CAR-нейтрофил-опосредованная доставка нанопрепаратов, чувствительных к микроокружению опухоли, для химиоиммунотерапии глиобластомы

Глиобластома (ГБМ) — одна из наиболее агрессивных и летальных солидных опухолей человека. Хотя для лечения различных видов рака были разработаны эффективные терапевтические средства, такие как новые химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки и химиотерапевтические средства, их эффективность при лечении ГБМ в значительной степени сдерживается гематоэнцефалическим барьером и гематоэнцефалическим опухолевым барьером. Нейтрофилы человека эффективно преодолевают физиологические барьеры и проявляют эффекторный иммунитет против патогенов, но короткая продолжительность жизни и устойчивость первичных нейтрофилов к редактированию генома ограничивают их широкое применение в иммунотерапии. Здесь мы генетически конструируем плюрипотентные стволовые клетки человека с нокаутом гена, опосредованным CRISPR/Cas9-, для экспрессии различных конструкций анти-GBM CAR с Т-специфичными CD3ζ или специфичными для нейтрофилов -сигнальными доменами. CAR-нейтрофилы с наилучшей противоопухолевой активностью производятся для специфической и неинвазивной доставки и высвобождения чувствительных к микроокружению опухоли нанопрепаратов для воздействия на GBM без необходимости вызывать дополнительное воспаление в местах опухоли. Эта комбинированная химиоиммунотерапия демонстрирует превосходную и специфическую активность против GBM, уменьшает нецелевую доставку лекарств и продлевает продолжительность жизни самок мышей с опухолями. В совокупности эта биомиметическая система доставки лекарств CAR-нейтрофилами представляет собой безопасную, мощную и универсальную платформу для лечения GBM и, возможно, других разрушительных заболеваний.

Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой

Глиобластома (ГБМ) характеризуется высокой смертностью, короткой продолжительностью жизни и плохим прогнозом с высокой тенденцией к рецидивам1,2. Терапевтической эффективности хирургического вмешательства и химиопрепаратов в первую очередь препятствуют тонкая структура мозга и физиологический гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) или гематоэнцефалический опухолевый барьер (ГЭББ)3–5. В частности, очень сложной задачей является доставка лекарств в центральную нервную систему (ЦНС) для лечения опухолей головного мозга:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Врожденный иммунитет и пластичность нейтрофилов против различных видов рака12–16, включая GBM, были менее изучены, чем их применение в качестве клеточных носителей при доставке лекарств8–10. Циркулирующие в крови нейтрофилы попадают в микроокружение гипоксической опухоли (ТМЕ), где они становятся гетерогенными опухолеассоциированными нейтрофилами (ТАН), важным компонентом иммуносупрессивного ТМЕ, который способствует прогрессированию рака и терапевтической резистентности12,17. Подобно макрофагам, в гипоксическом TME18–21 были обнаружены противоопухолевые N1 и проопухолевые N2 фенотипы TAN. Были разработаны различные терапевтические стратегии для прямого воздействия на нейтрофилы с акцентом на истощение или ингибирование нейтрофилов12,22, что привело к нескольким клиническим испытаниям (например, ингибитор CCR5 Маравирок в NCT03274804). Таким образом, прямое применение необработанных нейтрофилов в качестве наноносителя может представлять дополнительный риск для больных раком, у которых нейтрофилы, занимающиеся незаконным оборотом наркотиков, могут быть перепрограммированы на иммуносупрессивный проопухолевый фенотип N2 в ТМЭ после возвращения к опухолевым участкам13,23. Кроме того, следует изучить и усилить внутреннюю противоопухолевую активность наивных нейтрофилов для достижения оптимизированной терапевтической эффективности при использовании в качестве носителя лекарственного средства в сочетании с химиотерапевтическими средствами.

Преимущества цистанхе трубчатой-укрепить иммунную систему

Модификация химерного антигенного рецептора (CAR) значительно усиливает противоопухолевую активность иммунных Т-клеток или естественных киллеров (NK)24–27. Однако их эффективность при солидных опухолях по-прежнему ограничена, отчасти из-за их относительно низкой способности к транспортировке и проникновению в опухоль. Присутствие физиологического ГЭБ и ГЭББ еще больше снижает эффективность этих новых терапевтических средств против ГБМ в головном мозге. Мы предположили, что сочетание CAR-инженерии и высокоподвижных нейтрофилов может сохранить их противоопухолевый фенотип N1 и обеспечить превосходную терапевтическую эффективность при лечении GBM. Первичные нейтрофилы недолговечны и устойчивы к редактированию генома28, что ограничивает их применение в CAR-направленной иммунотерапии. Плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSC), которые более доступны для редактирования генов и способны массово дифференцироваться в нейтрофилы, могут стать неограниченным источником высококачественных CAR-нейтрофилов для таргетной иммунотерапии в химически определенных, свободных от ксеногенов условиях29. Нейтрофилы также преимущественно фагоцитируют микробные патогены с шероховатой или длинной поверхностью, такие как S. aureus и E. coli30, что следует учитывать при разработке наночастиц при доставке лекарств, опосредованной нейтрофилами. Действительно, Сафари и др. недавно сообщили о предпочтительном фагоцитозе внутривенно вводимых удлиненных частиц без сложной поверхностной модификации циркулирующими нейтрофилами30. Такая простая и биоинспирированная конструкция наночастиц, нагруженных лекарственными средствами, может максимизировать загрузку лекарственного средства в нейтрофилах и обеспечить терапевтический уровень доставки лекарств в целевые участки.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% введенных нанопрепаратов доставляются в опухоли головного мозга CAR-нейтрофилами по сравнению с 1% для свободных нанопрепаратов. Подводя итог, можно сказать, что наша биомиметическая система доставки лекарств CAR-нейтрофилами представляет собой безопасную, мощную и универсальную платформу для лечения GBM и других разрушительных заболеваний.

Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой

Полученные результаты

Скрининг нейтрофильно-специфичных CAR-структур на предмет усиления противоопухолевой активности

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, и большинство целевых клонов являются гетерозиготными (дополнительная рис. 1a-d). Экспрессия CAR на сконструированных hPSC была дополнительно подтверждена с помощью RT-PCR и анализа проточной цитометрии CLTX-IgG4 (дополнительная рис. 1e-g). Как и ожидалось, hPSC, экспрессирующие CAR, сохраняли высокие уровни экспрессии плюрипотентных маркеров, включая OCT4, SSEA4 и SOX2 (дополнительный рисунок 1f).

Для получения CAR-нейтрофилов de novo CAR-экспрессирующие hPSC сначала дифференцировали в мультипотентные гемопоэтические, а затем в миелоидные предшественники с помощью стадийно-специфической обработки цитокинами35 (рис. 2c). Последующее применение G-CSF и агониста ретиноевой кислоты AM580 способствовало устойчивому производству нейтрофилов36. Подобно своим аналогам в периферической крови (PB), нейтрофилы CLTX-CAR, полученные из hPSC, имели типичную морфологию нейтрофилов и поверхностные маркеры CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b и CD18 (дополнительный рисунок 2). Затем мы определили влияние экспрессии CAR на противоопухолевую цитотоксичность нейтрофилов, полученных из hPSC, путем их совместного культивирования с клетками глиобластомы (GBM) U87MG in vitro. Как и ожидалось, нейтрофилы CLTX-CAR, полученные из hPSC, продемонстрировали улучшенную способность уничтожать опухоли по сравнению с нейтрофилами PB (рис. 2d), что согласуется с предыдущими наблюдениями в клетках CLTX CAR-T27. Среди этих различных CAR CAR №1 опосредовал превосходную активность по уничтожению опухолей в hPSC-нейтрофилах. Примечательно, что CAR #4 на основе -цепи наименее эффективен в инициировании уничтожения опухоли, опосредованного нейтрофилами, что может быть связано с меньшим количеством копий ITAM, чем в ζ-субъединице, и более низкой экспрессией -несущих CAR на поверхности клеток28. Нейтрофилы выделяют цитотоксические активные формы кислорода (АФК) и фактор некроза опухоли (ФНО-), чтобы убить клетки-мишени. Продукция АФК и ФНО- (рис. 2д, е) разными нейтрофилами хорошо совпадала с усилением их цитолиза. Как и ожидалось, продукция АФК и ФНО- из различных нейтрофилов после совместного культивирования с нормальными глиальными клетками SVG p12 оставалась такой же низкой, как и в группе отрицательного контроля (дополнительные рис. 3a, b). Кроме того, повышенная противоопухолевая цитотоксичность CAR-нейтрофилов наблюдалась только при совместной инкубации с клетками GBM, включая U87MG, первичные взрослые клетки GBM43 и педиатрические клетки SJ-GBM2 (дополнительный рисунок 3c), демонстрируя высокую специфичность нашего CLTX. -МАШИНА. Примечательно, что нейтрофилы CAR продемонстрировали высокую биосовместимость с нормальными глиальными клетками SVG p12, hPSC и клетками, происходящими из hPSC (дополнительный рисунок 3d), что согласуется с предыдущим наблюдением о том, что инактивированные первичные нейтрофилы не убивают здоровые клетки16. В совокупности нейтрофилы CAR, полученные из hPSC, особенно CAR-нейтрофилы, несущие CD3ζ, продемонстрировали повышенную противоопухолевую цитотоксичность и продуцировали больше АФК и ФНО-in vitro, что подчеркивает их потенциал в таргетной иммунотерапии.

Рис. 1|Схема повышения эффективности борьбы с глиобластомой с использованием комбинированной иммунотерапии CAR-нейтрофилами и нанопрепаратами, чувствительными к опухолевому микроокружению. Плюрипотентные стволовые клетки человека были сконструированы с использованием CAR и дифференцированы в CAR-нейтрофилы, которые нагружены шероховатыми наночастицами кремнезема (НЧ SiO2), содержащими тирапазамин, воздействующий на гипоксию (TPZ) или другие препараты, в качестве двойной иммунохимиотерапии. b При системном введении CAR-neutrofil@R-SiO2- TPZ NP сначала атакуют внешние нормоксические опухолевые клетки, образуя иммунологические синапсы, и убивают опухолевые клетки посредством фагоцитоза. После апоптоза CAR-нейтрофилы могут высвободить наночастицы R-SiO2-TPZ, которые захватываются опухолевыми клетками. После этого нанопрепараты реагируют на гипоксическое микроокружение опухоли и эффективно убивают опухолевые клетки. Тетраэтилортосиликат ТЭОС, бис[3-(триэтоксисилил)пропил]тетрасульфид БТЕС, тирапазамин ТПЗ, бензотриазинил БТЗ.

CAR-нейтрофилы сохраняли превосходную противоопухолевую активность в иммуносупрессивном микроокружении опухоли.

Подобно макрофагам, в иммуносупрессивном опухолевом микроокружении были обнаружены противоопухолевые N1 и проопухолевые N2 фенотипы опухолеассоциированных нейтрофилов17. Проопухолевые нейтрофилы N2 играют решающую роль в опухолевом ангиогенезе, метастазировании и иммуносупрессии, но терапевтическое воздействие на этот тип клеток является сложной задачей.

Вместо стратегии системного истощения22 здесь мы оценили потенциал CAR-инженерии в поддержании противоопухолевого фенотипа нейтрофилов. Нейтрофилы, полученные из CAR hPSC, и нейтрофилы PB обрабатывали гипоксией (3% O2) и TGF, которые способствуют иммуносупрессии микроокружения опухоли37,38, чтобы оценить их устойчивую активность по уничтожению опухолей. В то время как нейтрофилы PB демонстрировали значительно сниженный цитолиз против клеток GBM в условиях иммуносупрессии, нейтрофилы CAR сохраняли высокую активность по уничтожению опухолей (дополнительная фигура 4a). Аналогичные наблюдения были также сделаны при высвобождении TNF и генерации АФК (дополнительный рисунок 4b, c) из PB или CAR-нейтрофилов в иммуносупрессивных и нормальных условиях. Для дальнейшего подтверждения фенотипа нейтрофилов в условиях гипоксии и TGF мы измерили экспрессию N1-специфической iNOS и N2-N2-специфической аргиназы на изолированных нейтрофилах методом проточной цитометрии (дополнительная фиг. 4г–е). По сравнению с нормоксией иммуносупрессивная гипоксия и TGF достоверно снижали уровень экспрессии iNOS и повышали уровень аргиназы в нейтрофилах PB, тогда как нейтрофилы CAR сохраняли высокий уровень экспрессии iNOS. Предыдущие исследования показали, что активация сигнального пути Syk-Erk приводит к продукции АФК39–42. Таким образом, мы обнаружили и сравнили активацию Syk-Erk в немодифицированных нейтрофилах и CAR-нейтрофилах, и наши результаты показали значительно более высокую активацию пути Syk-Erk в CAR-нейтрофилах в условиях гипоксии (дополнительный рисунок 5a-d), что может поддерживать неизмененная продукция АФК CAR-нейтрофилами в условиях гипоксии. В совокупности CAR-нейтрофилы сохраняли противоопухолевый фенотип и сохраняли высокую противоопухолевую активность в условиях микроокружения опухоли, имитирующих условия in vitro, что подчеркивает их потенциал в таргетной иммунотерапии.

Рис. 2|Скрининг структур химерных антигенных рецепторов, специфичных для нейтрофилов (CAR), с усиленной противоопухолевой активностью, опосредованной нейтрофилами. Схема различных структур CAR. b Схема конструкции CAR #1 и стратегии таргетного нокаута в локусе безопасной гавани AAVS1 плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC). Вертикальная стрелка указывает на sgRNA, нацеленную на AAVS1. Красные и синие горизонтальные стрелки указывают праймеры для анализа эффективности нацеливания и гомозиготности соответственно. HDR: восстановление гомологичной рекомбинации. c Схема оптимизированной дифференцировки нейтрофилов из hPSC в химически определенных условиях. d Анализы цитотоксичности в отношении клеток глиобластомы U87MG проводились при различных соотношениях нейтрофилов-мишеней к опухоли с использованием указанных нейтрофилов. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых биологических повторов, двусторонний t-критерий Стьюдента. Были определены генерация активных форм кислорода (АФК) (д) и ELISA-анализ высвобождения TNF (f) из различных нейтрофилов после совместного культивирования с клетками U87MG. n=5 биологически независимых образцов. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, двусторонний t-критерий Стьюдента. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

Получение и характеристика CAR-нейтрофилов hPSC, нагруженных наночастицами SiO2, содержащими тирапазамин (ТПЗ).

Нейтрофилы PB использовались в качестве клеточных носителей для доставки визуализирующих и терапевтических препаратов в опухоли головного мозга8–10, хотя целевая инфильтрация нейтрофилов требует хирургического вмешательства или вызванного светом воспаления, и нецелевая доставка лекарств может быть проблемой11. Для дальнейшего улучшения противоопухолевой активности CAR-нейтрофилов мы приготовили наночастицы кремнезема (SiO2-NP) с шероховатой или гладкой поверхностью для загрузки в нейтрофилы химиотерапевтических или радиационных препаратов. Изображения, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ), показали, что обе наночастицы SiO2 были хорошо диспергированы и имели сферическую морфологию с одинаковым размером (рис. 3а, дополнительный рис. 6а). Анализ распределения состава с помощью сканирующей ПЭМ (СТЭМ) с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (ЭДС) показал, что элемент сера (S) равномерно распределен внутри всех шероховатых наночастиц SiO2 (R-SiO2) (рис. 3б). Используя изотермы адсорбции-десорбции азота (N2) и соответствующий анализ распределения пор по размерам, размеры пор наночастиц R- и SSiO2 были измерены как 25 нм и 35 нм (рис. 3c, дополнительный рис. 6b) соответственно. Учитывая большую площадь поверхности и большой размер пор, терапевтические лекарства могут быть эффективно загружены как в НЧ R-, так и в S-SiO2, о чем свидетельствует чувствительный к гипоксии пролекарство тирапазамин (TPZ) (рис. 3d, дополнительный рис. 6c). . После загрузки TPZ существенных изменений в дисперсности, морфологии и размере R-SiO2-TPZ не наблюдалось с использованием ПЭМ и анализа динамического светорассеяния (дополнительный рисунок 6d, e). Тетрасульфидные связи, включенные в НЧ R-SiO2, чувствительны к восстановительной среде и могут быстро разрушаться из-за большого количества глутатиона (GSH), присутствующего в опухолевых клетках43. Затем мы определили способность R-SiO2-TPZ-NP к разложению в ответ на GSH в присутствии 10 мМ, 1 мМ и 10 мкМ GSH, которые были такими же, как внутриклеточные условия раковых клеток, нормальных клеток и внеклеточной среды43 соответственно. После обработки 10 мМ GSH первоначальная сферическая структура НЧ R-SiO2 – TPZ была сильно разрушена через 24 часа (дополнительный рисунок 6f, g). Наночастицы полностью распались на мелкие обломки через 48 часов, что привело к высвобождению ТПЗ под действием GSH (рис. 3e). Обломки НЧ R-SiO2 не вызывали какой-либо значительной цитотоксичности для тестируемых клеток in vitro (дополнительный рисунок 6h), что указывает на относительную безопасность НЧ R-SiO2.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Затем мы оценили возможность использования НЧ SiO2-TPZ для загрузки терапевтических препаратов в CAR-нейтрофилы в качестве комбинированной химиоиммунотерапии для достижения повышенной терапевтической эффективности. После центрифугирования мы измерили клеточное поглощение НЧ SiO2–TPZ нейтрофилами с помощью флуоресцентного микроскопа и анализа проточной цитометрии (рис. 3е, ж) и обнаружили более значительное поглощение клетками НЧ R-SiO2–TPZ, чем S-SiO2– ТПЗ НЧ нейтрофилов. Содержание клеточного Si в нейтрофилах было измерено методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) как 11,3 и 19,1 нг Si/мкг белка для гладких и шероховатых SiO2 NPs@TPZ (рис. 3h) соответственно. Учитывая их высокую нагрузочную способность в нейтрофилах, для последующих экспериментов были использованы НЧ R-SiO2–TPZ. Затем мы попытались проверить физиологические функции нейтрофилов CAR после загрузки НЧ R-SiO2-TPZ. Не наблюдалось никаких изменений в жизнеспособности клеток (рис. 3i, дополнительный рисунок 6i), способности к трансвелловой миграции (рис. 3j), хемотаксисе и соответствующей скорости (рис. 3k, l) CAR-нейтрофилов до или после загрузки R-SiO2. – ТПЗ НЧ, демонстрирующие их высокую биосовместимость. Также был проведен зависящий от времени анализ загрузки нанопрепаратов, и максимальное содержание нагрузки достигалось через 1 час после инкубации клеток-NP (дополнительная фигура 7a). Более 95% CAR-нейтрофилов были успешно загружены наночастицами R-SiO2 – TPZ (дополнительный рисунок 7b). Уровень экспрессии CD11b, поверхностного белка нейтрофилов, который опосредует функцию адгезии и миграции при стимуляции воспалительной молекулой, не менялся на CAR-нейтрофилах с нагрузкой R-SiO2-TPZ или без нее (дополнительные рис. 7c, d). Супероксид или активные формы кислорода (АФК) высвобождаются из активных нейтрофилов для уничтожения микробов и опухолевых клеток44. Как и ожидалось, генерация АФК CAR-нейтрофилами значительно увеличилась после обработки N-формилметионин-лейцил-фенилаланином (fMLP), и существенных различий не наблюдалось в продукции АФК CAR-нейтрофилами до и после нагрузки R-SiO2- ТПЗ (рис. 3м). В совокупности наши данные показали, что CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ, сохраняют физиологическую активность нейтрофилов дикого типа и могут активно мигрировать в сторону воспалительных стимулов, что подчеркивает их потенциал в таргетной химиоиммунотерапии рака.

CAR-нейтрофилы, нагруженные наночастицами R-SiO2-TPZ, эффективно убивают клетки глиобластомы.

Затем мы оценили влияние R-SiO2-TPZ на способность CAR-нейтрофилов уничтожать опухоли. Тесное взаимодействие эффектор-мишень было предпосылкой для цитолиза, опосредованного нейтрофилами. Как и ожидалось, CAR-neuтрофils@R-SiO2-TPZ образовывал иммунные синапсы с опухолевыми клетками в течение 2 часов и демонстрировал такое же количество взаимодействий эффектор-мишень, что и CAR-нейтрофилы, не содержащие лекарств (рис. 4a, дополнительная рис. 8). . Примечательно, что не было обнаружено никаких наблюдаемых взаимодействий между CAR-neuтрофils@RSiO2-TPZ и нераковыми соматическими клетками (дополнительный рисунок 8), что подчеркивает специфичность CLTX-CAR против опухолей головного мозга. Кроме того, НЧ R-SiO2 – TPZ высвобождались из нейтрофилов в культуральную среду (дополнительные рисунки 9a, b) через 12 часов после совместного культивирования и проникали в оставшиеся опухолевые клетки (рис. 4a). Через двадцать четыре часа после совместной инкубации CAR-нейтрофилов, нагруженных SiO2-TPZ NP, с опухолевыми клетками до 95% опухолевых клеток содержали R-SiO2-TPZ NP (рис. 4a, дополнительный рисунок 9c), что указывает на успешный результат. транспортный каскад с участием нейтрофилов-носителей, которые выполняют функцию эффекторных клеток и подвергаются апоптозу, тем самым пассивно высвобождая НЧ R-SiO2-TPZ к опухолевым клеткам-мишеням45. Мы также подтвердили функцию реагирования на гипоксию и цитотоксичность пролекарства TPZ в опухолевых клетках с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), анализа генерации радикалов из TPZ (дополнительный рисунок 9d) и анализа проточной цитометрии TOPRO-3 на опухоли. клетки (дополнительный рисунок 9e) в условиях гипоксии и нормоксии. Чтобы определить цитолиз CAR-нейтрофилов, нагруженных R-SiO2-TPZ NP, мы реализовали in vitro модель повторного заражения опухоли нормоксией-гипоксией (рис. 4б). Через двадцать четыре часа после нормоксического совместного культивирования CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ NP или нет, демонстрировали сходную противоопухолевую цитотоксичность (рис. 4в), и оба были выше, чем у PB-нейтрофилов, нагруженных R. -SiO2-TPZ NP или нет, и только R-SiO2- TPZ NP. Повышенная цитотоксичность обусловлена ​​главным образом повышенной способностью нейтрофилов нацеливаться на опухоли после CAR-инженерии. После дополнительных 12 и 24- часов гипоксического совместного культивирования с опухолевыми клетками CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ NP, продемонстрировали превосходную противоопухолевую способность по сравнению с другими группами (рис. 4d, e). Кроме того, нейтрофилы CAR, нагруженные НЧ R-SiO2-TPZ, демонстрировали превосходный цитолиз против повторно засеянных свежих опухолевых клеток (рис. 4f), что указывает на противоопухолевую способность высвобожденного R-SiO2-TPZ. наночастицы после апоптоза нейтрофилов.

Затем мы провели анализ секвенирования РНК (RNA-seq) на опухолевых клетках, чтобы выяснить потенциальный молекулярный механизм, лежащий в основе усиленного противоопухолевого цитолиза нейтрофилов за счет экспрессии CAR и R-SiO2-TPZ NP. Анализ экспрессии генов показал, что по сравнению с контролем и НЧ R-SiO2-TPZ, CAR-нейтрофилы, загруженные НЧ R-SiO2-TPZ или без них, значительно снижали экспрессию генов цитоплазмы и мембран в опухолевых клетках ( Дополнительные рис. 10a, рис. 4g), что дополнительно поддерживает фагоцитоз опухолевых клеток при совместном культивировании. В то время как все экспериментальные группы увеличивали клеточный окислительный стресс в опухолевых клетках, CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ, превосходили другие группы в запуске передачи сигналов окислительного стресса. Кроме того, CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ, значительно стимулировали апоптоз и уменьшали пролиферацию опухолевых клеток. Чтобы лучше понять повышенную противоопухолевую активность R-SiO2-TPZ-нагруженных CAR-нейтрофилов, мы применили ингибитор фагоцитоза цитохалазин D и поглотитель активных форм кислорода (АФК) N-ацетилцистеин (NAC) и ингибитор АФК GSK2795039 в совместной культуре опухоли и нейтрофилов. Цитолиз опухолевых клеток CAR-нейтрофилами был значительно снижен при использовании 5 мкМ цитохалазина D, 5 мМ NAC и 100 нМ GSK2795039 (дополнительные рис. 10b, c), что указывает на выдающуюся роль фагоцитоза и АФК в CAR-нейтрофил-опосредованных опухолевых клетках. убийство. Оставшиеся 40%-50% лизиса опухолевых клеток в присутствии нейтрофилов и NAC или GSK2795039 указывают на участие АФК-независимого механизма в опосредованном нейтрофилами уничтожении опухоли, которое заслуживает дальнейшего изучения.

Рис. 3|Получение и характеристика CAR-нейтрофилов hPSC, нагруженных наночастицами SiO2, содержащими тирапазамин (TPZ). a–e Показаны изображения элементного картирования шероховатых наночастиц SiO2, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) (а) и энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС) (б). c Показана изотерма адсорбции-десорбции азота шероховатыми наночастицами SiO2 вместе с графиком распределения пор по размерам Barrett-JoynerHalenda (BJH). Биологические тройные повторы выполняли независимо. Содержание загрузки TPZ в наночастицах SiO2 (d) и реагирующее на высвобождение TPZ глутатиона (GSH) (e) измеряли в указанное время. n=3 биологически независимых образцов. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для (e). Флуоресцентные изображения (f) и анализ проточной цитометрии (g) нейтрофилов, нагруженных гладким и шероховатым SiO2-TPZ. Биологические тройные повторы выполняли независимо. h Измеряли клеточное содержание SiO2 в CAR-нейтрофилах, полученных из hPSC. n=5 биологически независимые образцы, двусторонний t-критерий Стьюдента. Жизнеспособность клеток (i), n=3 биологически независимых образцов, трансмиграция (j), n=5 биологически независимых образцов, способности к хемоаттрактации (k, l), n=20 биологически независимых образцов и Показана способность к генерации АФК (m) CAR-нейтрофилов, полученных из hPSC, нагруженных шероховатым SiO2-TPZ или без него, n=5 биологически независимые образцы, двусторонний t-критерий Стьюдента. ПМА: форболмиристатацетат. Все данные на этом рисунке представлены как среднее ± SD. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

Функциональная оценка CAR-нейтрофилов, нагруженных нанопрепаратами, с использованием биомиметических моделей глиобластомы in vitro

Для дальнейшей оценки активности CAR-нейтрофилов, нагруженных R-SiO2-TPZ NP, мы внедрили трансвелловую модель опухоли гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), используя эндотелиальные клетки микрососудистых сосудов головного мозга человека (рис. 5а, дополнительный рисунок). 11а). Как и ожидалось, CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ NP, продемонстрировали превосходную способность к трансмиграции на модели BBB in vitro (рис. 5b), эффективно убивая целевые опухолевые клетки после трансмиграции как в нормоксических, так и в гипоксических условиях (рис. 5c). , d) и высвобождение большего количества воспалительных цитокинов (рис. 5e), которые могут привлекать другие эффекторные клетки для уничтожения опухолевых клеток. Кроме того, нейтрофилы CAR существенно не влияли на жизнеспособность эндотелиальных клеток после трансмиграции (дополнительный рисунок 11b). CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ NP, сохранили превосходную способность к трансмиграции во время второго эксперимента по трансмиграции (рис. 5f) и превосходную противоопухолевую способность по сравнению с другими группами (рис. 5g). Затем была использована трехмерная (3D) модель опухолевого сфероида для оценки способности проникновения в опухоль R-SiO2-TPZ-NP-нагруженных CAR-нейтрофилов (рис. 5h). CAR-нейтрофилы постепенно мигрировали к центру опухолевого сфероида и равномерно распределялись по сфероиду после 8 ч инкубации (рис. 5и). Наблюдалась высокая степень совместной локализации между нейтрофилами CAR и НЧ R-SiO2-TPZ (дополнительный рисунок 12a–c), демонстрируя, что НЧ R-SiO2-TPZ были стабильно инкапсулированы в CAR. -нейтрофилы при инфильтрации опухоли до их цитолиза. Без доставки, опосредованной нейтрофилами, НЧ R-SiO2-TPZ были обнаружены только на внешнем слое опухолевых сфероидов. По сравнению с R-SiO2-TPZ NP и CAR-нейтрофилами, R-SiO2-TPZ NP-нагруженные CAR нейтрофилы продемонстрировали превосходный противоопухолевый цитолиз в 3D-модели опухоли (рис. 5j). НЧ CAR-neutrofils@R-SiO2 также можно использовать для доставки других лекарств, включая клинический темозоломид (TMZ) и JNJ- 64619187, в трехмерные модели опухолей и эффективного уничтожения клеток GBM (дополнительный рисунок 12d – f). В совокупности комбинированные нейтрофилы CAR и нанопрепараты продемонстрировали превосходную противоопухолевую активность в биомиметическом микроокружении опухоли, имитируя условия in vitro, что подчеркивает терапевтический потенциал комбинированной химиоиммунотерапии на основе нейтрофилов.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Распределение in vivo наночастиц R-SiO2-TPZ, доставленных нейтрофилами CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% введенных нанопрепаратов были доставлены в опухоли головного мозга CAR-нейтрофилами по сравнению с 1% свободными нанопрепаратами, что согласуется с предыдущими отчетами6. Направленная доставка НЧ R-SiO2-TPZ в мозг хозяина через ГЭБ с помощью CAR-нейтрофилов также была подтверждена гистологическим анализом (рис. 6г). Напротив, одни только НЧ R-SiO2-TPZ накапливались в основном в печени и селезенке. В совокупности наши данные продемонстрировали усиленную адресную доставку R-SiO2-TPZ NP нейтрофилами CAR без необходимости вызывать дополнительное воспаление в месте опухоли, что подчеркивает осуществимость и безопасность химиоиммунотерапии на основе нейтрофилов при лечении рака.

Комбинированная химиоиммунотерапия CAR-нейтрофилами и наночастицами R-SiO2-TPZ продемонстрировала превосходную активность против глиобластомы in vivo.

Для определения терапевтической эффективности нейтрофилов CAR, нагруженных R-SiO2-TPZ NP, на мышах NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) была создана ксенотрансплантатная модель глиобластомы с использованием клеток U87MG, экспрессирующих люциферазу. Мышам с опухолями внутривенно вводили 5 × 106 нейтрофилов еженедельно (рис. 7а), а опухолевую нагрузку у хозяев измеряли и количественно определяли (рис. 7b, c). По сравнению с мышами, получавшими PBS или PB-нейтрофилы, лечение CAR-нейтрофилами и CAR нейтрофилами@R-SiO2-TPZ NP эффективно замедляло рост опухоли. НЧ CAR нейтрофилы@R-SiO2–TPZ продемонстрировали гораздо более высокую противоопухолевую цитотоксичность, чем любые другие экспериментальные группы. Напротив, PB-нейтрофилы значительно способствовали росту опухоли в головном мозге, что приводило к гибели мышей с опухолями уже на 23-й день (рис. 7d), что позволяет предположить, что неинженерные нейтрофилы могут представлять дополнительный риск. Затем мы измерили высвобождение цитокинов человека в плазме различных экспериментальных групп мышей (рис. 7e). Все экспериментальные группы, не получавшие PBS, продуцировали обнаруживаемые TNF и IL-6 в плазме с 5 по 26 день, что позволяет предположить активацию нейтрофилов человека при стимуляции опухоли. В соответствии с наблюдаемой более высокой скоростью роста опухоли, немодифицированные нейтрофилы постепенно выделяют больше IL-6 и TNF, что может привести к синдрому высвобождения цитокинов у пациентов и требует более углубленных исследований безопасности с блокаторами IL-646,47. . Примечательно, что НЧ CAR-neutrofils@RSiO2-TPZ продемонстрировали снижение способности к продукции цитокинов в более поздние моменты времени (день 19 и день 26), что указывает на потенциально низкий риск синдрома высвобождения цитокинов у пациентов, получающих химиоиммунотерапию на основе CAR-нейтрофилов. Биосовместимость комбинаторных CAR-нейтрофилов и R-SiO2-TPZ НЧ оценивали путем еженедельного измерения массы тела и мониторинга патологических изменений в основных органах мышей. Никакой разницы в массе тела между мышами, получавшими CAR нейтрофилы @ R-SiO2 – TPZ NP, и любыми другими экспериментальными группами не наблюдалось (рис. 7f), что указывает на минимальную системную токсичность и превосходную биосовместимость CAR-нейтрофилов @ R-SiO2 – TPZ NP в пределах 28 дней лечения. Гистологический анализ основных органов, срезанных у мышей на 30-й день, показал, что мыши, получавшие CAR-neutrofils@R-SiO2-TPZ NP, не вызывали заметных отклонений или повреждений органов в сердце, печени, селезенке, легких и почках (дополнительный рисунок). 13), что дополнительно подтверждает безопасность комбинаторных CAR-нейтрофилов и НЧ R-SiO2-TPZ.

Рис. 4|CAR-нейтрофилы, нагруженные наночастицами R-SiO2-TPZ, эффективно убивают клетки глиобластомы. Были показаны репрезентативные изображения иммунологических синапсов, на которые указывает накопление поляризованного F-актина на границе между CAR-нейтрофилами и опухолевыми клетками через 6, 12 и 24 часа. Наночастицы R-SiO2-TPZ, высвободившиеся из CAR-нейтрофилов при фагоцитозе опухолевых клеток, были поглощены опухолевыми клетками. Три повтора выполняли независимо. b Схема анализа противоопухолевой цитотоксичности, опосредованной нейтрофилами. Цитотоксичность против клеток глиобластомы U87MG оценивали при различных соотношениях нейтрофилов-мишеней к опухоли с использованием указанных нейтрофилов через 24 часа (с), 36 часов (г), 48 часов (д) и 72 ч (е). n=3 биологически независимых образцов. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). g Анализ массового секвенирования РНК проводили на клетках U87MG в различных условиях. Тепловая карта показывает уровни экспрессии выбранных цитоплазмы, мембраны, окислительного стресса, апоптоза и генов, связанных с пролиферацией, в указанных клетках глиобластомы. n=2 биологически независимых образцов. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

Рис. 5|Функциональная оценка CAR-нейтрофилов, нагруженных наночастицами R-SiO2-TPZ, с использованием моделей биомиметической глиобластомы (GBM) in vitro. Схема нашей модели опухоли in vitro ГБМ с гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), которая состоит из эндотелиальных клеток на мембране клеточной вставки и опухолевых клеток в нижней части того же трансвелла. б Показан анализ трансвелловой миграции нейтрофилов через 12 часов. Цитотоксичность против GBM указанных нейтрофилов через 24 часа (в) и 36 часов (г) измеряли и определяли количественно. Был проведен ELISA-анализ IL-6 и TNF, высвободившихся из указанных нейтрофилов через 36 часов. f Показана вторая миграция различных нейтрофилов через 48 часов. g Анти-GBM цитотоксичность указанных нейтрофилов через 60 часов измеряли и определяли количественно. h – j Схема трехмерной (3D) модели опухоли, инфильтрированной нейтрофилами, in vitro показана на (h). Были показаны репрезентативные флуоресцентные изображения инфильтрированных нейтрофилов в трехмерных моделях опухолей. DAPI использовали для окрашивания ядер клеток, а CD45 использовали для окрашивания нейтрофилов. Масштабные линейки, 200 мкм. Биологические тройные повторы выполняли независимо. j Соответствующую способность указанных нейтрофилов уничтожать опухоли измеряли и количественно определяли с использованием набора для определения цитотоксичности. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых биологических повторов, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

В то время как НЧ CAR-нейтрофил@R-SiO2-ТПЗ значительно замедляли рост опухоли у ксенотрансплантатных мышей, разница в выживаемости животных в экспериментальных группах НЧ CAR-нейтрофилы, НЧ SiO2-ТПЗ и НЧ CAR-нейтрофил@R-SiO2-ТПЗ незначительна. (p > 0.05), что, возможно, связано с гибелью короткоживущих нейтрофилов во время подготовки и инъекции клеток. Затем мы сосредоточились на этих трех группах и определили, повлияет ли сокращение времени подготовки клеток и увеличение доз CAR-нейтрофилов и нанопрепаратов на выживаемость животных (рис. 7g). При 6-кратном системном введении НЧ CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ превосходили две другие группы по увеличению продолжительности жизни мышей-опухоленосителей (рис. 7з), тогда как разница в выживаемости животных в группах CAR-нейтрофилов и SiO2- ТПЗ НП остались незначительными. Хотя между этими двумя независимыми исследованиями на животных наблюдалась аналогичная кривая выживаемости в группе R-SiO2- TPZ, время выделения клеток и подготовки к инъекции сократилось с примерно 4 часов до 1 часа в течение первых 4 нейтрофилов. дозы приводили к улучшению выживаемости животных в группах CAR-нейтрофилов до 32-го дня. В совокупности наши данные продемонстрировали важность подготовки нейтрофилов и оптимизации дозировки в будущих клинических применениях нейтрофильной терапии.

Обсуждение

Мышиные нейтрофилы были продемонстрированы как мощный носитель для эффективной доставки нанопрепаратов к воспаленным послеоперационным опухолям головного мозга8,9. Тем не менее, возможность и безопасность использования человеческих нейтрофилов для доставки лекарств остаются неясными. Большое количество нейтрофилов мыши (в 10 раз превышающее общее количество циркулирующих нейтрофилов у мышей11), используемое в этих исследованиях для достижения терапевтического эффекта, может еще больше затруднить их клиническое применение, поскольку извлечение большого количества нейтрофилов у онкологических больных может привести к нейтропении и позе другие риски. Чтобы решить эти проблемы, мы использовали возможности самообновляющихся hPSC для получения неограниченного количества нейтрофилов человека de novo29. С помощью CAR-инженерии29 мы разработали мощную биоинспирированную систему доставки лекарств, опосредованную нейтрофилами, и использовали сконструированные CAR-нейтрофилы человека в качестве наноносителя с поразительной противоопухолевой активностью. Шероховатые НЧ SiO2 работают лучше, чем гладкие НЧ SiO2 в CAR-нейтрофильных носителях, что согласуется с предыдущими наблюдениями о том, что нейтрофилы преимущественно фагоцитируют шероховатые микробные патогены30. Сообщалось, что нейтрофилы способствуют пролиферации и прогрессированию клеток глиомы48. Мы наблюдали аналогичный проопухолевый эффект немодифицированных нейтрофилов в нашем исследовании на животных, что подчеркивает необходимость разработки CCAR или других модификаций нейтрофилов для обеспечения их безопасности при доставке лекарств и других терапевтических применениях. Примечательно, что наша CAR-нейтрофил-опосредованная доставка лекарств зависит исключительно от нативной хемоаттрактантной способности ГБМ, а не от усиленных послеоперационных воспалительных сигналов, что позволяет предположить высокую специфичность и терапевтический потенциал нашей системы доставки лекарств в искоренении глубоко инфильтрированных глиом. которые невозможно удалить хирургическим путем. Поскольку хирургическая резекция и адъювантная химиотерапия/лучевая терапия являются основными клиническими вмешательствами при ГБМ12, комбинированное лечение нейтрофильными наноносителями CAR и хирургическое вмешательство/лучевая терапия могут достичь оптимальной терапевтической эффективности и заслуживают дальнейшего изучения. Конструкции CAR, специфичные для Т- и NK-клеток, широко используются для усиления противоопухолевой активности Т- и NK-клеток, но специфичные для нейтрофилов CAR, которые улучшают противоопухолевые функции нейтрофилов, не описаны. Ранее сообщалось, что химерные иммунные рецепторы CD4ζ и CD4 усиливают цитолиз нейтрофилов против клеток, трансфицированных ВИЧenv, in vitro. Тем не менее, эффективность лизиса составила всего ~10% при соотношении эффектор-мишень (Е:Т) 10:128. Fc RIIA (CD32a) представляет собой одноцепочечный трансмембранный рецептор с низким сродством к мономерному IgG, который высоко экспрессируется в нейтрофилах (от 30,000 до 60,000 молекул/клетку31), и его лигирование индуцирует Fc - зависимые функции нейтрофилов, такие как высвобождение содержимого гранул, мобилизация Ca2+, противоопухолевая цитотоксичность и фагоцитоз49. Учитывая выдающуюся роль CD32a в активации и функционировании нейтрофилов, мы разработали и протестировали конструкции CAR на основе CD32a. Однако наши результаты показали, что CD3ζ опосредует значительно лучший цитолиз, чем CD32a, при экспрессии в нейтрофилах, полученных из hPSC, что может быть отчасти связано с более высоким количеством копий ITAM в CD3ζ, чем в CD32a: три и одна копия соответственно, и более высокими уровнями экспрессии ζ, чем на клеточной поверхности нейтрофилов28. Как и CD32a, Fc RIII (CD16b) является еще одним рецептором с низким сродством к мономерному IgG и экспрессируется на нейтрофилах на гораздо более высоком уровне, чем CD32a31. Хотя перекрестное связывание CD16b индуцирует только мобилизацию и дегрануляцию Ca2+, но не фагоцитоз и цитолиз в нейтрофилах28,50, в будущих исследованиях по-прежнему будет представлять интерес систематическое сравнение способностей CD3ζ- и CD16b. -CAR в запуске и усилении противоопухолевых функций нейтрофилов.

Рис. 6|Распределение in vivo наночастиц R-SiO2-TPZ, доставленных нейтрофилами CAR (НЧ). a Схема внутривенно вводимых Cy5-меченных CAR нейтрофилов@R-SiO2 НЧ и R-SiO2 НЧ для исследования отслеживания клеток in vivo. 5 × 105 клеток U87MG, экспрессирующих люциферазу (Luci), стереотаксически имплантировали в правый передний мозг мышей NRG. Через 4 дня мышам внутривенно вводили PBS, 5 × 106 Cy5-меченые CAR нейтрофильные НЧ R-SiO2 и НЧ R-SiO2. b Зависимое от времени биораспределение нейтрофилов Cy5+ во всем теле, мозге и других органах определяли и количественно оценивали с помощью флуоресцентной визуализации в указанные часы. c Биораспределение CAR нейтрофилов@R-SiO2 NP и R-SiO2 NP у мышей через 24 часа после инъекции анализировали с помощью оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES) на основе элемента Si, и данные выражали в процентах введенной дозы на грамм ткани (%ID/г). n=5 биологически независимых образцов. Данные представлены как среднее ± SD. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных. d Были показаны репрезентативные изображения флуоресценции CD45 и SiO2 в указанных ксенотрансплантатах глиобластомы, выделенных от мышей с опухолями. Масштабные линейки, 100 мкм. Биологические тройные повторы выполняли независимо.

Рис. 7|Противоопухолевую активность in vivo комбинаторных CAR-нейтрофилов и наночастиц R-SiO2-TPZ (НЧ) оценивали посредством внутривенной инъекции. a Схема внутривенного введения PBS, PB-нейтрофилов, CAR-нейтрофилов и CAR-нейтрофилов @ R-SiO2-TPZ NP для исследования уничтожения опухолей in vivo. 5 × 105 клеток U87MG, экспрессирующих люциферазу (Luci), стереотаксически имплантировали в правый передний мозг мышей NRG. Через 4 дня мышам вводили внутривенно указанные нейтрофилы еженедельно в течение месяца. Зависимую от времени опухолевую нагрузку определяли (b) и количественно (с) с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI) в указанные дни. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение для мышей в (b) (n=5), однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). d Показана кривая Каплана-Мейера, демонстрирующая выживаемость указанных экспериментальных групп (n=5). Высвобожденный человеческий фактор некроза опухоли- (TNF) и IL-6 в периферической крови (e) и массу тела (f) различных групп мышей измеряли в указанные дни. Данные представляют собой среднее значение ± SD, n=5 биологически независимых образцов. ж, ч Оценивали противоопухолевую активность повышенных дозировок CAR-нейтрофилов и RSiO2-TPZ NP. g Схема внутривенного введения CAR-нейтрофилов, R-SiO2-TPZ NP и CAR-нейтрофил@ R-SiO2-TPZ NP для исследования уничтожения опухолей in vivo. h Показана кривая Каплана-Мейера, демонстрирующая выживаемость указанных экспериментальных групп (n=5). Кривые Каплана-Мейера анализировали с помощью лог-рангового теста. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.

Мы также представили здесь модульную и универсальную платформу доставки лекарств от нейтрофилов hPSC, которую в будущем можно будет модернизировать и настроить для поддержки других усилий, основанных на использовании нейтрофилов, для лечения других заболеваний человека. Во-первых, инженерия CAR более доступна в hPSC, чем в первичных иммунных Т-клетках и нейтрофилах. Для достижения стабильной и гомогенной экспрессии различных CAR требуется всего лишь однократное редактирование генома29. В дополнение к CAR CLTX мы также сконструировали стабильные линии hPSC, которые экспрессируют универсальный анти-флуоресцеин (FITC)51 или анти-PD-L1 CAR52, оба из которых можно использовать для получения универсальных твердых CAR-нейтрофилов, нацеленных на опухоли. Другие генетические модификации, такие как фиброз, нацеленный на анти-FAP CAR53, также могут быть выполнены для направления нейтрофильных наноносителей на лечение смертельных дегенеративных заболеваний, включая травму головного мозга и сердечный фиброз. Более того, CAR-экспрессирующие hPSC также могут быть легко адаптированы для производства CAR-T или CAR-NK-клеток29, а комбинации этой иммунотерапии с CAR-нейтрофильными наноносителями могут достичь оптимальных терапевтических противоопухолевых эффектов. Наконец, наша система нанопрепаратов, реагирующая на биоинспирированный опухолевый глутатион (GSH), представляет собой модульную и универсальную платформу для загрузки многообещающих химиотерапевтических или радиоактивных препаратов в CAR-нейтрофилы для целевой доставки лекарств, о чем свидетельствуют клинические TMZ, JNJ64619187 и пролекарственные препараты TPZ. Будущие исследования по тестированию других наночастиц могут привести к оптимизации загрузки лекарственного средства в нейтрофилы и достижению максимальной терапевтической эффективности in vivo.

Хотя мы продемонстрировали терапевтическую концепцию использования CAR-нейтрофилов для специфичной и эффективной доставки химиопрепаратов к опухолям головного мозга через ГЭБ, в этом исследовании есть несколько ограничений. Во-первых, 4-дневной инокуляции опухолевых клеток может быть недостаточно для установления опухолей, имитирующих клинический сценарий терапевтического исследования, и необходима будущая работа с различными периодами инокуляции опухолей, чтобы резюмировать различные стадии развития глиобластомы и терапевтический ответ в различных пациенты54,55. Во-вторых, у мышей с иммунодефицитом, которые мы использовали здесь, отсутствует адаптивный иммунитет, и необходимы другие доклинические модели с интактной иммунной системой, такие как домашние собаки со спонтанной глиомой56, чтобы лучше оценить безопасность и эффективность CAR-нейтрофилов, полученных in vitro. В частности, несмотря на короткую продолжительность жизни, необходимо профилирование нецелевой токсичности CAR-нейтрофилов с нагрузкой нанопрепаратов или без нее у животных, которым вводили нанопрепараты, включая синдром высвобождения цитокинов, нейротоксичность и нецелевую внеопухолевую токсичность, наблюдаемую в CAR-T-клетках57. нейтрофилов. В то время как осуществимые подходы, такие как создание гипоиммуногенных универсальных донорских hPSC58–61 и хранение гомозиготных библиотек hPSC с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA)62, легко доступны, чтобы избежать потенциального риска реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD), доклинические модели на животных с неповрежденная иммунная система по-прежнему необходима для оценки трансляционного потенциала нашей нейтрофильной терапии. Наконец, наблюдалась ограниченная противоопухолевая цитотоксичность и увеличение продолжительности жизни животных при использовании CAR-нейтрофильных нанопрепаратов. Таким образом, будущее исследование более эффективных химиотерапевтических препаратов или радиосенсибилизаторов, а также комбинированной терапии с классическим CAR-T и хирургической резекцией имеет важное значение для достижения максимальной противоопухолевой эффективности терапии CAR-нейтрофилами. Например, недавнее исследование по разработке механизмов привело к созданию более эффективного препарата KL-50, который преодолевает приобретенную резистентность, наблюдаемую в клиническом препарате TMZ63, и, таким образом, может быть включен в нашу модульную CAR-нейтрофильную платформу нанопрепаратов для потенциального более высокий терапевтический эффект. Продление срока годности нейтрофилов до 5 дней с помощью лечения CLON-G (каспазы-лизосомальная мембранная ингибирование проницаемости-окислителя-некроптоза плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор64) и/или использования более долгосрочной контролируемой системы высвобождения лекарственного средства в CAR-нейтрофилах также может достичь устойчивой противоопухолевой эффективности in vivo после апоптоза нейтрофилов. В совокупности наши результаты ясно продемонстрировали, что CAR-нейтрофилы, нагруженные R-SiO2-TPZ, могут поддерживать противоопухолевый фенотип N1 и эффективно убивать опухолевые клетки в различных опухолевых нише-подобных условиях in vitro. Функциональные CAR-нейтрофилы также могут быть получены в больших количествах из сконструированных hPSC для точной доставки нанопрепаратов, чувствительных к опухолевому микроокружению, для воздействия на GBM in vivo, что приведет к комбинированной химиоиммунотерапии с устойчивой и специфической активностью против GBM и минимальной нецелевой доставкой лекарств, которая увеличение продолжительности жизни мышей с опухолями.

Рекомендации

1. Ян Ф. и др. Синергическая иммунотерапия глиобластомы путем двойного воздействия IL-6 и CD40. Нат. Коммун. 12, 3424 https://doi.org/10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Лим М., Ся Ю., Беттегоуда К. и Веллер М. Современное состояние иммунотерапии глиобластомы. Нат. Преподобный Клин. Онкол. 15, 422–442 (2018).

3. Альярди Г. и др. Внутриопухолевая доставка IL-12 расширяет возможности иммунотерапии CAR-T-клетками на доклинической модели глиобластомы. Нат. Коммун. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021 г.).

4. Немет Т., Сперандио М. и Моксай А. Нейтрофилы как новые терапевтические мишени. Нат. Преподобный Друг Дисков. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0054-z (2020).

5. Субхан, М.А. и Торчилин, В.П. Нейтрофилы как новая терапевтическая мишень и инструмент для лечения рака. Наука о жизни. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Ченг Ю.Х., Хе К., Ривьер Дж.Э., Монтейро-Ривьер Н.А. и Лин З. Метаанализ доставки наночастиц в опухоли с использованием физиологически обоснованного фармакокинетического моделирования и подхода к симуляции. АСУ Нано 14, 3075–3095 (2020).

7. Вильгельм С. и др. Анализ доставки наночастиц в опухоли. Нат. Преподобный Матер. 1, 1–12 (2016).

8. Сюэ Дж. и др. Нейтрофил-опосредованная доставка противораковых препаратов для подавления послеоперационного рецидива злокачественной глиомы. Нат. Нанотехнологии. 12, 692–700 (2017).

9. Ву М. и др. Отслеживание с помощью МРТ нейтрофилов, активируемых воспалением, для таргетной терапии хирургически обработанной глиомы. Нат. Коммун. 9, 1–13 (2018).

10. Чу Д., Донг X., Чжао К., Гу Дж. и Ван З. Фотосенсибилизирующее праймирование опухолевого микроокружения улучшает доставку нанотерапевтических препаратов посредством инфильтрации нейтрофилов. Адв. Матер. 29 (2017).

11. Осука, С. и Ван Мейр, Э.Г. Терапия рака: трафик нейтрофилов в раковых нанопрепаратах. Нат. Нанотехнологии. 12, 616–618 (2017).

12. Лин, Ю. Дж., Вэй, К. С., Чен, П. Ю., Лим, М. и Хван, Т. Л. Роль нейтрофилов в глиоме и метастазах головного мозга. Передний. Иммунол. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Фридлендер З. и др. Поляризация фенотипа опухолеассоциированных нейтрофилов по TGF-бета: TAN «N1» против «N2». Раковая клетка (2009).

14. Блейсделл А. и др. Нейтрофилы противодействуют канцерогенезу эпителия матки путем удаления гипоксических опухолевых клеток. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Махиддин К. и др. Купирование опухолевой гипоксии раскрывает туморицидный потенциал нейтрофилов. Дж. Клин. Инвест 130, 389–403 (2020).

16. Ян Дж. и др. Полиморфноядерные нейтрофилы человека специфически распознают и уничтожают раковые клетки. Онкоиммунология 3, e950163 (2014).

17. Жайон С. и др. Разнообразие и пластичность нейтрофилов при опухолевой прогрессии и терапии. Нат. Преподобный Рак 20, 485–503 (2020).

18. Ли Х. и др. Ход исследований стволовых клеток глиомы в иммунном микроокружении глиомы. Передний. Фармакол. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Геринг А., Пщолковска Д., Валентинович К.А., Раджан В.Д. и Каминска Б. Иммунное микроокружение глиом. Лаб. Расследование. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Юнг Э. и др. Пластичность, гетерогенность и устойчивость опухолевых клеток в важнейших нишах микроокружения глиомы. Нат. Коммун. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021 г.).

21. Данн Г.П. и др. Новые методы иммунотерапии злокачественной глиомы: от иммуногеномики к клеточной терапии. Нейро. Онкол. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Йи П.П. и др. Ферроптоз, индуцированный нейтрофилами, способствует некрозу опухоли при прогрессировании глиобластомы. Нат. Коммун. 11 (2020).

23. Сагив, JY и др. Фенотипическое разнообразие и пластичность субпопуляций циркулирующих нейтрофилов при раке. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Ли, Ю., Хермансон, Д.Л., Мориарити, Б.С. и Кауфман, Д.С. Человеческие естественные клетки-киллеры, полученные из ИПСК, сконструированные с химерными антигенными рецепторами, усиливают противоопухолевую активность. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Ким, ГБ и др. Высокоаффинные мутантные интерлейкины-13, нацеленные на CAR Т-клетки, усиливают доставку кликабельных биоразлагаемых флуоресцентных наночастиц к глиобластоме. Биоакт. Матер. 5, 624–635 (2020).

26. Нгуен В. и др. Новая система доставки лигандов для неинвазивной визуализации и терапевтического использования опухолевого биомаркера IL13R2. Нейро. Онкол. 14, 1239–1253 (2012).

27. Ван Д. и др. CAR Т-клетки, управляемые хлоротоксином, для специфического и эффективного воздействия на глиобластому. наук. Перевод Мед. 12 (2020).

28. Робертс, М.Р. и др. Антигенспецифический цитолиз нейтрофилов и NK-клеток, экспрессирующих химерные иммунные рецепторы, несущие дзета- или гамма-сигнальные домены. Дж. Иммунол. 161, 375–384 (1998).

29. Чанг Ю. и др. Разработка нейтрофилов химерных антигенных рецепторов из плюрипотентных стволовых клеток человека для таргетной иммунотерапии рака. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Сафари Х. и др. Нейтрофилы преимущественно фагоцитируют удлиненные частицы, что дает возможность избирательного нацеливания при острых воспалительных заболеваниях. наук. Адв. 6, (2020).

31. Ван Ю. и Йонссон Ф. Экспрессия, роль и регуляция Fc-рецепторов нейтрофилов. Передний. Иммунол. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Немет Т. и др. Значение тирозинов ITAM цепи рецептора fc в активации нейтрофилов и аутоиммунном артрите in vivo. Передний. Иммунол. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Роль полиморфных форм нейтрофилов Fc RIIa (CD32) и Fc RIIIb (CD16) в фагоцитозе IgG1- и IgG3-опсонизированных бактерий и эритроцитов человека. Трансфуз. Мед. Ред. https://doi.org/10.1016/s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Цубои Н., Асано К., Лаутербах М. и Маядас Т.Н. Fc-рецепторы нейтрофилов человека инициируют и играют специализированные неизбыточные роли при воспалительных заболеваниях, опосредованных антителами. Иммунитет. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Чанг Ю. и др. Химически определенное образование гемогенного эндотелия человека и дефинитивных гемопоэтических клеток-предшественников. Биоматериалы 285, 121569 (2022).

36. Брок-Волчанская В.С. и др. Эффективное и быстрое получение функциональных нейтрофилов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ETV2-модифицированной мРНК. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Эмами Неджад А. и др. Роль гипоксии в микроокружении опухоли и развитии раковых стволовых клеток: новый подход к разработке лечения. Раковые клетки Int. https://doi.org/10.1186/s12935-020-01719-5 (2021 г.).

38. Леке А. и др. Влияние гипоксического микроокружения опухоли и пластичности опухолевых клеток на экспрессию иммунных контрольных точек. Рак Летт. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Такано Т., Сада К. и Ямамура Х. Роль протеинтирозинкиназы Syk в передаче сигналов окислительного стресса в В-клетках. Антиоксиданты Redox Signal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Чжан Дж. и др. АФК и АФК-опосредованная клеточная передача сигналов. Оксидат. Мед. Клетка. Долголетие. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Каваками Ю. и др. Путь активации Ras, зависящий от фосфорилирования Syk протеинкиназы C. Proc. Натл. акад. наук. США. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Моксай А., Руланд Дж. и Тибулевич В.Л.Дж. Тирозинкиназа SYK: решающий игрок в различных биологических функциях. Нат. Преподобный Иммунол. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Лю Б. и др. Нанокомпозит, чувствительный к микроокружению опухоли, для динамической терапии сероводородом и ферментами, усиленными тримодально. Адв. Матер. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Нгуен, Г.Т., Грин, Э.Р. и Мексас, Дж. Нейтрофилы для ROScue: механизмы активации НАДФН-оксидазы и бактериальной устойчивости. Передний. Клетка. Заразить. Микробиол. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Че Дж. и др. Нейтрофилы обеспечивают местную и неинвазивную доставку липосом к воспаленным скелетным мышцам и ишемизированному сердцу. Адв. Матер. 32, (2020).

46. ​​Ле, Р.К. и др. Краткое описание одобрения FDA: тоцилизумаб для лечения тяжелого или опасного для жизни синдрома высвобождения цитокинов, вызванного Т-клетками химерного антигенного рецептора. Онколог 23, 943–947 (2018).

47. Моррис, Э.К., Нилапу, С.С., Джавридис, Т. и Саделен, М. Синдром высвобождения цитокинов и связанная с ним нейротоксичность при иммунотерапии рака. Нат. Преподобный Иммунол. 22, 85–96 (2022).

48. Лян Дж. и др. Нейтрофилы способствуют развитию фенотипа злокачественной глиомы посредством S100A4. Клин. Рак Рез. 20, 187–198 (2014).

49. Нагараджан С. и др. Клеточная, зависимая от активации регуляция функции связывания лиганда CD32A нейтрофилов. Кровь https://doi.org/10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Фангер М.В., Шен Л., Грациано Р.Ф. и Гайр П.М. Цитотоксичность, опосредованная человеческими Fc-рецепторами для IgG. Иммунол. Сегодня. https://doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Ли, Ю.Г. и др. Регуляция токсичности, подобной синдрому высвобождения цитокинов CAR-T-клетками, с использованием адаптеров с низкой молекулярной массой. Нат. Коммун. 10, 2681 (2019).

52. Кагоя Ю. и др. Новый химерный антигенный рецептор, содержащий сигнальный домен JAK-STAT, обеспечивает превосходные противоопухолевые эффекты. Нат. Мед. 24, 352–359 (2018).

53. Агаджанян Х. и др. Борьба с сердечным фиброзом с помощью инженерных Т-клеток. Природа. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Чжан С. и др. ErbB2/HER2-специфические NK-клетки для таргетной терапии глиобластомы. Дж. Натл. Онкологический институт. https://doi.org/10.1093/jnci/djv375 (2016).

55. Ахаван Д. и др. CAR Т-клетки при опухолях головного мозга: извлеченные уроки и дальнейший путь. Иммунол. Ред. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Омар Н.Б. и др. Данные о безопасности и промежуточной выживаемости после внутричерепного введения M032, генно-инженерного онколитического вируса простого герпеса-1, экспрессирующего IL-12, домашним собакам со спорадическими глиомами. Нейрохирургия. Фокус 50, 1–11 (2021 г.).

57. Ларсон Р.С. и Маус М.В. Последние достижения и открытия в механизмах и функциях CAR Т-клеток. Нат. Преподобный Рак 21, 145–161 (2021).

58. Ван Б. и др. Генерация гипоиммуногенных Т-клеток из генно-инженерных аллогенных плюрипотентных стволовых клеток человека, индуцированных человеком. Нат. Биомед. англ. 5, 429–440 (2021).

59. Дойс Т. и др. Гипоиммуногенные производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток предотвращают иммунное отторжение у полностью иммунокомпетентных аллогенных реципиентов. Нат. Биотехнология. 37, 252–258 (2019).

60. Хан Х. и др. Генерация гипоиммуногенных плюрипотентных стволовых клеток человека. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Квон Ю.В. и др. Редактирование генома HLA DR с помощью TALEN в ИПСК человека привело к образованию иммунотолерантных дендритных клеток. Стволовые клетки Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021 г.).

62. Моризан А. и др. Соответствие MHC улучшает приживление нейронов, полученных из iPSC, у приматов, не являющихся людьми. Нат. Коммун. https://дой. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Лин К. и др. Основанный на механизмах дизайн агентов, избирательно воздействующих на лекарственно-устойчивую глиому. наук. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Фан Ю. и др. Воздействие на несколько путей гибели клеток продлевает срок годности и сохраняет функцию нейтрофилов человека и мыши для переливания. наук. Перевод Мед. 13, (2021).

65. Чанг Ю. и др. Флуоресцентные индикаторы для непрерывного и специфичного для каждой линии отчета о фазах клеточного цикла в плюрипотентных стволовых клетках человека. Биотехнология. Биоинж. бит.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Юнг Дж. и др. Химически определенное поколение дефинитивных гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников человека. ЗВЕЗДНЫЙ протокол. 4, 101953 (2023).