Популяции CD8 и CD4 Т-клеток в почках человека

edmund.chen@wecistanche.com

Абстрактный:Справочная информация: на пограничных участках и во внутренних органах резидентные в тканях Т-клетки памяти (TRM) вносят вклад в иммунный барьер против патогенов, таких как вирусы, бактерии, грибки и рак. Однако информация о наличии и функции этих клеток в почках человека скудна. Чтобы лучше понять иммунологическую защиту, опосредованную Т-клетками в этом органе, мы стремились определить фенотипические и функциональные аспекты Т-клеток CD8 и CD4, присутствующих в здоровых и аллотрансплантированных клетках.почка салфетка. Методы. Используя многоканальную цитометрию, мы оценили фенотип и функцию Т-клеток в образцах здоровой почечной ткани (n=5) ипочкааллотрансплантированной ткани (n=7) и сравнили эти аспекты с Т-клетками в периферической крови здоровых людей (n=13). Полученные результаты:Почкаобразцы тканей содержали значительное количество CD8 и CD4 Т-клеток. В отличие от циркулирующих клеток,почкаТ-клетки часто экспрессировали CD69 и CD103 и чаще активно циклировались. Кроме того, почти всепочкаТ-клетки экспрессировали CXCR3 и часто экспрессировали CXCR6 по сравнению с Т-клетками в кровотоке. Заметно,почкаТ-клетки продуцировали большее количество IFN, чем циркулирующие клетки, и часто были полифункциональными. Вывод: функциональные Т-клетки с характерными чертами TRM находятся в организме человека.почкаткани. Эти клетки чаще активно циклируются и часто экспрессируют CXCR3 и CXCR6.

Ключевые слова:тканевые резидентные лимфоциты; Т-клетки; CD8; CD4; CD69; CD103; почка; аллотрансплантат

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

1. ВведениеРезидентные Т-клетки памяти (TRM) сохраняются в тканях, чтобы обеспечить долгосрочную локальную защиту от патогенов. В отличие от рециркулирующих Т-клеток, популяции TRM не могут быть обнаружены в периферической крови и значительно отличаются от рециркулирующих популяций Т-клеток в отношении их фенотипа, функции и метаболизма [1]. В самом деле, это неудивительно, учитывая тот факт, что различные системы органов, такие как легкие, подвергаются более высоким нагрузкам различных патогенов, чем кровообращение, которое обычно изолировано от внешнего мира [2].Сохранение TkM в тканях сохраняется в течение многих лет и опосредуется механизмами, которые включают ось сфингозин-1-фосфатный рецептор1 (S1PR1)-сфингозин1-фосфат (SP1). S1PR1 представляет собой рецептор, экспрессируемый Т-клетками, который опосредует выход из вторичных лимфоидных органов после связывания с биоактивной сигнальной молекулой SP1, которая является важным медиатором переноса Т-клеток. Эта ось может быть прервана CD69, мембраносвязанным лектином c-типа, который противодействует экспрессии S1PR1, опосредуя, таким образом, удержание. Кроме того, у мышей экспрессия S1PR1 индуцируется транскрипционным фактором Krüppel-like Factor 2 (KLF2), который, как было обнаружено, подавляется при TRM, тем самым также ингибируя выход лимфоцитов [3]. В свою очередь, было показано, что подавление KLF2 опосредуется гомологом фактора транскрипции Blimpl в Т-клетках (Hobit), который экспрессируется TpM-специфическим образом в мышиных Т-клетках [4]. Кроме того, некоторые TRM также экспрессируют CD103 (интегрин E), благодаря чему TRM можно идентифицировать по экспрессии CD69 и CD103 [1].

В то время как знания о фенотипе и функции TRM для различных тканей человека увеличиваются, мало что известно об этих аспектах в настоящее время.почка. Здесь Т-клетки подвергаются воздействию определенного набора патогенов, таких как бактерии, восходящие из нижних мочевыводящих путей, и ренотропные вирусы, такие как полиомавирус BK (BKPyV). Действительно, недавно мы описали, как почки человека содержат подмножество Т-клеток, экспрессирующих CD69 и/или CD103, среди которых есть Т-клетки CD8, специфически нацеленные на белки BKPyV, белок вириона 1 (VP1) и белок большого Т-антигена (LTAG) [5]. Мы и другие также продемонстрировали наличие CD69/CD103-экспрессирующих ассоциированных со слизистой оболочкой инвариантных Т-клеток (MAIT) впочкаткани [6,7].

Чтобы лучше понять, какие Т-клетки составляют локальный иммунный ответ в этом органе, мы использовали многоканальную проточную цитометрию для исследования фенотипа и функциипочкаTRM, выделенные от донорапочкаматериал реципиентов почечного трансплантата (РТР) и от здоровыхпочкаткань, прилегающую к почечной светлоклеточной карциноме, чтобы увидеть, как эти популяции сравниваются с популяциями Т-клеток в кровотоке.Мы нашли этого человекапочкаткань содержит значительное количество CD4 и CD8 Т-клеток, экспрессирующих только CD69, CD69 и CD103 или не экспрессирующих ни один из этих маркеров. Мы обнаружили, что клетки CD69-CD103- впочкаткани существенно отличаются от Т-клеток в кровотоке и могут представлять популяцию TRM, лишенную канонических маркеров TRM. Кроме того, мы показываем, что почечные Т-клетки чаще активно циклируются, судя по повышенной экспрессии Ki-67, по сравнению с кровью. Мы также обнаружили, что CD8 и CD4 Т-клетки впочкаткани почти всегда экспрессируют CXCR3 и часто экспрессируют CXCR6. Эти данные указывают на роль этих хемокиновых рецепторов в привлечении и поддержании резидентных в почках популяций Т-клеток памяти.

2. Материалы и методы

2.1. Пациенты и образцыОбразцы были получены из биобанка почечных заболеваний амстердамского отделения UMC AMC. В этом биобанке образцы пациентов, такие как кровь ипочкаткани, собираются и хранятся у здоровых живыхпочкадоноры и RTR, за которыми наблюдали до и после трансплантации почки. Это исследование было проведено в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской и Стамбульской декларациях, и все участники дали письменное информированное согласие до регистрации в Биобанке. Кроме того, остаточная ткань пациентов, перенесших нефрэктомию опухоли (ткань почки, удаленная от опухоли), была передана в дар отделением патологии и также сохранена в биобанке. Эти ткани были обработаны анонимно в соответствии с Кодексом поведения Федерации голландских медицинских научных обществ (Ткани человека и медицинские исследования: Кодекс поведения для ответственного использования, 2011 г., www.federa.org).

2.2. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК)Образцы крови были получены от серонегативных по цитомегаловирусу (ЦМВ) здоровых контролей (живыепочкадоноры до операции, n= 13). Характеристики участников этого исследования представлены в таблице 1. РВМС выделяли из крови с гепарином натрия центрифугированием в стандартном градиенте плотности и впоследствии криоконсервировали до дня проведения анализа.

2.3. Ткань почекОбразцы здоровой почечной ткани (n {{0}}) были получены из почек, которые были удалены хирургическим путем из-за почечно-клеточной карциномы (отдаленная неопухолевая ткань от контралатерального полюса почки) и трансплантированной почечной ткани (n {{1 }}) был получен из эксплантированных почечных аллотрансплантатов после отказа трансплантата. Эти образцы называются образцами здоровой почки и образцом трансплантированной почки соответственно. Срезы коры почек нарезали на кубики 1- мм с помощью измельчителя тканей McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), переносили в пробирки объемом 50 мл и промывали холодным PBS до полного исчезновения крови. явно присутствовали, а супернатант был прозрачным. Добавляли предварительно нагретую (37°С) среду для расщепления, 40 мл на 10 г ткани (ДНКаза типа IV (50 КУ/мл) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Нидерланды), коллагеназа типа IV (0,5 мг/мл) (Worthington Biochemical, Лейквуд, Нью-Джерси, США), БСА (60 мг/мл) (Sigma Aldrich), 20 мкл/мл эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, VWR International BV, Амстердам, Нидерланды), ТРИС (0,025 М) (Merck BV, Амстердам, Нидерланды), пенициллин-стрептомицин (Biochrom GMBH, Берлин, Германия) в HBSS (Westburg BV, Леусден, Нидерланды)), и инкубировали в шейкере в течение 20 мин при 37°С. Теплую суспензию переносили в C-пробирку (Miltenvi, Бергиш-Гладбах, Германия) и подвергали воздействию программы M_spleen_04.01 на GentleMacs (Miltenyi). Среду для расщепления дезактивировали холодным PBS, и полученную клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр для получения суспензии отдельных клеток, которую подвергали центрифугированию в стандартном градиенте плотности в соответствии с протоколом производителя (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Осло, Норвегия). ). Выделенные мононуклеарные клетки (МНК почек) быликриоконсервировали до дня анализа в IMDM с добавлением 20% FCS, 000036 об./об.% -меркаптоэтанола, 5% ДМСО, пенициллина и стрептомицина.

2.4. Проточной цитометрииИзмерения проводили на проточном цитометре LSRFortessa (BD Biosciences). Для каждого образца анализировали 2×106 РВМС или от 0,5×106 до 10×106 МНК почек. Объем каждой реакции окрашивания зависел от количества клеток, а концентрации антител оставались постоянными. Клетки инкубировали с поверхностными антителами (дополнительная таблица S1) в течение 30 мин при 4 градусах в темноте. Мертвые клетки исключали с помощью фиксируемого красителя жизнеспособности eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, Сан-Диего, Калифорния, США). Моноклональные антитела с внутриклеточными мишенями (дополнительная таблица S1) добавляли после фиксации и пермеабилизации клеток с использованием набора для окрашивания FoxP3/транскрипционного фактора (eBioscience Inc.). Были соблюдены опубликованные методы проточной цитометрии и сортировки клеток для иммунологических целей [8]. Стратегию селекции, используемую для фенотипического анализа, можно найти на дополнительном рисунке S1. Ранее мы показали, что ни на один из проанализированных маркеров не повлиял метод расщепления, используемый для выделения МНК почек [7].

Ограничения по образцам тканей привели к исключению образцов из занавесок. Количество CD3 плюс количество клеток, проанализированное на образец в здоровых PBMC, здоровых почечных MNC и TX почках, можно найти на рисунке S3. Образцы MNC анализировали только в том случае, если они содержали более 50 процентов живых клеток внутри лимфоцитов, что оценивалось по жизнеспособности dve, а субпопуляции Т-клеток на основе CD69/CD103 подвергались дальнейшей характеристике только в том случае, если их общее количество клеток превышало 50.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ

2.5. Анализ стимуляцииРВМС и МНК почек стимулировали, как описано ранее [7,9]. PBMC и MNC почек оттаивали в присутствии ДНКазы I (200 KU/мл), промывали и оставляли для восстановления в течение ночи в необработанных круглодонных планшетах с 96-лунками (Corning) в культуральной среде (RPMI с добавлением 10% FCS и пенициллин-стрептомицин) в концентрации 20×106/мл (100 мкл/лунка).

На следующее утро для стимуляции клеток добавляли форбол 12-миристат 13-ацетат (ФМА, 10 нг/мл; Sigma Aldrich) и иономицин (1 мкг/мл; Sigma Aldrich). В качестве отрицательного контроля добавляли только среду. Все инкубации проводили в культуральной среде в присутствии CD28 (клон 15E8; 2 мкг/мл), CD29 (клон TS 2/16; 1 мкг/мл), брефельдина А (10 мкг/мл, Invitrogen) и ГольгиСтоп ( BD Biosciences) в конечном объеме 200 мкл на 4 часа при 37 градусах и 5 процентах CO2.

Впоследствии клетки инкубировали в течение 30 минут с поверхностными антителами (дополнительная таблица S2). Мертвые клетки исключали с помощью красителя для определения жизнеспособности eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, Сан-Диего, Калифорния, США). Моноклональные антитела для внутриклеточного окрашивания (таблица S1) добавляли после фиксации и пермеабилизации клеток с использованием набора реагентов Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Клетки дважды промывали и анализировали на проточном цитометре LSRFortessa. Стратегию стробирования, используемую в функциональном анализе, можно найти на дополнительном рисунке S2. Для определения полифункциональности каждой подгруппы Т-клеток среднее количество функций каждой популяции рассчитывали по следующей формуле: ((процент клеток, продуцирующих 1 цитокин]*1) плюс ([процент клеток, продуцирующих 2 цитокина]*2) плюс ([процент клеток, продуцирующих 3 цитокина]*3) плюс ([процент клеток, продуцирующих 4 цитокина]*4) плюс ([процент клеток, продуцирующих все 5 цитокинов]*5))/100.

2.6.Анализ данных

Данные были проанализированы с использованием FlowJo версии 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Все графики и рисунки были созданы с помощью Graphpad Prism версии 8.00 для Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Эта же программа использовалась и для статистического анализа данных. Для определения значимости непарных выборок использовали непараметрический критерий Манна-Уитни-U. Для сравнения парных выборок использовали критерий знакового ранга Уилкоксона. p-значения<0.05 were="" considered="" statistically="">

3. Результаты

3.1. Различная экспрессия CD8 и/или CD4 и маркеров тканевой резидентности Т-клетками в здоровой ткани почекВо-первых, мы сравнили экспрессию CD4 и CD8 CD3-позитивными Т-клетками в периферической крови с клетками, обнаруженными в здоровой ткани почек. CD4-CD8 плюс (CD8) Т-клетки значительно чаще выявлялись в ткани почек, чем в крови ((медиана) 25 процентов против 38 процентов) (рис. 1а). Напротив, CD4*CD{{9} }(CD4)Т-клетки чаще обнаруживались в крови, чем в почечной ткани ((70 процентов против 52 процентов) Рисунок 1а). В целом Т-клетки CD4 чаще обнаруживались в здоровой ткани почек, чем Т-клетки CD8 (рис. 1b).

Затем мы исследовали экспрессию тканевых маркеров, CD69 и CD103, в CD8 и CD4-определяемых подмножествах Т-клеток. Как и ожидалось, CD69 и CD103 практически не экспрессировались клетками периферической крови (рис. 1в). В здоровой ткани фенотипы CD69-CD103-, CD69 плюс CD103-, CD69tCD103 плюс и CD69-CD103 плюс были выражены в 46%, 45%, 6,6% и 1,8% CD8T-клеток, 61%, 38%, 0,44% и 0,43% CD4T-клеток соответственно (фиг.1c). В заключение, CD8, но особенно CD4 Т-клетки, были обнаружены в значительном количестве в здоровой ткани почек человека. Кроме того, экспрессия CD69 и CD103, маркеров тканевой резидентности, была обнаружена в основном среди Т-клеток, обнаруженных в здоровых тканях, а не в крови.

3.2. Различные паттерны экспрессии общих маркеров, обозначающих подмножества, Т-клетками в норме / в почечной ткани

CD45RA, тирозинфосфатаза, CCR7, хемокиновый рецептор, о котором известно, что он опосредует перенос Т-клеток во вторичные лимфоидные органы, а также CD28 и CD27, костимулирующие рецепторы, активно участвующие в активации Т-клеток, являются маркерами, традиционно используемыми для идентификации функциональных субпопуляций Т-клеток J1{ {53}},1л. Мы хотели выяснить, в какой степени распределение этих подмножеств в крови отличается от распределения в почечной ткани. Как и ожидалось, самые большие субпопуляции Т-клеток CD8, обнаруженные в кровотоке (т. е. те, которые составляют более или равно 5 процентам от общей популяции), были с CD45RA плюс CCR7 плюс CD28 плюс CD27 плюс (наивные Т-клетки или TN, ( медиана) 13 процентов), CD45RA-CCR7 плюс CD28 плюс CD27 плюс (Т-клетки центральной памяти или TcM, 6 процентов), CD45RA-CCR7-CD28 плюс CD27 плюс (TEv1,30 процент), CD45RA-CCR7-CD28 плюс CD27-(Tau2,10 процентов), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 процентов) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6%) и CD45RA плюс CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 процентов) фенотип. В здоровых тканях почти не было обнаружено (0,6%) Т-клеток CD8 с фенотипом TN, и лишь немногие (0,8%) проявляли фенотип Tax. Напротив, Т-клетки CD8, обнаруженные в здоровой ткани почек, состояли из значительного количества TEv1-(22 процента), TEM2-(12 процентов), Tpx3-(18 процентов), TEx{ {65}} (23 процента) и TEyRA (11 процентов) популяции Т-клеток (рис. 1d и рис. S4). При рассмотрении Т-клеток CD4 в крови самые большие популяции были те, которые экспрессировали Ty- (35 процентов), TcM- (25 процентов), TEM1- (16 процентов), TFM 2- (9 процентов) и популяция с неуказанным иным образом фенотипом CD45RAtCCR7-CD28 плюс CD27* (0,4 процента) (рис. 1d и рисунок S4). В здоровой ткани почек несколько Т-клеток CD4 экспрессировали TN- (3 процента) или TcM. -(3%) фенотип. Вместо этого в здоровой ткани было обнаружено значительное количество клеток с фенотипом TEM1-(22 процента), TEM2-(40 процентов) или TEM4 (14 процентов) (рис. 1d и рис. S4). . В заключение следует отметить, что распределение CD45RA/CCR7/CD28/CD 27-определенных субпопуляций Т-клеток CD8 и CD4 существенно различается между кровью и здоровой тканью почек.

3.3. Т-клетки CD8 и CD4 в здоровой ткани почки человека чаще состоят из клеток с активным цикломЗатем мы исследовали, существуют ли различия в экспрессии маркеров, типичных для профиля цитотоксической эффекторной памяти, между популяциями Т-клеток CD8 и CD4 в крови и ткани почек. Во-первых, мы рассмотрели экспрессию факторов транскрипции T-box T-bet и eomeso-dermin (Eomes). Эти регуляторы транскрипции непосредственно участвуют в генерации эффекторных клеток острой фазы, индуцируя экспрессию таких молекул, как интерферон-γ и гранзим B, а также в генерации вторичных ответов памяти. Как и ожидалось, экспрессия T-bet была частой среди циркулирующих CD8 T-клеток (54 процента), в то время как циркулирующие CD4 T-клетки редко экспрессировали этот транскрипционный фактор (13 процентов). Интересно, что для Т-клеток CD4 экспрессия T-bet была значительно выше среди Т-клеток, обнаруженных в здоровой ткани почек, чем в кровотоке (53 процента против 13 процентов). Некоторая экспрессия также часто обнаруживалась среди циркулирующих CD8 T-клеток (59 процентов), но снова была редкой среди циркулирующих CD4 T-клеток (15 процентов). Однако экспрессия Eomes была более частой среди Т-клеток CD4 в ткани почек (32 процента), чем в крови (рис. 2а, б).

Затем мы исследовали экспрессию гранзима В, сериновой протеазы, которая, как известно, опосредует апоптоз после инъекции в цитоплазму цитотоксическими Т-клетками. В соответствии с предыдущими отчетами экспрессия T-bet и гранзима B была обнаружена в значительных количествах в циркулирующих CD8 T-клетках (28 процентов). Однако его экспрессия была редкой среди циркулирующих Т-клеток CD4 (1 процент). Для Т-клеток CD8 экспрессия гранзима В была одинаковой в ткани почек и циркулирующих популяциях (28 процентов и 23 процента) (рис. 2c). Интересно, что более высокие частоты экспрессии T-bet и Eomes, обнаруженные в почечных CD4 T-клетках, не соответствовали более высокой частоте экспрессии гранзима B в этом компартменте (5 процентов). Затем мы рассмотрели экспрессию KLRG1, коингибиторного рецептора, который, как известно, преимущественно экспрессируется цитотоксическими эффекторными клетками острой фазы и эффекторными клетками памяти. KLRG1 часто экспрессировался циркулирующими Т-клетками CD8 (54%), но не Т-клетками CD4 ( 10 процентов). Не было обнаружено различий между анатомическими компартментами в экспрессии KLRG11 для CD8 или CD4 Т-клеток. Наконец, мы исследовали экспрессию Ki-67, маркера, обозначающего активно циклирующие клетки. В соответствии с предыдущими наблюдениями экспрессия Ki-67 среди циркулирующих Т-клеток CD8 и CD4 была редкой (1 процент и 2 процента соответственно). Интересно, что среди Т-клеток CD8, но особенно среди Т-клеток CD4, экспрессия Ki-67 значительно чаще выявлялась в Т-клетках в ткани почек (3% и 11% соответственно) (рис. 2е). В заключение, CD4 T-клетки были обнаружены в здоровой ткани почек человека, но не CD8 T-клетки в этом компартменте, чаще экспрессированные T-bet и Homes. Однако это не приводило к более частой экспрессии гранзима В CD4 Т-клетками почек. Более того, хотя общее количество циклирующих клеток было низким, ткань почек содержала значительно более активно циклирующие CD8 и CD4 Т-клетки, чем кровоток.

3.4. CD8 и CD4 Т-клетки в здоровой почечной ткани почти все занимают положение CXCR3-Затем мы искали различия в экспрессии других маркеров, типичных для циркулирующих популяций нецитотоксических клеток памяти, как было показано ранее для циркулирующих популяций Т-клеток. Сначала мы рассмотрели экспрессию IL-7R, экспрессируемую в первую очередь на наивных и рано дифференцированных клетках памяти в кровообращении, где он участвует в поддержании гомеостатической пролиферации [10,12,13]. В периферической крови IL-7Ra часто экспрессировался Т-клетками CD8 (84%) и Т-клетками CD4 (98%). Т-клетки CD8 и CD4 в здоровой ткани почек экспрессировали этот маркер значительно реже, чем циркулирующие Т-клетки (71% и 76% соответственно) (рис. 2f).

Затем мы исследовали экспрессию различных других хемокиновых рецепторов. Интересно, что CXCR3, хемокиновый рецептор, участвующий в переносе Т-клеток в воспаленные ткани [14-17], экспрессировался чрезвычайно большим количеством Т-клеток CD8 и CD4 в ткани почек (99). % и 91 % соответственно) и значительно реже циркулирующими Т-клетками (58 % и 26 % соответственно) (рис. 2g). Наконец, мы определили экспрессию CXCR6, которая, как известно, участвует в формировании популяций TRM [18-22]. В то время как CXCR6 экспрессировался лишь небольшой популяцией циркулирующих CD8 Т-клеток (16 процентов) и практически не экспрессировался циркулирующими CD4 Т-клетками. значительно большая доля Т-клеток CD8 и CD4 в ткани почек экспрессировала эту молекулу (40 процентов и 40 процентов соответственно) (рис. 2h). В заключение, маркеры, обычно связанные с не сразу дифференцированным состоянием в кровотоке, вероятно, -7Ra, CCR7, CD28 и CD27, значительно реже экспрессировались CD8 и Т-клетками почек по сравнению с таковыми в крови. напротив, Т-клетки почек чаще экспрессировали CXCR6 и почти всегда экспрессировали CXCR3.

3.5. Различия в фенотипе между здоровыми почечными и аллотрансплантированными Т-клетками минимальныЗатем мы хотели выяснить, сохраняются ли эти данные в тканях трансплантированных почечных аллотрансплантатов, полученных по различным клиническим показаниям (табл. 1).Что касается количества Т-клеток CD8 и CD4 в здоровой ткани и ткани аллотрансплантата, различий не наблюдалось (рис. 3а). Однако мы заметили незначительную тенденцию к большему количеству клеток CD4T и меньшему количеству клеток CD8T в здоровой ткани, чем в ткани аллотрансплантата (рис. 3b). Кроме того, при рассмотрении экспрессии CD69/CD103 и определенных подмножеств CD45RA/CCR7/CD28/CD27-не обнаружено различий в распределении CD69/CD103- или CD45RA/CCR7/CD28/CD27-. были отмечены определенные подмножества, независимо от фенотипа CD8/CD4 (рис. 3d и рис. S5). При изучении частот экспрессии маркеров, более типичных для цитотоксических циркулирующих Т-клеток, мы не обнаружили различий в экспрессии T-bet, KLRG1 или гранзима B между здоровыми почечными или аллотрансплантированными Т-клетками (рис. 3a, gh). Мы обнаружили, что экспрессия Eomes наблюдалась реже в Т-клетках CD4 ткани аллотрансплантата, чем в Т-клетках здоровой ткани (рис. 3f). Различий в экспрессии других маркеров не наблюдалось. (Рисунок 3-l и Рисунок S5b-d). В заключение, помимо более низкой частоты экспрессии Eomes среди аллотрансплантированных CD4 Т-клеток, клеточные популяции не различались между исследуемыми популяциями.

3.6. CD69-CD103-Т-клетки в почечной ткани отличаются от циркулирующих клетокУчитывая сходный фенотипический состав Т-клеток CD8 и CD4, обнаруженный в здоровой ткани почки и в ткани аллотрансплантата почки, мы объединили данные обеих исследовательских групп для дальнейшего изучения характеристик этих клеток в соответствии с экспрессией CD69 и CD103. Поскольку клетки CD69-CD103 plus всегда обнаруживались на очень низких частотах (<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Во-первых, мы исследовали различия в этих подмножествах в соответствии с коэкспрессией CD69/CD103 в популяциях Т-клеток почек (рис. 4 и рис. S6). Интересно, что как для CD8, так и для CD4 Т-клеток были отмечены существенные различия в распределении определенных подмножеств CD45RA/CCR7/CD28/CD27-среди CD69-CD103-, CD69 плюс CD{ {14}}и подгруппы CD69*CD103*. Что касается Т-клеток CD8, CD69-CD103-клетки содержали значительную популяцию клеток TeyRA (21 процент), которая была намного меньше среди субпопуляций CD69 плюс CD103- и CD69 плюс CD103 (5,8%). % и 2,2 % соответственно). Вместо этого эти последние популяции содержали гораздо более крупные TEy3 (13 %, 30 % и 32 % соответственно) и TEy4 (8 %, 19 % и 33 % соответственно) субпопуляции. Что касается Т-клеток CD4, то среди субпопуляций CD69-CD103-, CD69*CD103- и CD69 плюс CD103* было обнаружено несколько клеток TEyRA (2,6%, 0% и 1,7%, соответственно). Вместо этого эти клетки содержали большие субпопуляции клеток TFw1 (26%, 0,24% и 10% соответственно) и клеток TEy2 (30%, 46% и 27% соответственно). Среди CD69 плюс CD103-и особенно среди клеток CD69*CD103* наблюдалась гораздо большая субпопуляция TEM4 (6%, 11% и 34% соответственно).

Учитывая эти различия и предыдущее наблюдение, что популяции Т-клеток в почках едва включают клетки TN и TcM, мы дополнительно исследовали клетки CD69-CD103-, обнаруженные в ткани почек, чтобы определить, в какой степени эти клетки были не только циркулирующие клетки, проходящие через кровообращение в почках. Для этого мы сравнили эти клетки с циркулирующими клетками. CD69-CD103~клетки в ткани почек значительно отличались от таковых в кровотоке: T-bet, Ki-67 и CXCR3 чаще экспрессировались Т-клетками почек, независимо от фенотипа CD8/CD4 (рис. 5а-в). Напротив, IL-7R, CCR7, CD28 и CD27 значительно реже экспрессировались CD69-CD103- Т-клетками почек, независимо от фенотипа CD8/CD4 (рис. 5d- грамм). CD69-CD103-CD4 T-клетки в ткани почек экспрессировали KLRG1 значительно чаще, чем в крови, а CD69-CD103-CD8 T-клетки в ткани почек экспрессировали Eomes значительно чаще, чем в крови.

Затем мы хотели увидеть, как коэкспрессия CD69 и CD103 влияет на маркеры функционального потенциала. Во-первых, мы рассмотрели маркеры, связанные с цитотоксическим потенциалом. Хотя между отдельными субпопуляциями были отмечены различия, не наблюдалось никаких последовательных закономерностей для T-bet и Eomes в Т-клетках CD8 при коэкспрессии CD69 или CD103 (рис. 6а, б). Напротив, в Т-клетках CD4 эти факторы транскрипции увеличивались вместе с Коэкспрессия CD69 и CD103 (рис. 6а, б). Изучая KLRG1, мы заметили, что для Т-клеток CD8 экспрессия KLRG1 снижалась вместе с коэкспрессией CD69/CD103. Аналогичная тенденция наблюдалась для Т-клеток CD4. Однако здесь только клетки CD69-CD103- экспрессировали KLRG1 с более высокой частотой, чем клетки CD69 плюс CD103- и CD69 плюс CD103* (рис. 6c). Частота экспрессии гранзима B также снижалась вместе с маркерами резидентности в ткани, при этом частота его экспрессии была самой низкой среди клеток CD69 плюс CD103*, как в CD8, так и в CD4 T-клетках (рис. 6d). Экспрессия Ki-67, которая была выше среди Т-клеток почек по сравнению с Т-клетками в крови, не отличалась в зависимости от коэкспрессии CD69 или CD103 (рис. 6e).

Затем мы исследовали маркеры, обычно связанные с нецитотоксическим профилем памяти в соответствии с коэкспрессией CD69/CD103. Экспрессия IL-7Ra, CCR7 и CD28 была самой высокой в ​​популяциях CD69-CD103- с тенденцией к определению экспрессии наряду с коэкспрессией CD69/CD103 (рис. 6f-h). ). Затем мы рассмотрели экспрессию CXCR3 и CXCR6. Оба хемокиновых рецептора наиболее часто экспрессировались клетками CD69tCD103t независимо от фенотипа CD8/CD4 и демонстрировали тенденцию к увеличению при коэкспрессии CD69/CD103. Только для CXCR6 эта тенденция была статистически значимой, затрагивая как CD8, так и CD4 Tells (рис. 6j,k). В заключение, клетки CD69-CD103- в ткани почек существенно отличаются от клеток в кровотоке и могут относиться к другой популяции TBv, не отмеченной экспрессией CD69 или CD103. Единственным маркером, который постоянно отличался, независимо от фенотипа CD8/CD4, с точки зрения коэкспрессии CD69 и CD103, был CXCR6.

3.7.Т-клетки в ткани почек чаще продуцируют интерферон, чем Т-клетки в кровиНаконец, мы исследовали способность продукции цитокинов CD8/CD4-определяемыми популяциями Т-клеток в ткани почек. Во-первых, мы сравнили продукцию интерферона-γ (IFNy), фактора некроза опухоли (TNF), интерлейкина -2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и IL -17 с помощью стимулированных CD8/CD4- определял популяции Т-клеток, обнаруженные в крови, по сравнению с таковыми в здоровой ткани почек (рис. 7a-e). Интересно, что только IFNy постоянно экспрессировался большей долей Т-клеток в здоровой ткани почек по сравнению с Т-клетками в крови, независимо от фенотипа CD8/CD4 (рис. 7а). Различия также были отмечены на уровне отдельных подмножеств. В частности, TNF и GM-CSF чаще продуцировались Т-клетками CD4 в ткани почек (рис. 7b.c). Что касается полифункциональности (т.е. количества одновременно продуцируемых цитокинов), было обнаружено, что Т-клетки CD4 в ткани почек более полифункциональны, чем клетки CD4 в крови (рис. 7f).

Затем мы рассмотрели различия в способности продуцировать цитокины между стимулированными Т-клетками из здоровой ткани и ткани аллотрансплантата. Никаких различий в продукции отдельных цитокинов или в ряде одновременно продуцируемых цитокинов не было обнаружено между Т-клетками из здоровой или аллотрансплантированной ткани почки (рис. S7). Поскольку CD69 экспрессируется при стимуляции Т-клеток, мы изучали только разницу между CD103-негативными и CD103-экспрессирующими CD4 и CD8 Т-клетками (рис. 7g-). При сравнении Т-клеток CD4 и CD8, экспрессирующих CD103, с клетками, не экспрессирующими CD103, в ткани почек мы заметили, что клетки CD8 и CD4 CD103 экспрессировали больше IFNy, чем клетки CD103- (рис. 7g). Кроме того, хотя количество клеток, продуцирующих IL-1ZA, было низким среди Т-клеток CD103 плюс CD8 и CD4 в ткани почек, они постоянно обнаруживались чаще в этой популяции по сравнению с популяцией CD103-. В заключение, большее количество Т-клеток в ткани почек продуцировало IFNγ по сравнению с циркулирующими Т-клетками, независимо от фенотипа CD8/CD4. Действительно, самый высокий процент клеток, продуцирующих IFNγ, был обнаружен среди CD103-экспрессирующих CD4 и CD8 Т-клеток почечного происхождения. Кроме того, по этим параметрам Т-клетки в аллотрансплантатах почки не отличались от таковых в здоровой ткани почки.

4. Дискуссия

В текущем исследовании мы рассмотрели разнообразие подмножеств Т-клеток в зависимости от экспрессии CD8 и CD4 и маркеров тканевой резидентности CD69 и CD103 в почках человека и сравнили их с кровью. В ткани почек действительно было обнаружено значительное количество Т-клеток CD8 и CD4. Кроме того, эти Т-клетки в почках содержали значительное количество клеток CD69*CD103-. CD69 плюс CD103 плюс клетки также были обнаружены, но преимущественно среди Т-клеток CD8 и практически отсутствовали среди Т-клеток CD4. Аналогичное открытие ранее касалось TRM легких [23]. Как и ожидалось, такие популяции, экспрессирующие CD69 и CD{15}}, вместо этого практически отсутствовали в циркуляции. Поразительное различие при сравнении Т-клеток в почках с клетками в крови касается отчетливого распределения традиционных подмножеств CD45RA/CCR7/CD28/CD27-. Интересно, что экспрессия CD28 чаще не экспрессировалась, когда Т-клетки коэкспрессировали CD69 отдельно или в комбинации с CD103. Теоретически это должно сделать эти популяции менее восприимчивыми к костимулирующим сигналам CD80 и CD86. Другие отличия касались более высокой частоты экспрессии CXCR3, CXCR6 и Ki-67. Кроме того, почечные Т-клетки чаще содержали клетки, продуцирующие IFNy, и часто были полифункциональными. Действительно, в почках CD103 плюс Tpys содержали больше IFN-продуцирующих клеток, чем их CD103-негативные аналоги. Кроме того, клетки CD103T чаще продуцировали IL-17, хотя это касалось небольшой популяции.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ

Что касается более частой экспрессии CXCR3 CD8 и CD4 T-клетками почек, ранее было показано, что ось CXCR3/CXCL10 участвует в формировании популяций TpM в коже, печени и лимфоидной ткани [24-28]. Кроме того, он участвует в транспортировке к стрессированному эпителию и воспалении в общем смысле [14-17]. Учитывая высокие частоты CXCR3 среди этих Т-клеток в здоровой почечной ткани, CXCR3, по-видимому, также участвует в гомеостазе TRM в почечной ткани и может не обязательно включать для этого сигналы воспаления или опасности. Что касается CXCR6, то уже было показано, что ось CXCR6/CXCL16 необходима для транспортировки Tpst в различные отделы, такие как легкие, кожа, печень и мозг, и может относиться к универсальному механизму, необходимому для направления и сохранения TRM в и в тканях, а также в отношении TRM в ткани почек человека [18-22].

Фарбер и его коллеги тщательно охарактеризовали и сравнили популяции CD8 и CD4 TRM, находящиеся в различных типах тканей человека, полученных от донорских органов. Они описали, как популяции TRM в легких, селезенке, тонком кишечнике и различных вторичных лимфоидных тканях различаются в отношении транскриптома, а также в отношении экспрессии различных белков, включая цитокины, исследованные в текущем исследовании [29-31. Однако эти исследования не включали популяции TRM в почках человека, и данные об этом

тема скудная. Ранее мы показали, что Т-клетки CD8, нацеленные на белки полиомавируса BK VP1 и LTAG, происходящие от вируса, который имеет сильный тропизм к почечным эпителиальным клеткам, обнаруживаются в почках аллотрансплантата. Эти вирусспецифические Т-клетки экспрессировали CD69 и CD103 в большем количестве, чем их аналоги, обнаруженные в кровотоке тех же пациентов. Кроме того, эти Т-клетки обычно экспрессировали CD45RA-CD27-гранзим B-негативный фенотип[5]. Позже другие также сообщили о популяциях TRM в ткани почки человека, полученной в результате нефрэктомии трансплантата. В этой публикации авторы сообщают, что Т-клетки в этих тканях в основном касались Т-клеток CD8 [321. Вместо этого мы обнаружили, что Т-клетки CD4 фактически составляют самую большую подгруппу Т-клеток. Однако мы также обнаружили, что баланс сместился, хотя и незначительно, в сторону большего количества Т-клеток CD8 в ткани аллотрансплантата по сравнению со здоровой тканью почки. Таким образом, это несоответствие может быть объяснено другой исследовательской группой, и может случиться так, что в здоровом состоянии иммунологическая защита в большей степени сосредоточена на внеклеточных угрозах, таких как бактерии, по сравнению с более внутриклеточными угрозами, такими как вирусы и рак у иммунокомпрометированных хозяев. Мы не обнаружили других различий в изученных маркерах между здоровыми почечными и аллотрансплантированными Т-клетками. Однако дальнейшие исследования с использованием методов более широкого взгляда на транскриптомы, такие как секвенирование РНК, или протеома, такие как масс-спектрометрия, должны быть использованы, чтобы установить, действительно ли это так.

Кроме того, де Леур и соавт. описывают, как TRM в почках часто экспрессирует гранзим B, в то время как мы обнаружили только небольшое количество гранзима B как в здоровой, так и в аллотрансплантированной почечной ткани [32]. Тем не менее, мы обнаружили значительное количество Т-клеток, экспрессирующих T-bet и Eomes, в ткани почек, что в циркулирующих популяциях Т-клеток обычно действительно связано с более высокой экспрессией гранзима B [10]. Хотя последнее может не удивлять, учитывая тот факт, что экспрессия гранзима B также напрямую индуцируется T-bet [33,34], эта связь не была очевидна среди Т-клеток почек в текущем исследовании. Как мы и другие показали, что TRM, полученные из легких, головного мозга и кожи человека [25, 26, 3536], а также резидентные MAIT ælls из почек, полученные из тканей 【6,7】, имеют низкое содержание гранзима B. content, хотя часто выражает значительное количество T-bet и Eomes, это может быть общей чертой (человеческого) TkM. Более того, экспрессия гранзима B TRM в легких быстро повышалась при стимуляции [35], что указывает на то, что это может происходить и в других TeM. Здесь авторы предположили, что такая «скрытая цитотоксичность» служит для защиты структурной целостности тканей от повреждения цитотоксическими Т-клетками.

В заключение мы показываем, что Т-клетки в ткани почек присутствуют в значительном количестве и включают популяции, которые часто экспрессируют CD69 плюс и CD103 плюс, молекулы, с помощью которых Т-клетки прикрепляются к тканям и сохраняются в них. Тем не менее, CD69-CD103- Т-клетки в ткани почек, по-видимому, отличаются от циркулирующих Т-клеток и могут относиться к другой отдельной популяции TiM, возможно, сохраняющейся в почках за счет других механизмов, которые предстоит раскрыть. Другой вариант может заключаться в том, что эти CD69-CD103-T-клетки относятся к популяции, которая только недавно вышла из кровотока и только временно приобрела новые фенотипические признаки из-за взаимодействия с микроокружением почек. Для выяснения этих возможностей необходимы дальнейшие исследования этой популяции. Более того. CD8 и CD4 почечные Т-клетки часто активно циклировали и чаще экспрессировали CXCR6. Кроме того, популяции CD8 и CD4 вытесняют особенно высокую экспрессию CXCR3, сильно вовлекая эти хемокиновые рецепторы, а также CXCR6 в накопление и персистенцию TRM в почках человека. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы улучшить наше представление о популяциях Tpv в почках человека. Тем не менее, представленные здесь результаты представляют собой надежный первый шаг к более детальной характеристике популяций Т-клеток в ткани почек и их роли в здоровье и заболевании.