Изучение химических профилей и метаболитов сырой и обработанной цистанхе пустыни у крыс с помощью UPLC-Q-TOF-MSE

Почта для связиtina.xiang@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный

Фон: Китайская обработка materia medica — выдающаяся и уникальная фармацевтическая техника в традиционной китайской медицине (ТКМ), используемая для уменьшения побочных эффектов и повышения или даже изменения терапевтической эффективности необработанных трав. Изменения в основных компонентах, вызванные оптимизированной процедурой обработки, в первую очередь ответственны за повышение эффективности лекарственных растений. Бодрящий эффект Ян на почки от риса, приготовленного на пару в винеЦистанхе пустынная(C.deserticola) был сильнее, чем сырой C.deserticola (CD).

Методы: Сравнительный анализ был проведен с использованием UPLC-Q-TOF-MS с информационной платформой UNIF1 для определения влияния обработки. Исследования in vitro были проведены для характеристики компонентов, а такжеметаболитыв естественных условиях. Химические компоненты определяли в ЦД и продуктах его переработки. Многофакторный статистический анализ был проведен для оценки различий между ними, в то время как OPLS-DA использовался для попарного сравнения CO.

Полученные результаты: результаты этого исследования выявили значительные различия в фенилэтаноидных гликозидах (PhG) ииридоидыпосле обработки. Всего в экстрактах ЦД и продуктах его переработки обнаружено 97 соединений. PhG, содержащие 4-O-кофеоильную группу в 8-O- -D-глюкопиранозильной части, такие как актеозид, цистанозид C, камнеозид II, османтузид, уменьшались после обработки, в то время как PhG с 6' -О-кофеоильная группа в 8-O- -D-глюкопиранозильной части, такая как изоацетозид, изоцистанозид С, изокампнеозид I, изомартинозид, увеличилась, особенно в группе CD-NP. Интенсивность эхинакозида и цистанозида В, структура которых содержит 6'-О- -D-глюкопиранозильный фрагмент, также увеличилась. В исследовании in vivo в плазме, фекалиях и моче крыс было обнаружено 10 прототипных компонентов и 44 метаболита. Полученные результаты показали, что процессинг приводит к значительному варьированию химических составляющих ЦД и влияет на расположение соединений in vivo, а фаза Ⅱ метаболических процессов является ключевым каскадом каждого соединения, а большая часть метаболитов связана с эхинакозидом или актеозид.

Выводы: Это первое глобальное сравнительное исследование необработанных и обработанных компакт-дисков. Эти результаты дополняют наше понимание влияния обработки CD и дают важные данные для будущих исследований эффективности.

Ключевые слова: Cistanche Deserticola, Обработка, UPLC-Q-TOF-MS5, Химические профили, Метаболиты in vivo

Введение

Обработка китайской materia medica (CMM) продемонстрировала значительную применимость в клинической практике традиционной китайской медицины (TCM) и считалась жизнеспособным методом лечения на протяжении нескольких столетий. Это уникальная фармацевтическая технология, основанная на теории традиционной китайской медицины. После обработки были выявлены значительные различия во внешнем виде, химическом составе, характеристиках и медицинском значении всех типов ТКМ, что привело к предположению, что обработка может повысить эффективность или уменьшить токсическое действие ТКМ.

На протяжении сотен лет,Цистанхе пустынная(Rou Cong Rong на китайском языке, компакт-диск) обычно используется в клинической практике традиционной китайской медицины для дополнения функций почек. Это также помогает в увлажнении кишечника, что приводит к расслаблению кишечника [1].Цистанхевпервые был записан в ShenNongBencaoJing. Он обычно встречается в засушливых и полузасушливых местообитаниях в Евразии и Северной Африке, включая Иран, Китай, Индию и Монголию [2]. Обработку CD осуществляли пропариванием с рисовым вином при нормальном давлении, что является методом приготовления, описанным в китайской фармакопее (Jiucongrong на китайском языке, далее именуемым "CD-NP"). А более эффективным способом приготовления является ЦД-пропаривание рисовым вином под высоким давлением (далее - ЦД-ГП) [3, 4]. В нескольких исследованиях было выявлено, что фармакологические эффекты CD отличаются от продуктов его переработки [5]. ЦД может тонизировать Ян почек и расслабить кишечник, в то время как после пропаривания рисовым вином эффект пополнения Ян почек будет усилен. В нашем более раннем исследовании было обнаружено, что CD-NP может усиливать тонус почек и поддерживать ян, а также ослаблять эффект увлажнения кишечника и дефекации [6–8]. В клинической практике продукты переработки являются наиболее часто используемой формой.

На сегодняшний день в нескольких исследованиях проанализированы химические компоненты CD с последующим выделением и идентификацией более 100 соединений [9–11], таких как фенилэтанолгликозиды (PhG),иридоиды, лигнаны и олигосахариды в качестве его основных химических составляющих. Также сообщалось, что существует множество фармакологических активностей PhG, включая иммуномодулирующую, нейропротективную, гепатопротекторную, противовоспалительную, антиоксидантную и т. д. [12–14]. Иридоиды обладают противовоспалительной активностью [15, 16]. В более ранних исследованиях также было обнаружено, что некоторые химические компоненты изменялись в процессе обработки [17–20]. На основании этих отчетов можно предположить, что постобработка, вариации химического состава приводят к различным фармакологическим эффектам, которые необходимо дополнительно изучить.

В текущем исследовании для сравнительного анализа был применен чувствительный и эффективный метод, то есть сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), а для качественного анализа экстрактов были проведены исследования in vitro. CD, CD-NP и CD-HP для выяснения их химических профилей. Как правило, в качестве эффективных компонентов рассматривались экзогенные химические вещества с высокой экспозицией в органах-мишенях. Поэтому крысам ЦД и продукты его переработки вводили перорально соответственно с последующей их характеристикой. Существующее исследование впервые представляет сравнительное исследование (как in vitro, так и in vivo) сырого и обработанного CD. Полученные результаты расширят наши представления о влиянии обработки КД, что может быть полезно для дальнейших исследований.

материалы и методы

Материалы

Стандартные соединения аюгола (180120) и 2'-ацетилацетозида (M0601AS) были предоставлены компанией Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Чэнду, Китай). Цистанозид F (MUST -17022620), эхинакозид (D1105AS), цистанозид A (M0906AS) и изоактеозид (M0106AS) были предоставлены компанией Must (Сычуань, Китай); актеозид (O0618AS), салидрозид (J0526AS), каталпол. (S0728AS), генипозид (A0407AS) и генипозидовая кислота (MB6001-S) были приобретены у Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Далянь, Китай).8-Эпидоксилогановая кислота (B31123) была получены от Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Китай. Метанол и ацетонитрил были марки MS и были получены от Merck KGaA, Дармштадт, Германия. Метановая кислота (CH, O,) квалификации для ВЭЖХ была предоставлена ​​компанией Merck KGaA (Дармштадт, Германия). Вода, используемая в существующем исследовании, была обработана с помощью системы Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, USA). Рисовое вино было предоставлено компанией Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Чжэцзян, Китай).

Цистанх пустынный был собран у Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Образцы были идентифицированы профессором Яньцзюнем Чжаем (фармацевтическая школа Ляонинского университета традиционной китайской медицины). Образцы были отправлены в Ляонинский университет традиционной китайской медицины.

Животные

Самцы крыс Sprague-Dawley (класс SPF) с общей массой тела 180–220 г были предоставлены компанией Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Лабораторный центр животных ресурсов провинции Ляонин, номер лицензии: SCXK-2015–0001). Этих крыс содержали в помещении для размножения с хорошо поддерживаемой температурой и влажностью, т.е. 20–26 градусов, 50–70 процентов, в течение одной недели. Перед экспериментом крыс кормили обычной лабораторной пищей и водой. Животные голодали в течение ночи, однако перед экспериментом им давали воду ad libitum. Крыс Te казнили с помощью 10-процентного анестетика хлоралгидрата. Институциональный комитет по этике животных провинциальной больницы китайской медицины Ляонин одобрил все экспериментальные протоколы (2019.3.25, 2019015).

Приготовление экстракта ЦД, ЦД-НП и ЦД-ГП

CD-NP, CD-HP были получены из одной и той же партии Cistanch Deserticola. Для приготовления CD-NP сухие кусочки CD (толщиной 5 мм, 100 г) увлажняли рисовым вином (30 мл) и пропаривали при 100°С в течение 16 ч с последующей сушкой при 55°С в сушильном шкафу. В то время как CD-HP получали путем пропитки сухих кусочков CD (толщиной 5 мм, 100 г) рисовым вином (30 мл) с последующей обработкой паром при 1,25 атмосферного давления в течение 4 часов. а затем сушат в сушильном шкафу при 55 град.

В мерную колбу на 100 мл один грамм порошка просеивали через сито № 4, затем добавляли 50% метанола (50 мл), затем плотно закрывали и перемешивали. Эту смесь взвешивали, после чего выдерживали полчаса. мацерация. После мацерации смесь обрабатывали ультразвуком (мощность 250 Вт, частота 35 кГц) в течение 40 мин с последующим охлаждением и повторным взвешиванием. Потеря массы восполнялась 50-процентным метанолом, надлежащим образом перемешивалась и оставлялась стоять, затем отфильтровывался супернатант и затем использовался полученный фильтрат в качестве испытуемого раствора.

Анализ MSE активных компонентов

Приготовление стандартных веществ: тубулозид-А (3,02 мг), эхинакозид (3,00 мг), 2'-ацетилактеозид (2,34 мг), актеозид (2,45 мг), изоактеозид (0,61 мг). мг), цистанозид-F (2,14 мг), салидрозид (3,39 мг), генипозид (2,84 мг), айюгол (1,58 мг), каталпол (2,39 мг), генипозидовая кислота (2,56 мг) и 8-эпидеоксилогановая кислота. кислоты (2,34 мг) добавляли в мерную колбу на 10 мл, добавляли постоянный объем метанола по шкале, превращали в эталонный раствор соответствующей концентрации. Каждый из 100 мкл был преобразован в смешанный эталонный раствор.

Условия анализа МС: значение массы Te было скорректировано перед экспериментом, и использовался режим отрицательных ионов. Диапазон масс составлял 50–1200 Да, а образец вводился через проточный нагнетательный насос. Скорость конуса составляла 100 л/ч, скорость потока растворителя устанавливали на уровне 800 л/ч. Капиллярное и конусное напряжения фиксировались на уровне 2500 и 40 В соответственно. Температура источника ионов и газа-растворителя составляла 100° и 400° соответственно, а частота регистрации сигнала составляла 0,5 S-1.

UPLC-Q-TOF-MS анализ экстракта CD (15–16 мин), от 65 до 55 процентов А (16–18 мин). Скорость потока составляла 0,3 мл мин-1, а температура в помещении автоматического пробоотборника и в колонке составляла 30 градусов и 8 градусов по отдельности. Объем инъекции составлял 1,0 мкл.

Масс-спектрометрическую оценку проводили с помощью Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США), включающего источник ESI. Скорость потока газообразного азота была установлена ​​на уровне 800 л·ч-1 при температуре 400 градусов, температура источника была зафиксирована на уровне 100 градусов, а конусный газ был установлен на уровне 50 л·ч-1. Напряжение конуса и капилляра устанавливали на уровне 40 и 2000 В соответственно. Энергия столкновения рампы использовалась в диапазоне 20–30 В. Центроидальные данные всех образцов были получены от 50 до 1200 Да, время сканирования 5- 0,5 с при времени анализа 10 мин. . LockSpray TM использовался для проверки точности массы. В качестве фиксирующей массы использовали ион Te[M–H]– лейцинэнкефалина (200 пг·мкл–1, скорость инфузии 10 мкл·мин–1) с m/z 554,2615. Программное обеспечение MassLynx V4.1 (Waters Co., Милфорд, США) использовалось для точной массы, состава ионов-предшественников и расчета фрагментных ионов.

Анализ данных на платформе Masslynx

Кроме того, на основе литературы была создана внутренняя библиотека, включающая название соединения, его структуру и молекулярную формулу (в мол.). Все соединения были отмечены в специальном шаблоне, выполненном в программе Excel. Кроме того, файлы mol (Cemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, США) и файлы Excel всех структур отдельных соединений также были сохранены на локальном ПК. Установленный лист Excel с важными данными был напрямую импортирован в научную библиотеку UNIFI.

UNIFI 1.8.2, Уотерс, Манчестер, Великобритания, использовали для оценки структурных характеристик, особенно характерных фрагментов и фрагментации МС. Минимальная площадь пика 500 была установлена ​​для двухмерного обнаружения пика. При выявлении 3D-пиков выбирали низкую интенсивность энергетического пика более 300 отсчетов и повышенную интенсивность энергетического пика более 80 отсчетов. Было найдено, что погрешность массы составляет до ±10 ppm для известных соединений, а допуск на время удерживания был установлен в диапазоне ±0,1 мин. Мы выбрали отрицательные аддукты, содержащие -H плюс HCOOH. Обработка необработанных данных, полученных с помощью МС, проводилась с помощью модернизированного программного обеспечения UNIFI для быстрого определения химических компонентов, соответствующих стандартам, с помощью самостоятельно созданной базы данных и внутренней библиотеки традиционной медицины.

Затем, чтобы проверить химическую структуру каждого целевого соединения, изомеры различали по их характерным картинам фрагментации МС, которые были выявлены в опубликованных исследованиях, а также путем сравнения времени удерживания эталонных стандартов.

Метаболический анализ на основе многомерного статистического анализа

Перед обработкой исходных данных были установлены такие параметры, как масса от 150 до 1200 Да, диапазон времени удерживания (от 0 до 20 мин), пороговая интенсивность ( 2000 отсчетов), толерантность по массе, т.е. 5 МДА, в то время как окно массы и времени удерживания составляло 0,20 мин и 0,05 Да соответственно. В последующем списке базы данных идентификатором ионов были пары RT-m/ по времени их элюирования. Одни и те же значения ВУ и m/z в разных партиях образцов считались одним и тем же соединением.

Был проведен многомерный статистический анализ для оценки эффективных биомаркеров, которые в значительной степени способствовали различиям между различными группами. Во время анализа использовался анализ основных компонентов (PCA), чтобы указать максимальные различия и распознать закономерности для получения обзора и классификации. OPLS-DA — это инструмент моделирования, который обеспечивает визуализацию загрузки прогнозирующего компонента OPLS-DA для помощи в оценке модели. Переменная важность для прогноза (VIP) использовалась для оценки оценки различных компонентов, аметаболитыwith VIP values>1.0 и P-значение<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Эксперименты на животных крысы были случайным образом разделены на четыре группы (n=6 для каждой группы) с последующим пероральным введением различных экстрактов: (1) контрольная группа: крысам давали физиологический раствор (2 мл/100 г). ; (2) группа CD: крысам давали экстракт CD (2 мл/100 г); (3) группа CD-NP: крысам давали экстракт CD-NP (2 мл/100 г); (4) Группа CD-HP: крысам давали экстракт CD-HP (2 мл/100 г). Дальнейшая категоризация всех групп была проведена на три подгруппы по плазме, моче и фекалиям соответственно. Через два часа каждой крысе перорально вводили одинаковое и равное количество экстрактов.

После введения забор образцов крови проводили через 1,0 ч, 2,0 ч и 4,0 ч в гепаринизированные полиэтиленовые пробирки объемом 1,5 мл (из глазничных вен). , с последующим центрифугированием (при 4500 об/мин) всех образцов в течение 15 мин.

Для получения образцов мочи и кала крыс содержали в метаболических клетках, а затем проводили сбор образцов мочи и кала в течение 24 ч после введения. Образцы мочи центрифугировали при 45{3}}0 об/мин в течение 15 мин, фекалии подсушивали в тени, растирали в порошок, затем отбирали 0,2 г и добавляли в 0,5 мл физиологического раствора. раствор, ультразвук в течение 5 мин и центрифугирование при 12 000 об/мин в течение 15 мин. Все биообразцы до проведения анализа хранились при температуре -80 градусов.

Подготовка биологических образцов. Добавление образцов плазмы, мочи и кала осуществляли с 3 объемами метанола с последующим встряхиванием в течение 3 мин. Далее проводили центрифугирование (при 12,{3}} об/мин) смесей в течение 10 мин с последующим переносом надосадочной жидкости в пробирку ФП, после чего сушили азотом при 37°С. Кроме того, добавляли 200 мкл раствора HCN-H2O (50 процентов). В-десятых, вортекс использовали для перемешивания (1 мин) с последующим центрифугированием (при 12, 000 об/мин) в течение 5 мин. Супернатант (5 мкл) обработанных образцов вводили в систему UPLC-Q-TOF-MSE.

Условия жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии Анализ наметаболитытакже выполняли с помощью прибора Waters UPLC через интерфейс ESI. Разделение проводили на колонке Acquity UPLC HSS T3 (100 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм), подвижная фаза – 0,1% муравьиная кислота (А): ацетонитрил (Б), Условия градиентного элюирования: 0-3 мин (99,8% → 98% А). 3-5 мин (98% → 95% А), 5-8 мин (95% → 90% А), { {18}} мин (90 % → 85 % A), 12-17 мин (85 % → 70 % A), 17-22 мин (70 % → 60 % A), 22-23 мин (60 процентов → 58 процентов A), 23-25 мин. (58 процентов A), 25-32 мин. (58 процентов → 45 процентов A) и 32-37 мин. (45 процентов → 35 процентов A). ),0,4 мл мин-1 - скорость потока. Температура для колонки и помещения для образцов была установлена ​​на 40 и 8 градусов соответственно. Использовали указанные выше условия масс-спектрометрии.

Для обработки данных использовалась стратегия систематического анализа метаболитов в биопробах. Программное обеспечение UNIFI (1.8.2). Функция Binary Compare использовалась для идентификации эффективных метаболитов. Оцениваемые метаболиты отсутствовали в эквивалентном контрольном образце или присутствовали при низкой интенсивности ионов. Порог относительной интенсивности был установлен на уровне 3 или 5, и можно было оценить метаболиты, соответствующие подчеркнутым критериям. Затем с помощью EIC определяли общие и предсказуемые метаболиты. Для поиска двухфазных метаболитов использовали функцию NLF. Например, в программе UNIFI параметры могут быть установлены на 176,0321 для поиска возможных конъюгатов глюкуроновой кислоты. Постобработка, нейтральная потеря может быть установлена ​​в методе или идентифицирована. MassFragment использовался для определения или характеристики обнаруженных структур метаболитов, функция спектральной интерпретации UNIFI является основной функцией, используемой для анализа вторичной фрагментации исходных компонентов. Эту функцию можно использовать для быстрой проверки правильности пути фрагментации.

Полученные результаты

Правило массовой фрагментации фенилэтаноидных гликозидов и иридоидов

Фенилэтаноидные гликозиды являются основными химическими составляющими CD. Стандартные растворы изоактеозида,

были взяты цистанозид F, тубулозид A, эхинакозид, актеозид и 2'-ацетилактеозид с последующим обеспечением разного уровня энергий столкновения (табл. 1), после чего были получены соответствующие карты MS2 (рис. 1).

Масс-спектрометрический анализ показал, что фенилэтаноидные гликозиды имеют сходные модели фрагментации масс-спектра, пути расщепления в режиме отрицательных ионов в основном включают (1) расщепление сложноэфирной связи: потеря нейтральной кофеильной группы (C, H, O162.03) и нейтральной ацетильной группы. группа (C, H, O, 42. 00); (2) гликозидное расщепление: потеря нейтральных остатков рамнозы (C.HIO, 146,05) и нейтрального остатка глюкозы (CgHO, 162,05). С помощью масс-спектрометрии высокого разрешения можно различить кофеил (162,03) и остаток глюкозы (162,05).

Были взяты стандартные растворы иридоидов аюгол, каталпол, генипозидовая кислота, генипозид и 8-эпид оксилогановой кислоты с последующим обеспечением различных энергий столкновения, и были получены соответствующие карты МС (рис. 2).

Иридоидные гликозиды имеют сходные модели фрагментации масс-спектра, пути расщепления в режиме отрицательных ионов в основном включают (1) гликозидное расщепление: потеря нейтрального остатка глюкозы (CHoO, 162,05); (2) потеря нейтрального CO, (43,99) и H , О(18.01).

Идентификация соединений в экстрактах CD, CD-NP и CD-HP

UPLC-QTOF-MSE анализ

Проведена оптимизация условий хроматографии. Затем соединения CistancheHerba были оценены в режимах как отрицательных, так и положительных ионов с высокими и низкими CE. Полученные результаты показали, что совместимость негативной моды выше по сравнению с положительной модой для этих соединений. На рис. 3 показана хроматограмма основного пика масс-спектрометра (BPI) с пронумерованными пиками. Интенсивность каждого обнаруженного иона в анализе UPLC-Q-TOF-MS была нормализована по отношению ко всему количеству ионов для создания матрицы данных, которая включала значение m/z, нормализованную площадь пика и время удерживания.

Оценка компонентов из CD и продуктов его переработки на платформе UNIFl

Всего методом -SEM (n=6) было идентифицировано 97 соединений из CD и продукта его переработки (таблица 2), включая фенилэтаноидные гликозиды (PhG), иридоиды, лигнаны и олигосахариды. Компоненты 95, 91 и 94 были обнаружены в CD, CD-NP и CD-HP соответственно. Среди них было определено 64 фенилэтаноидов, 13 иридоидов и 20 других видов соединений. Было обнаружено сходство химического состава ЦД и продукта его переработки, однако было обнаружено, что количество компонентов различается между ЦД и продуктом его переработки.

Вариации химических компонентов продуктов переработки Для анализа матрицы многомерных данных использовалось программное обеспечение Simca-P 13.0. До PCA все переменные были центрированы по среднему и масштабированы по Парето с последующей идентификацией потенциальных дискриминантных переменных. На графике оценки PCA каждая точка показывала отдельный образец. Образцы, которые демонстрировали сходство в своих химических компонентах, были разбросаны рядом друг с другом, а те, которые показали различия в их компонентах, были разделены. Как видно на PCA (фиг.4), группа CD-HP была отделена от групп CD и CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 и П<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Из рис. 8 мы нашли интенсивность актеозида (54), цистанозида С (74), кампнеозида I (43), османтусида (75) и 2'-актилактеозида (80), имеющего 4'-O-кофеоильную группу. 8-O- -D-глюкопиранозильная часть (см. рис. 9) уменьшилась после обработки рисовым вином, в то время как интенсивность изоацетозида (60) составляет кастанозид (71), изо-кампнеозид I (69), изомартинозид (86), содержащий 6'-O-кофеоильную группу (см. рис. 9), увеличился, особенно для группы CD-NP. Хотя тубулозид B (72) имеет 6'-O-кофеоильную группу, как и изоактеозид, интенсивность снижается из-за его 2'-ацетильной группы. Интенсивность эхинакозида (38) и цистанозида В, имеющих 6'-O- -D-глюкопиранозильные группы, увеличилась, но интенсивность тубулозида А (55) снизилась также из-за его 2'-ацетильной группы.

Наша исследовательская группа также изучила термическую стабильность актеозида и изоактеозида и обнаружила, что актеозид нестабилен в воде, метаноле и растворе желтого рисового вина и может частично превращаться в изоактеозид в условиях нагревания. Но термостабильность изоактеозида была лучше, особенно в растворе желтого рисового вина. На рис. 10 показаны возможные изменения ФГ в КД в процессе обработки:

Идентификация метаболитов у крыс. По данным масс-спектрометрии высокого разрешения были проанализированы и сопоставлены точная молекулярная масса и элементный состав метаболитов и протомолекулярных соединений. Поскольку одни и те же типы соединений в ТКМ показали сходство в метаболических модификациях, корреляции фитохимических составляющих in vitro могут распространяться на их метаболиты in vivo. Между тем, исходя из обычных путей биотрансформации, было сделано предположение о разумном изменении молекулярной массы. Наконец, метаболиты были идентифицированы путем анализа масс-спектров MSE метаболитов и путей фрагментации протосоединений в масс-спектре [21, 22]. По сравнению с холостым образцом его компоненты идентифицировали in vivo на основании информации хроматограммы-масс-спектра, возможности метаболической реакции, особенностей структуры соединения и правила фрагментации его масс-спектра. См. Таблицу 3.

Идентификация метаболитов, родственных гликозидам фенилэтанола

Для обработки использовалась платформа UNIFI. На рисунке 11 показан хроматограф TIC мочи, кала и плазмы для CD и продуктов его переработки. По сравнению с контрольными пробами у крыс было идентифицировано всего 54 метаболита, в том числе 10 компонентов-прототипов и 44 метаболита, из которых 24, 49 и 6 находились в фекалиях, моче и плазме соответственно.

На основании точной массы, каскада фрагментации и предсказуемых нейтральных потерь при биотрансформации было предварительно оценено в общей сложности 35 метаболитов, связанных с фенилэтаноидными гликозидами. Родственные метаболиты фенилэтаноидных гликозидов имеют сходные модели фрагментации масс-спектра, такие как типичный декофеоильный фрагмент m/z 461,1605, затем дополнительно гидролизуются гликозидными и сложноэфирными связями in vivo и метаболизируются в гидрокситирозол (HT)(m/ z153,0504, C.HO.4,73 мин) и кофейная кислота (CA) (m/z179,0389, CH, O0,77 мин), см. фиг.12A.

M11 обозначал [MH]~ при m/ 153,0504 с формулой т.е., C·HO и идентифицировал как HT. M16 продемонстрировал [MH]- с m/z 329,0851, что на 176 Да выше, чем у HT, показывая, что это может быть глюкуронидированный метаболит HT. Значение [MH]-M26 было на m/z 343,1037,14 Да выше, чем у HT-глюкуронида. Поэтому M26 был идентифицирован как HT-метилированный глюкуронид. M17 был идентифицирован как HT-сульфат на основании его [MH]- при m/z 233,0112,80 Да по сравнению с HT, который мог быть дополнительно метилирован, а затем продуцировал M22, который показал m/z 247,0278, что указывает на то, что это HT- метилированный сульфатированный метаболит. М7 (m/167,0335) и М5 (m/z 167,0762) рассматривали как продукты окисления и метилированного ГТ соответственно (фиг.12В).

M1 показал [MH]- при m / z 179,0389, уточненная молекулярная формула была CH-O и идентифицирована как кофейная кислота (CA). M25 показал [MH]- при m / 355,0704, которые были на 176 Да выше, чем у CA, показывает что это может быть глюкуронидированный метаболит СА. M27 имел m/z 258,994, что на 80 Да выше, чем у СА, поэтому мы определили его как сульфат СА, и он мог давать M35 (m/z 273,0064). Поскольку M4 дает [MH]7 с m/z 193,0524,14 Да выше, чем CA, он был идентифицирован как метилированный метаболит CA. M39 был метаболитом дегидроксилирования CA с m/z 163,04, и он мог быть сульфатирован в M32 (m/z 242,9951).

M33 (m/z 181,0491, C·HO, 9,06 мин) был продуктом восстановления СА, то есть 3,4-дигидроксибензолпропионовой кислоты, которая могла быть метилирована в M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 мин). M33 может быть дегидратирован в M43, то есть 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 мин), M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 мин) и M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 мин) представляли собой продукты глюкуронирования и сульфатирования (фиг. 12С).

Для метаболитов, связанных с фенилэтаноидными гликозидами, ключевыми метаболическими каскадами были метаболические реакции фазы II, т.е. глюкуронирование, метилирование и сульфатирование. Предлагаемые метаболические каскады фенилэтаноидов изображены на рис. 13.

Идентификация метаболитов, связанных с иридоидами

Путем анализа элементного состава метаболитов, фрагментации MSE и соответствующей литературы было предварительно оценено в общей сложности 19 метаболитов, связанных с иридоидами. Иридоидные гликозиды гидролизуются гликозидными связями с образованием соответствующих им агликонов. Значение m/z 185,117 было для М8, что на 162 Да меньше, чем у аюгола, что было получено за счет потери остатка глюкозы.

М40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 мин) представляет собой дегликозилированный продукт каталпола. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 мин) был менее чем на 30 Да меньше, чем у дегликозилированного метаболита каталпола, и был идентифицирован как удаление молекулы метаболита CH, O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 мин) представляла собой дальнейшую потерю метаболита H, O.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 мин) представлял собой дегликозилированный метаболит генипозида, а M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 мин) представлял собой дегликозилирование 8-эпидеоксилогановой кислоты. Метаболические реакции для иридоидов можно выявить как фазу I метаболизма дегликозилирования (фиг. 12D).

Сравнение метаболических профилей в плазме, моче и кале между CD и продуктами его переработки

Сравнивали 2 прототипа в плазме, 7 в моче и 3 в фекалиях. Было 7 прототипов, поглощенных CD, 7 прототипов, поглощенных CD-NP, и 8 прототипов, поглощенных CD-HP. M21 был обнаружен только в фекалиях группы CD-NP, а M38 и M51 были обнаружены только в группах мочи CD-HP. По сравнению с метаболитами идентичных метаболитов в плазме, моче и фекалиях было 4, 42 и 21 соответственно. В группе CD было абсорбировано 34 метаболита, в группе CD-NP — 39, а в группе CD-HP — 40. M5, M7, M40 и M52 были обнаружены только в группах CD-NP, тогда как M24, M41 и M48 были обнаружены только в группах CD-HP.

Наблюдались изменения в абсорбции, а также в метаболизме активных соединений в различных продуктах переработки ЦД. Из рис. 14 мы обнаружили, что интенсивность конъюгации HT-сульфата (M17) была самой высокой в ​​моче, за ней следовала конъюгация 3-HPP сульфата (M29), конъюгация метилированного HT-сульфата (M22), дегидроксилированного сульфата CA конъюгация (M32) и конъюгация сульфата 3,4-дигидроксибензолпропионовой кислоты (M19). Содержание продуктов метаболизма в обработанной группе было выше, чем в группе ЦД, особенно М22, М29, М27, М16, М19, М1, М2. Их предшественник 6'-O-кофеоильная группа в 8-O- -D-глюкопиранозильной части, соединения, такие как гидрокситирозол, обладают противоопухолевыми, противовоспалительными, антибактериальными, противовирусными и противогрибковыми свойствами. 23]. Кофеиновая кислота обладает противовоспалительной, противораковой и противовирусной активностью [24]. Это соответствовало клиническому использованию компакт-диска и продуктов его переработки.

Обсуждение

ЦД представляет собой ТКМ, и его основные биологически активные компоненты, включая PhG, иридоиды, полисахариды, были подтверждены различными исследованиями. В клинической практике ТКМ продукты переработки ЦД получили широкое распространение по сравнению с сырыми. Химический состав будет изменен во время обработки, что может привести к изменению лечебных эффектов (рис. 14).

PhG представляют собой тип фенольных соединений, характеризующихся структурой -глюкопиранозида, несущей гидроксифенилэтильный фрагмент в качестве агликона. Эти соединения часто содержат кофейную кислоту и рамнозу, присоединенные к остатку глюкозы через сложноэфирные или гликозидные связи соответственно. В текущем исследовании качественный анализ CD, CD-NP. и CD-HP, всего идентифицировано 97 соединений, в том числе фенилэтаноидные гликозиды (ФГ), иридоиды и др. Полученные результаты показали вариации химического состава до и после обработки. Интенсивность ФГ, содержащих 4'-О-кофеоильную группу в 8-О- -D-глюкопиранозильной части, таких как актеозид, цистанозид С, камнеозид II, османтус-сайд, снижалась после обработки, в то время как ФГ с

таких как изоацетозид, изоцистанозид, изокампнеозид I, изомартинозид увеличился, особенно в группе CD-NP. Интенсивность эхинакозида и цистанозида В, структура которых содержит 6'-О- -D-глюкопиранозильный фрагмент, также увеличилась. PhG, имеющие 2'-ацетильную группу, часто уменьшались из-за реакции гидролиза в процессе, как тубулозид B, 2-ацетилактеозид.

Исследование метаболитов, абсорбированных in vivo, проводилось после перорального приема ЦД и продуктов его переработки. Метаболические процессы фазы II были ключевыми каскадами, и большинство метаболитов представляли собой сульфаты, глюкурониды и метилированные конъюгаты. Гликозиды фенилэтанола имеют низкую пероральную абсорбцию и утилизацию. Они с трудом всасываются в кровь и действуют как предшественники, чтобы играть свои роли после метаболической активации in vivo. Фенилэтаноиды, продуцируемые в фенилэтанолагликон, такие как гидрокситирозол (HT) и кофейная кислота (CA) и ее производное 3-гидроксифенилпропионовая кислота (3-HPP), эти метаболиты могут легче всасываться в плазму и иметь лучший лечебный эффект.

CD и продукты его переработки. Конъюгация HT-сульфата (M17) имеет наибольшую интенсивность в моче, за ней следуют конъюгация 3-HPP сульфата (M29), конъюгация метилированного HT-сульфата (M22), дегидроксилированная конъюгация сульфата CA (M32) и 3,{{ 7}} конъюгация сульфата дигидроксибензолпропионовой кислоты (M19). Содержание продуктов метаболизма в обработанной группе было выше, чем в группе ЦД, особенно М22, М29, М27, М16, М19, М1, М2.

Как правило, эффективными могут быть компоненты, имеющие высокое воздействие на органы-мишени. Достаточное количество фенилэтаноидов и их производных было оценено и определено in vitro. Характерным соединением является актеозид, содержание которого уменьшилось после обработки рисовым вином, а содержание изоактеозида, изоцистанозида С, изокамнеозида I соответственно увеличилось. Продукты деградации PhG, такие как производные CA и HT, могут быть оценены в биообразцах, а обработка рисового вина может улучшить поглощение метаболитов in vivo.

Вывод

В этом исследовании в экстрактах ЦД и продуктах его переработки было обнаружено 97 соединений. Расщепление некоторых гликозидов происходило при повышенной температуре, в результате чего были синтезированы новые изомеры и комплексы. В исследовании in vivo компоненты-прототипы (10) и метаболиты (44) определяли или предварительно оценивали в плазме, фекалиях и моче крыс. Метаболические процессы фазы II были ключевыми каскадами, большая часть метаболитов была связана с эхинакозидом или актеозидом, как HT, CA и их производные 3-гидроксифенилпропионовая кислота 3-HPP. Эти метаболиты могут легче всасываться в плазму и оказывать лучший лечебный эффект. Полученные результаты показали, что химический состав ЦД различен и влияет на расположение соединения in vitro и in vivo.

Сокращения

PhG: фенилэтаноидные гликозиды; CD: Цистанхе пустынная; CMM: Китайская Материа Медика; ТКМ: традиционная китайская медицина; CD-NP: Gistanche Deserticola. Обрабатывается пропариванием с рисовым вином при нормальном давлении; CD-HP: Cistanche Deserticola. Обрабатывается паром с рисовым вином под высоким давлением; UPLC-Q-TOF-MS: высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с TOF-MS; PCA: анализ главных компонентов; VIP: Переменное значение для прогноза; CA: Кофейная кислота; НА: гидрокситирозол.

Благодарности

Непригодный.

Вклад авторов

LZ, LBN, SJ участвовали в составлении, написании рукописи. RJ, LPP оказала помощь в проведении экспериментов на животных, а также разработала и доработала все рисунки и таблицы. ЗК, HY. ITZ оказал помощь в разработке и проведении этого исследования и рассмотрел рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант №: 81874345) и Фондом естественных наук провинции Ляонин (грант №: 2020-MS-223).

Наличие данных и материалов

Наборы данных, использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Декларации

Этическое одобрение и согласие на участие

Этическое разрешение на использование экспериментальных животных в этом исследовании было получено от Комитета по медицинской этике Ляонинского университета традиционной китайской медицины (номер разрешения: 2018YS(DW)-044-01). Все экспериментальные процедуры в этом исследовании проводились в соответствии с этическими стандартами Комитет по медицинской этике Ляонинского университета традиционной китайской медицины.

Согласие на публикацию

Непригодный.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов, о котором следует сообщать.

Сведения об авторе

«Фармацевтический факультет, Ляонинский университет традиционной китайской медицины, Далянь, Ляонин, Китай». Научно-исследовательский институт лекарственных средств Monos Group, Улан-Батор, 14250, Монголия.

Получено: 31 мая 2021 г. Принято: 17 сентября 2021 г. Опубликовано в Интернете: 28 сентября 2021 г.

Чжэ Ли1, Лхаасурэн Рьенчиндорж2, Бонан Лю1, Цзи Ши1*, Чао Чжан1, Юэ Хуа1, Пэнпэн Лю1, Гуошун Шань1 и Тяньчжу Цзя1

использованная литература

1. Китайская фармакопея. Фармакопея Китайской Народной Республики, том. I. Пекин: China Medical Science Press; 2020. с. 140.
2. Ли З., Линь Х., Гу Л., Гао Дж., Цзэн С.М. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): один из лучших фармацевтических даров традиционной китайской медицины. Фронт Фармакол. 2016;7:41.
3. Лю Б.Н., Ши Дж., Чжан С., Ли З., Хуа И., Лю П.П., Цзя Т.З. Влияние различных методов сушки свежей цистанхе пустынной на содержание ее компонентов. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Оптимизация процесса пропаривания под высоким давлением для Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Влияние травы Cistanches до и после обработки на омолаживающую функцию и иммунную функцию стареющих крыс, вызванных D-галактозой. Чин Арч Трад Чин Мед, 2017; 11:2882–2885.
6. Гао Ю.Дж., Цзян И., Дай Ф., Хан З.Л., Лю Х.И., Бао З., Чжан Т.М., Ту П.Ф. Исследование слабительных компонентов Cistanche Deserticola YMCA. Современный Чин Мед. 2015;17(4):307–10.
7. Лю Б.Н., Ши Дж., Ли З., Чжан С., Лю П., Яо В., Цзя Т. Исследование нейроэндокринно-иммунной функции цистанхе пустынной и продуктов пропаривания рисового вина на крысиной модели, индуцированной глюкокортикоидами. Комплемент на основе Evid Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Усиление стимулирующей функции почек в мышиной модели с помощью травы Cistanches, быстро высушенной при средне-высокой температуре. Джей Мед Фуд. 2019;22(12):1246–53.
9. Ван Т., Чжан С., Се В. Cistanche Deserticola YC Ma, «Пустынный женьшень»: обзор. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: обзор химических, фармакологических и фармакокинетических свойств. J Этнофармако кол. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): обзор фитохимии и фармакологии. Хим Фарм Бык. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Нейропротекторные эффекты эхинакозида в мышиной модели MPTP болезни Паркинсона. Евр Дж Фармакол. 2007; 564: 66–74.

13. Дэн М., Чжао Дж.И., Цзюй С.Д., Ту П.Ф., Цзян Й., Ли З.Б. Защитный эффект тубулозида В на апоптоз, индуцированный ФНО-альфа, в нейрональных клетках. Акта Фармакол Син. 2004;25(10):1276–84.
14. Нан З.Д., Чжао М.Б., Цзэн К.В., Тянь С.Х., Ван В.Н., Цзян И., Ту П.Ф. Противовоспалительные иридоиды из стеблей Cistanche Deserticola, выращенных в пустыне Тарим. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Нан З.Д., Цзэн К.В., Ши С.П., Чжао М.Б., Цзян И., Ту П.Ф. Фенилэтаноидные гликозиды с противовоспалительной активностью из стеблей Cistanche Deserticola, выращенных в пустыне Тарим. Фитотерапия. 2013; 89: 167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Иридоидные и ациклические монотерпеновые гликозиды, канканозиды L, M, N, O и P из Cistanche tubulosa. Хим Фарм Бык. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Новая стратегия быстрого изучения потенциальных химических маркеров для различения сырого и обработанного Radix Rehmanniae с помощью UHPLC-TOF-MS с многомерным статистическим анализом. Джей Фарм Биомед Анал. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Изменения уровней фенилэтаноидных гликозидов, антиоксидантной активности и других показателей качества в ломтиках Cistanche Deserticola при обработке паром. Хим Фарм Бык. 2016;64:1024–30.
19. Ма З.Г., Тан Ю.С. Содержание шести фенилэтаноидных гликозидов изменяется при пропаривании вина в цистанхе Desertliving. Chin Trad Patent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Пэн Ф., Сюй Р., Ван С., Сюй С., Лю Т., Чен Дж. Влияние процесса пропаривания на качество послеуборочной цистанхе пустынной для использования в медицинских целях во время сушки на солнце. Биол Фарм Бык. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Метаболиты пищевого актеозида: профили, выделение, идентификация и гепатопротекторные свойства. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Систематическая характеристика метаболитов эхинакозида и актеозида из Cistanche tubulosa в плазме, желчи, моче и фекалиях крыс на основе UPLC-ESI-Q-TOF -РС. Биомед Хроматогр. 2016;30(9):1406–15.
23. Бертелли М., Киани А.К., Паолаччи С., Манара Э., Курти Д., Дхули К., Бушати В., Миртус Дж., Пангалло Д., Багливо М., Беккари Т., Мишелини С. Гидрокситирозол: природное соединение с многообещающей фармакологической активностью. Дж Биотехнолог. 2020; 309: 29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Кафеиновая кислота, универсальный фармакофор: обзор. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.