных тканей, включая селезенку и лимфатические узлы (Steinman, 2012). Средняя доза AECCD эффективно улучшала эффективность вакцины, поскольку она могла значительно усиливать ответы Т-клеток CD4, CD8, CD44 и CD62L в дренирующих лимфатических узлах и селезенке. Активированные Т-клетки CD8 опосредовали эрадикацию возбудителя путем секреции IFN-. Пролиферировавшие Т-клетки CD4 дифференцировались в клетки Th1 и клетки Th1. Клетки Th1 секретировали цитокин Th1 для стимуляции пролиферации лимфоцитов, а клетки Th2 секретировали цитокин Th2 для усиления выработки антител (Seder et al., 2008). В ходе исследования уровни CD4 плюс IL-4, CD4 плюс IFN- и CD8 плюс IFN- повышались при приеме AECCD в средней дозе. AECCD индуцировал сбалансированный ответ Th1/Th2 и направлялиммунныйоткликпутем изменения цитокиновой сети.

Адъювант должен индуцировать специфический иммунитет и контролировать исходиммунныйоткликрегулируя статус ДК во многих точках (Carrera Silva et al., 2013). Экспрессия поверхностных молекул на ДК является важным индикатором для оценки созревания ДК и обычно коррелирует с дифференцировкой Т-лимфоцитов (Steinman, 2012). В этом исследовании AECCD усиливал экспрессию костимулирующих молекул и облегчал созревание DC, когда его использовали в качестве адъюванта против OVA. Это может быть одним из способов, которыми AECCD способствовал гуморальному и клеточномуиммунныйответы. Между тем, AECCD также снижал частоту CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс Treg, что обеспечивало сбалансированный иммунитет после вакцинации. Наши результаты подтверждают недавние выводы о том, что различные полисахариды из ТКМ являются регулятором созревания DC (Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Активация адаптивногоиммунныйответыполисахаридными адъювантами опосредуется в первую очередь через их распознавание специфическими рецепторами ДК (Akira, 2004). ДК, активируемые путями, связанными с TLR, могут секретировать различные иммуномодуляторы в качестве критических медиаторов против инфекций (Akira, 2007). Поэтому в последующих экспериментах мы предварительно исследовали молекулярный механизм стимулирующего действия АЭКЦД на ДК in vitro. Чтобы наблюдать за цитотоксичностью AECCD, сначала определяли жизнеспособность клеток DC и спленоцитов мышей. AECCD в концентрации 10–1600 мкг/мл не проявлял цитотоксичности по отношению к ДК и спленоцитам. Чтобы исключить загрязнение LPS, мы предварительно обработали AECCD PMB. Уровни экспрессии CD40, CD80 CD86 и MHC-II в ДК, обработанных AECCD, не снижались, но PMB эффективно ингибировал экспрессию костимулирующих молекул в ДК, обработанных ЛПС. Это продемонстрировало, что AECCD не содержит эндотоксинов. Затем был дополнительно изучен статус активации DC. Подобно ДК, обработанным ЛПС, ДК, обработанные AECCD, дозозависимым образом повышали уровни CD40, CD80 CD86 и MHC II, а также выработку провоспалительного цитокина, который был показатель функциональной зрелости ДК. В MLR оценивали способность к пролиферации аллогенных Т-клеток в ДК, обработанных AECCD. AECCD может примировать и активировать аллогенные Т-клетки. ДК сначала предварительно обрабатывали митомицином С, а затем тщательно промывали для удаления этого реагента, поэтому действие AECCD на ДК вряд ли можно отнести к митогенной активности. Экспериментальные данные показали, что фенотипическое созревание и функциональная активация ДК могут быть связаны со стимуляцией AECCD.

Ряд полисахаридов ТКМ может стимулировать созревание ДК посредством TLR4. NF-κB как член нижестоящего пути, связанного с TLR, играет важную роль в регуляции фенотипического и функционального созревания DC и индукции экспрессии различных генов, участвующих виммунныйответы(Ци и др., 2016; Ре и Стромингер, 2001; Вэй и др., 2016; Чжу и др., 2013). В ходе экспериментов in vitro мы обнаружили, что AECCD способствует созреванию DC и что TAK-242 (ингибитор TLR4) и PDTC (ингибитор NF-kB) снижают уровни экспрессии CD40, CD80, CD86 и MHC. -II и уровни секреции IFN-, TNF- и IL-6 на ДК, обработанных AECCD. Эти результаты показали, что TLR4 и NF-kB участвуют в индуцированной AECCD активации ДК и секреции цитокинов. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными исследованиями, поскольку AECCD в качестве адъюванта улучшает нацеливание антигена на DC.

Таким образом, наши результаты показали, что AECCD индуцирует устойчивые ответы и ответы Th1/Th2, особенно опосредованные Т-клетками.иммунныйоткликпротив ОВА. AECCD активировал DC через TLR4-опосредованный путь NF-kB, тем самым усиливая выработку иммуномодуляторов и пролиферацию аллогенных Т-клеток. AECCD можно использовать в качестве эффективного адъюванта при разработке вакцин. Тем не менее, будет проведен точный компонентный анализ, чтобы определить, какой компонент в активированных DC AECCD. Сосредоточив внимание на механизмах того, как AECCD повышает иммуногенность, включая оптимизацию составов адъювантов и пути введения вакцины, мы дополнительно изучим иммуномодулирующие компоненты и специфические адъювантные свойства AECCD с целью разработки эффективных адъювантов вакцин против инфекционных заболеваний.

Цистанхе преимущества пустынипродвигатьиммунныйотклик

Вклад автора

Сбор, анализ и интерпретация данных: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Написание оригинального проекта: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Получение финансирования:Айлиан Чжан.

Расследование:Айлиан Чжан.

Методология:Айлиан Чжан, Бинь Ван.

Надзор:Айлиан Чжан.

Заявление о конкурирующих интересах

У авторов нет конфликта интересов, связанного с данным исследованием.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [номера грантов 31960164 и 31660259]. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, решении о публикации, подготовке или рукописи.

Авторы благодарят профессора Xingguo Zheng и Jiang He (Урумчи, Китай) за любезно предоставленные материалы и идентификацию.

использованная литература

Акира, С., 2004. Семейства рецепторов платных услуг: структура и функции. Семин. Иммунол. 16, 1–2.

Akira, KS, 2007. Передача сигналов NF-κB с помощью толл-подобных рецепторов. Тенденции Мол. Мед. 18, 156–163.

Banchereau, J., Steinman, RM, 1998. Дендритные клетки и контроль иммунитета. Природа 392, 245–252.
Бо, Р., Лю, З., Чжан, Дж., Гу, П., Оу, Н., Сунь, Ю., Ху, Ю., Лю, Дж., Ван, Д., 2019. Механизм Lycium липосом полисахаридов барбарума на активацию мышиных дендритных клеток. углевод. Полим. 205, 540–549.
Цао П., Ву С., Ву Т., Дэн Ю., Чжан К., Ван К., Чжан Ю., 2020. Важная роль полисахаридов в традиционной китайской медицине – очищение легких. и Детоксифицирующий отвар против пандемии COVID-19. углевод. Полим. 240,м116346
Каррера Силва, Э.А., Чан, П.Ю., Джоаннас, Л., Эррасти, А.Е., Гальяни, Н., Босурджи, Л., Джаббур, М., Перри, А., Смит-Чакмакова, Ф., Муцида, Д., Шерутре, Х., Берстин-Коэн, Т., Лейтон, Дж. А., Лемке, Г., Гош, С., Ротлин, К.В., 2013. Т-клеточное происхождение.
белок S задействует передачу сигналов рецептора ТАМ в дендритных клетках, чтобы контролировать величинуиммунныйотклик. Иммунитет 39, 160–170.
Китайская комиссия по фармакопее, 1992. Китайский стандарт лекарственных средств Министерства здравоохранения Китая, том первый. Пресса Китайской фармакопеи, Пекин, с. 1.

Донг, К., Яо, Дж., Фанг, Дж., Дин, К., 2007. Структурная характеристика и иммунологическая активность двух экстрагируемых холодной водой полисахаридов изЦистанхепустыняЮК Ма. углевод. Рез. 342 (10), 1343–1349.
Дюбуа М., Жиль К., Гамильтон Дж. К., Реберс П. А., Смит Ф., 1951. Колориметрический метод определения сахаров. Природа 168, 167.
Фу, З., Фан, X., Ван, X., Гао, X., 2018.ЦистанхиHerba: обзор ее химических, фармакологических и фармакокинетических свойств. Ж. Этнофармакол. 219, 233–247.
Джузеппе Д.Г., Рино Р., Дидьерлоран А.М., 2018 г. Корреляты адъювантности: обзор адъювантов в лицензированных вакцинах. Семин. Иммунол. 39, 14–21.
Инаба, К., Инаба, М., Романи, Н., Ая, Х., Дегучи, М., Икехара, С., Мурамацу, С., Штейнман, Р.М., 1992. Получение большого количества дендритных клеток мыши. культуры костного мозга с добавлением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Дж. Эксп. Мед. 176, 1693–1702 гг.
Ли, П., Ван, Ф., 2015. Полисахариды: кандидаты в перспективные вакцинные адъюванты. Препарат Дисков Тер 9, 88–93.
Li, X., Zhao, R., Li, H., De, Z., Wu, H., 2012. Депротеинизация полисахаридов из рыльца Maydis методом Севага. Доп. Матер. Рез. 340, 416–420.
Ли, Дж., Ли, Дж., Чжан, Ф., 2015. Иммунорегуляторные эффекты китайской фитотерапии на созревание и функцию дендритных клеток. Ж. Этнофармакол. 171, 184–195.
Ли, Т., Чжан, Л., Джин, К., Сюн, Ю., Ченг, Ю.Ю., Чен, К., 2020. Экстракт цветков граната двунаправленно регулирует пролиферацию, дифференцировку и апоптоз 3T3- Клетки L1 посредством регуляции экспрессии PPAR, опосредованной сигнальным путем PI3K-AKT. Биомед. Фармацевт. 131, 110769.
Morrison, DC, Jacobs, DM, 1976. Связывание полимиксина B с частью липида A бактериальных липополисахаридов. Иммунохимия 13, 813–818.
Пак, М.Дж., Рю, Х.С., Ким, Дж.С., Ли, Х.К., Кан, Дж.С., Юн, Дж., Ким, С.И., Ли, М.К., Хонг, Дж.Т., Ким, Ю., 2014. Полисахарид Platycodon grandiflorum индуцирует дендритную клетку созревание посредством передачи сигналов TLR4. Пищевая хим. Токсикол. 72, 212–220.
Qi, C., Guo, Y., Zhou, W., Zhang, Y., 2016. Иммуностимулирующие полисахариды, связанные с Toll-подобным рецептором 4-: первичная структура, отношения активности и возможные модели взаимодействия. углевод. Полим. 149, 186–206.
Re, F., Strominger, JL, 2001. Toll-подобный рецептор 2 (TLR2) и TLR4 по-разному активируют дендритные клетки человека. Дж. Биол. хим. 276, 37692–37699.
Рид С.Г., Орр М.Т., Фокс С.Б., 2013 г. Ключевые роли адъювантов в современных вакцинах. Нац. Мед. 19, 1597–1608 гг.
Рид, С.Г., Томай, М., Гейл, М.Дж., 2020. Новые горизонты адъювантов для разработки вакцин. Курс. мнение Иммунол. 65, 97–101.
Рей-Ладино, Дж., Росс, А.Г., Криппс, А.В., Макманус, Д.П., Куинн, Р., 2011. Натуральные продукты и поиск новых адъювантов для вакцин. Вакцина 29, 6464–6471.
Шейнс, В., Фернандес Эджада, А., Барьяктарови, А., Бузалас, И., Лавель, ЕС, 2020. Модуляцияиммунныйответыиспользование адъювантов для облегчения терапевтической вакцинации. Иммунол. Откр. 296, 169–190.
Седер, Р.А., Дарра, П.А., Рёдерер, М., 2008. Качество Т-клеток в памяти и защите: последствия для дизайна вакцины. Нац. Преподобный Иммунол. 8, 247–258.
Steinman, RM, 2012. Решения о дендритных клетках: прошлое, настоящее и будущее. Анну. Преподобный Иммунол. 30, 1–22.
Сунь Б., Ю С., Чжао Д., Го С., В. X., Чжао К., 2018. Полисахариды в качестве адъювантов вакцин. Вакцина 36, 5226–5234.
Тиан, Х., Лю, З., Пу, Ю., Бао, Ю., 2019. Иммуномодулирующее действие полисахаридов Пориа Коко посредством передачи сигналов TLR4/TRAF6/NF-κB in vitro и in vivo. Биомед. Фармацевт. 112, 108709.
Wei, W., Xiao, HT, Bao, WR, Ma, DL, Leung, CH, 2016. TLR-4 может опосредовать сигнальные пути экспрессии цитокинов, индуцированной полисахаридом астрагала RAP, в клетках RAW264.7. Ж. Этнофармакол. 179, 243–252.
Чжан, А., Ян, Ю., Ван, Ю., Чжао, Г., Ян, X., Ван, Д., Ван, Б., 2017. Адъювантные водные экстракты из Artemisia rupestris L. улучшаютиммунныйответычерез сигнальный путь TLR4. Вакцина 35, 1037–1045 гг.
Чжан, А., Ян, X., Ли, К., Ян, Ю., Чжао, Г., Ван, Б., Ву, округ Колумбия, 2018. Иммуностимулирующая активность полисахаридов, экстрагируемых водой изЦистанхепустыняв качестве растительного адъюванта in vitro и in vivo. PloS One 13, e0191356.
Чжао, Б., Лиан, Дж., Ван, Д., Ли, К., Чжан, А., 2019. Оценка водных экстрактовЦистанхепустыняпредставляет собой полисахаридный адъювант для вакцины против сезонного гриппа у молодых взрослых мышей. Иммунол. лат. 213, 1–8.
Zhou, L., Liu, Z., Wang, Z., Yu, S., Long, T., Zhou, X., Bao, Y., 2017. Полисахариды астрагала оказывают иммуномодулирующее действие через TLR4-опосредованное MyD88-зависимые сигнальные пути in vitro и in vivo. Научный представитель Великобритании 7, 44822.
Zhu, J., Zhang, Y., Shen, Y., Zhou, H., Yu, X., 2013. Полисахариды Lycium barbarum индуцируют Toll-подобные рецепторы 2- и 4-опосредованные фенотипические и функциональные созревание мышиных дендритных клеток посредством активации NF-κB. Мол. Мед. Отчет 8, 1216–1220.
Чжу, Н., Лв, С., Ван, Ю., Ли, Дж., Лю, Ю., Лу, В., Ян, Л., Чжао, Дж., Ван, Ф., Чжан, Л.В., 2016 г. , Сравнение иммунорегуляторных эффектов полисахаридов из трех природных трав и клеточного поглощения в дендритных клетках. Междунар. Дж. Биол. макромол. 93, 940–951.