Абстрактный

Введение: Прополис представляет собой смолистое натуральное вещество, собираемое пчелами из почек и выделений различных деревьев и растений; общепризнано, что состав прополиса зависит от фитогеографических особенностей места сбора.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и может улавливать активные формы кислорода, предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение анионов свободных радикалов тимина.

Нажмите на добавку Cistanche Tubulosa.

【Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Цели: Это исследование было направлено на определение фитохимического состава спиртовых экстрактов из восьми партий прополиса, собранных в разных регионах Бенина (север, центр и юг) и Конго, Африка.

Материал и методы:Характеристика образцов прополиса была выполнена с использованием различных хроматографических методов с дефисом в сочетании с дерепликацией углеродного -13 ядерного магнитного резонанса (13C ЯМР) с программным обеспечением MixONat. Затем их антиоксидантную активность или активность против конечных продуктов гликирования (анти-AGE) оценивали с использованием анализов дифенилпикрилгидразила и бычьего сывороточного альбумина соответственно.

Полученные результаты: Хроматографический анализ в сочетании с дерепликацией ЯМР 13С показал, что в двух образцах из центра Бенина помимо огромного количества пентациклических тритерпенов обнаружены метоксилированные стильбеноиды или фенантрены, ответственные за антиоксидантную активность экстракта первого образца. Среди них комбретастатин может быть цитотоксическим. Во-вторых, пренилированные флаваноны, известные в прополисе макарангового типа, были ответственны за их значительную активность против AGE. Образец из Конго состоял из множества тритерпеновых производных, принадлежащих видам Mangifera indica.

Заключение: Таким образом, прополис из центра Бенина представляет особый интерес из-за его антиоксидантных и антивозрастных свойств. Тем не менее, поскольку стандартизация прополиса затруднена в тропических зонах из-за его большого химического разнообразия, требуется систематический фитохимический анализ, прежде чем продвигать использование прополиса в продуктах питания и товарах для здоровья в Африке.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Дерепликация ЯМР 13С, метоксилированные стильбеноиды или фенантрены, пентациклические тритерпены, пренилированные флаваноны, прополис

1. ВВЕДЕНИЕ

Прополис – природное смолистое вещество, собираемое пчелами с почек и выделений различных деревьев и растений, смешанное с пчелиным воском и ферментами слюны.1 Используется пчелами для защиты летка от незваных гостей, затыкания отверстий, сглаживания внутренних стенок, мумификации мертвых животных. (мелких насекомых) внутри улья, а также сбалансировать экстремальную влажность или засуху.2,3 Прополис широко использовался в народной медицине с древних времен из-за его широкого спектра терапевтических свойств.4 Прополис обычно состоит из смолы (50 процентов) , воск (30 процентов), масла (10 процентов), пыльца (5 процентов) и дополнительные фенольные соединения, такие как флавоноиды. Известно, что химический состав прополиса сложен и варьируется в зависимости от видов растений, растущих вокруг улья. , из которого пчелы собирают экссудаты.7 Принято считать, что несколько факторов, таких как флористический состав местности, место и время сбора, время года, тип коллектора, наличие и высота над уровнем моря, а также пищевая активность развивались во время использование прополиса влияет на химический состав прополиса.8,9 Существуют различные типы прополиса, в зависимости от географического района производства, ботанического источника и химического состава. Наиболее распространены прополис умеренного, березового, тропического, средиземноморского и тихоокеанского видов. Salicaceae) и поэтому богат флавоноидами, фенольными кислотами и их эфирами; однако тропический прополис, происходящий из регионов, где не растут ни тополь, ни береза, богат пренилированными производными п-кумаровой кислоты, бензофенонами или терпеноидами. , Японии и Соломоновых островах, а березовый прополис встречается именно в России.12 Изучение прополиса из тропической Азии привело к открытию Macaranga denarius L. и Mangifera indica L. как растительных источников индонезийского прополиса.13 На с другой стороны, хвойные виды семейства Cupressaceae являются основным ботаническим источником прополиса в средиземноморских регионах.14 Химический анализ показал, что прополис содержит более 300 различных природных продуктов (НП), включая производные фенольной кислоты, кумарины, флавоноиды, сесквитерпены, дитерпены, тритерпены, стероиды, лигнаны или пренилированные бензофеноны.15 Биологические эффекты прополиса были описаны в основном не только в отношении их антиоксиданта,16–18 анти-AGE (т.е. ингибирования образования конечного продукта гликирования [AGE]),19 анти -воспалительное,20 и противоопухолевое действие,21–23, а также их антибактериальное,24–26 противогрибковое,15 противовирусное,27 и противопаразитарное28 действие. Также известно, что прополис стимулирует выработку антител, что предполагает его потенциальное использование в качестве адъюванта в вакцинах. Растущее использование этого природного вещества с разнообразным составом и, следовательно, различной биологической активностью в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности вызывает особый интерес. в научных исследованиях, особенно когда речь идет об определении его химического состава. Большинство исследований было проведено на образцах из Европы19,30–33 и Латинской Америки, в частности из Бразилии20,23,34–36, в то время как в Африке было проведено несколько исследований37–41. Информация о бенинском и конголезском42 прополисе остается скудной.

Таким образом, это исследование было направлено на характеристику основных соединений из образцов прополиса, собранных в различных фитогеографических зонах Бенина и Конго (Африка), с использованием дерепликации ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 13С с помощью программного обеспечения MixONat.43,44 Предварительное исследование с использованием базы данных (БД), содержащей Наночастицы прополиса, о которых ранее сообщалось, вместе с их предсказанными химическими сдвигами (δC) 13C не дали каких-либо полезных данных по сравнению с удовлетворительными результатами, обычно получаемыми с растительными экстрактами.43–45 Это можно объяснить химическим составом прополиса, который сильно зависит от на местную флору, что делает невозможным построение хемотаксономической БД. Таким образом, для расшифровки основных соединений бенинского и конголезского прополиса в настоящей работе мы провели высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией с детектированием по рассеянию ультрафиолетового и испарительного света (ВЭЖХ-УФ-ЭЛСД-МС) и газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией ( ГХ-МС) анализирует сырые экстракты прополиса для определения их основных структурных особенностей и построения соответствующих баз данных НЧ, подходящих для программного обеспечения MixONat.46 Затем, после грубого фракционирования образцов прополиса, отобранных в соответствии с их химическим профилем, дерепликация на основе идентификация основных НЧ без дополнительной очистки. Также были проведены анализы антиоксидантов и анти-AGE.

2. Экспериментальные методики.

2.1 Химические вещества

1,1-Дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH), реактив Фолина-Чокальтеу, муравьиная кислота и галловая кислота, все ч. д. а. были приобретены у Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Франция). 6-Гидрокси-2,- 5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (Trolox®) и 50 - кофеилхиновая кислота (хлорогеновая кислота) были получен от Acros Organics (Geel, Бельгия).

2.2 Образцы прополиса

Восемь образцов бенинского прополиса были собраны путем соскоба с ульев в трех фитогеографических зонах (таблица 1 и рисунок SI-1). Образец конголезского прополиса был собран в искусственном лесу из акаций на плато Батеке в центре Республики Конго (табл. 1).

2.3 Извлечение прополиса

Этанольные экстракты прополиса (ЭЭП) первоначально готовили с использованием следующего протокола экстракции.19 Сырой прополис сначала гомогенно измельчали ​​в порошок в присутствии жидкого азота. Для всех образцов 1 г порошка прополиса мацерировали в 20 мл 95-процентного этанола. После перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре смесь фильтровали с использованием дискового воронкообразного фильтра из спеченного стекла (размер пор 16–40 мкм). Остаток реэкстрагировали дважды с использованием тех же стадий. Затем три собранных фильтрата выдерживали при 18°С в течение ночи, фильтровали для удаления парафинов и упаривали при пониженном давлении (40°С, 10 бар) с получением ЭЭП.

8,0 г порошка прополиса ВС1 (1) и ВС2 (2) или 10,3 г ЦГ (3) повторно экстрагировали 95-процентным EtOH (ЭМА, 4 80 мл, 15 мин) для дальнейшего флэш-хроматография.

2.4 Определение общего содержания фенолов

Общее содержание фенолов определяли с помощью колориметрического метода Фолина-Чокальтеу, как описано ранее,19 и недавно адаптированного для непосредственного использования в микропланшетах. Вкратце, 1 0 мкл каждого экстракта прополиса в MeOH (3,5 мг/мл для BC1, 5 мг/мл для BN2, BC2 и CG, 7,5 мг/мл для BN1, BS1a, BS1b и BS2 и 10 мг/мл для BS3) смешивали с 20 мкл дистиллированной воды и 10 мкл реагента Фолина-Чокальтеу в 96-луночном микропланшете. Через 3 мин добавляли 120 мкл дистиллированной воды и 40 мкл 20-процентного водного раствора карбоната натрия. Поглощение измеряли на спектрофотометре для микропланшетов TECAN® (V6.5) при 760 нм через 30 мин в темноте при комнатной температуре. Таким же образом готовили холостую пробу, используя МеОН вместо раствора экстракта, и для расчета калибровочной кривой использовали галловую кислоту (0,04–0,328 мг/мл; y=2,7241x 0,0039; r2=0 .9982). Каждый образец анализировали в трех повторностях. Общее содержание фенолов выражали в эквивалентах галловой кислоты (мг) на грамм экстракта (мг GAE/г).

2.5 Предварительные хроматографические анализы

2.5.1 Аналитическая ТСХ

Аналитическую тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на ТСХ Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия), используя в качестве элюента смесь циклогексан:AcOEt. Пятна на хроматограмме визуализировали сначала в УФ-свете (254 нм), а затем опрыскиванием реагентом ванилин-серная кислота (2 мл концентрированной серной кислоты в 98 мл раствора ванилин:95% этанола, 1:99) и нагревание хроматограмм до 110°С в течение 5 мин.

2.5.2 Процедура ГХ-МС

Анализ ГХ-МС проводили на немодифицированных образцах с использованием газового хроматографа Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Франция) с напряжением ионизации 70 эВ (Электронный Влияние). Образцы готовили в дихлорметане (ДХМ) при концентрации 2 мг/мл для экстрактов и 1 мг/мл для фракций. Разделение проводили с использованием колонки Phenomenex ZB5 (30 м * внутренний диаметр 0,250 мм с толщиной пленки 0,25 мм; Phenomenex, Le Pecq, Франция). Температуру программировали следующим образом: 180°С (3 мин), 180–280°С со скоростью 10°С/мин и 280°С (27 мин). В качестве газа-носителя использовали гелий при скорости потока 2,0 мл/мин. Температуры инжектора и детектора были установлены на 250°С и 280°С соответственно. Метаболиты идентифицировали путем сравнения их времени удерживания (Rt), номинальной массы и/или характеристик фрагментации с таковыми для подлинных образцов и/или данными, содержащимися в библиотеках характеристик фрагментации оборудования (NIST11, NIST11s и FFNSC2).

2.5.3 Процедура ВЭЖХ-DAD-ELSD

Хроматографические анализы проводили на трехмерном жидкостном хроматографе Shimadzu 2030C (Noisiel, Франция), оснащенном диодной матрицей.детектор (DAD) и ELSD (Sedere®) с колонкой Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 мм * 4 мм внутр. диаметр, 5 мкм, Merck, Дармштадт, Германия ), защищенный защитным картриджем Lichrocart® 4–4 (внутренний диаметр 4 мм * 4 мм), при скорости потока 1 мл/мин. Подвижная фаза состояла из 0,1 % муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и метаноле (растворитель Б), а разделение проводили по следующему линейному градиенту: 25–100 % Б (0–40 мин), 100 % (40–45 мин). мин). УФ-видимые спектры записывали в диапазоне 190–600 нм, хроматограммы — при 254 и 280 нм. ЭЛСД нагревался до 30степеньC, и к сигналу было применено усиление 4. Образцы готовили в концентрации 10 мг/мл в МеОН и центрифугировали при 13,000 g в течение 10 мин перед введением (10 мкл) для удаления следов взвешенных веществ.

2.5.4 Процедура ВЭЖХ-УФ-МС

Анализ ВЭЖХ-УФ-МС проводили с использованием модуля разделения 2795 Waters (Guyancourt, Франция), оснащенного детектором Dual λ 2487 Waters. Колонка, подвижные фазы и градиент были такими же, как описано выше для HPLC-DAD-ELSD. Хроматограммы получали при 254 и 280 нм. Массовые анализы проводились на приборе Bruker (Бремен, Германия) с электрораспылением/химической ионизацией при атмосферном давлении (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus в положительном и отрицательном режимах следующим образом: газ столкновения, He; амплитуда энергии столкновения 1,3 В; распылитель и осушающий газ, N2, 7 л/мин; давление распыляющего газа 3 0 фунтов на квадратный дюйм; температура в сухом состоянии 340 С; скорость потока 1,0 мл/мин; коэффициент разделения растворителя 1:9; диапазон сканирования, m/z 100–1,000. Образцы готовили в концентрации 10 мг/мл в МеОН, центрифугировали при 13 000 g в течение 10 мин и фильтровали через шприцевой фильтр с политетрафторэтиленовой (ПТФЭ) мембраной 0,{27}} мкм перед инъекцией (20 мкл) для удаления следов из взвешенных материалов.

2.6 Фракционирование EEP с помощью флэш-хроматографии

Сначала 3,8 г ВС1 (1), 3,5 г ВС2 (2) или 4,0 г КГ (3) ЭЭП растворяли в минимальном объеме ДХМ и ацетона и смешивали с силикагелем (кремнезем соотношение гель:экстракт 2:1). Для всех из них растворителю давали испариться до получения мелкодисперсного сухого порошка. Затем для каждого ЭЭП проводили фракционирование с использованием аппарата CombiFlash Teledyne ISCO (Линкольн, Небраска, США) с колонкой с силикагелем (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, France) при скорости потока 25 мл/мин с циклогексаном (растворитель A) и этилацетатом (EtOAc) (растворитель B) с использованием следующего градиентного элюирования: (1) для BC1 EEP, 5 % B (0–10 мин), 5–20 % B (10–30 мин), 20–30 % B (30–60 мин), 30–50 % B (60–85 мин) и 50–100 % Б (85–110 мин); Было собрано 160 пробирок по 20 мл и объединено в 14 фракций (от BC1_F1 до BC1_F14) на основе их хроматографических профилей (соотношение циклогексан:EtOAc от 90:10 до 50:50). ); (2) для BC2 EEP, 5% B (0–10 мин), 5–10% B (10–20 мин), 10–30% B (20–40 мин), 30–40% B (40–55 мин). мин) и 40–100% В (55–70 мин); Было собрано 100 пробирок по 20 мл и объединено в 8 фракций (от BC2_F1 до BC2_F8) на основе их хроматографических профилей ТСХ (соотношение циклогексан:EtOAc от 90:10 до 60:40). ); 3) для CG EEP, 5 % В (0–10 мин), 5–10 % В (10–30 мин), 10–20 % В (30–50 мин), 20–40 % В (50–70 мин). мин), 40–60% В (70–80 мин) и 60–100% В (80–90 мин); Было собрано 135 пробирок по 20 мл и объединено в 23 фракции (от CG_F1 до CG_F23) на основе их хроматографических профилей (соотношение циклогексан:EtOAc, от 80:20 до 60:40). ).

Для фракции BC{{0}}F7 проводили дополнительную стадию фракционирования: 200 мг растворяли в минимальном объеме MeOH и смешивали с силикагелем C18- (C18-silica соотношение гель:экстракт 2:1). Разделение осуществляли на колонке С18 (Interchim® PF-C18HP, 4 г, Montluçon, Франция) при скорости потока 15 мл/мин с использованием воды (растворитель А) и МеОН (растворитель В) при следующем градиентном элюировании: 70% В (0–30 мин) и 70–100% В (30–40 мин); Было собрано 80 пробирок по 8 мл и объединено в 5 фракций (от BC2_F7-1 до BC2_F7-5) на основании их профилей ВЭЖХ-УФ (280 нм). .

2.7 1 H и 13C ЯМР анализы

Спектры ЯМР (1D и 2D) фракций прополиса (7–58 мг) или иногда НЧ регистрировали в дейтерированном хлороформе (CDCl3) или дейтерированном метаноле (CD3OD) (500 мкл) на ЯМР-спектрометре JEOL при 400 МГц в течение 1 Н и 100 мкл. МГц для 13С. ЯМР-эксперименты (1H-ЯМР, 13C-ЯМР, DEPT-135, DEPT-90 и 2D-ЯМР) на фракциях и чистых НЧ проводили при 298 K на H-спектрометре JEOL 400 МГц (JEOL Europe, Croissy -сюр-Сен, Франция), оснащенный обратным зондом 5-мм (ROYAL RO5). Химические сдвиги (δH и δC) выражены в миллионных долях, а значения J — в Гц.

Для спектров ЯМР 13C (100 МГц) использовалась последовательность развязки WALTZ-16 со временем сбора данных 1,04 с (32 768 комплексных точек данных) и задержкой релаксации 2 с. Было собрано от 1500 до 11 000 сканирований, чтобы получить удовлетворительное соотношение сигнал/шум. Перед преобразованием Фурье к каждому затуханию свободной индукции (FID) применялся фильтр с экспоненциальным расширением линии 1 Гц. Спектры фазировали вручную и корректировали по базовой линии с помощью программного обеспечения MestReNova (Mestrelab Research, Сантьяго-де-Компостела, Испания) и сопоставляли с центральным резонансом дейтерированного растворителя при δC 77,16 м.д. (CDCl3) и δC 49,00 м.д. (CD3OD). Для улучшения без искажений с помощью экспериментов по переносу поляризации (DEPT) требовалось от 512 до 5500 сканирований, и совмещение со спектрами 13C выполнялось с использованием заданного значения δC. Затем использовали порог минимальной интенсивности для ручного сбора положительных сигналов 13C ЯМР и DEPT-90, а также положительных и отрицательных сигналов DEPT-135, избегая при этом потенциальных шумовых артефактов.

База данных Propolis DB1 была впервые создана путем поиска соединений, описанных в прополисе, на SciFindern,47 в результате чего была получена база данных из 1471 NP; Значения δC были предсказаны с использованием предикторов ЯМР Advanced Chemistry Development (ACD) (C, H). Из таких БД, содержащих НЧ вместе с их значениями δC-SDF, процедура CTypeGen, включенная в MixONat, создала подходящую БД: она читала файл пространственных данных (SDF) и сортировала химические сдвиги по типу углерода. Затем был создан необходимый SDF c-типа, т. е. Propolis DB1.43,44 c-типа.

Создан Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2. Поиск веществ по ключевым словам стильбеноиды и фенантрены в БД LOTUS, содержащей 276 518 НЧ48 (LOTUS, 2022), позволил получить БД2 Stilbenoids_Phenanthrenoids из 2681 НЧ в качестве SDF. Затем был создан Flavanones DB3: поиск в SciFindern47 с использованием субструктуры 2-фенилхроман-4-one позволил выбрать 56 679 молекул. Они были дополнительно сокращены до 2893 в отношении «Присутствия натуральных продуктов» с использованием анализа веществ с фильтром «Эталонная роль», предложенным SciFindern. После дополнительной очистки на этапе фильтрации на основе ожидаемой молекулярной массы (ММ) (т.е. от 340 до 424 Да) все соответствующие флаваноны впоследствии экспортировали в виде SDF для получения NP из Flavanones DB3 (684 NP). Для каждого NP DB2 и DB3 значения δC-SDF были предсказаны с использованием программного обеспечения предикторов ACD ЯМР (C, H), а также методологии, ранее описанной Nuzillard46, для непосредственного получения SDF c-типа, готового для использования MixONat. Последний содержит для каждого соединения БД предсказанные значения δC, организованные как метил, метилен, метин или четвертичные атомы углерода.

Тритерпены DB4 были построены из PNMRNP3 DB49,50, импортированного в качестве SDF в программное обеспечение предикторов ACD ЯМР (C, H) путем поиска тритерпенов с молекулярной массой от 100 до 500 Да (т. е. данные поиска: тритерпены; поисковая молекулярная масса: от 100 до 500). для непосредственного получения базы данных 6623 тритерпенов в требуемом формате файла c-типа.

Производные алк(ен)илрезорцина и фенола DB5 были построены из PNMRNP3 DB49,50, импортированного в качестве SDF в программу предикторов ACD ЯМР (C, H) путем поиска NP с м-алк(ен)илфенольным каркасом и классифицированы как фенолы. (т. е. 3-(гексадек-8-ен-1-ил)фенол Поиск подструктуры; поиск Classyfire class: фенол) для непосредственного получения БД из 44 NP в требуемом формате файла c-типа.

2.8 13Дерепликация на основе C ЯМР с использованием программного обеспечения MixONat

Список пиков и данные интенсивности, полученные из каждого экспериментального спектра (13C ЯМР, DEPT-135 и DEPT-90), были экспортированы в виде файла . csv с помощью программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft 16.45) и используется в качестве входного файла в программном обеспечении MixONat. Такие файлы состоят из списка значений δC, упорядоченных в порядке убывания их интенсивности в одной строке, разделенных запятой.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. После этого экспериментальные данные НП с лучшими показателями сравнивались с литературными.

2.9 Очистка

2.9.1 Препаративная ВЭЖХ

Очистку фракций ВС{{0}}F6 и ВС1_F8 (40 мг в 2 мл МеОН) проводили с использованием препарата Shimadzu LC-20AP. жидкостный хроматограф, оснащенный УФ-видимым детектором SPD-40 (Noisiel, Франция), инжекторной петлей на 2 мл и сборником фракций FRC-10A, с использованием препаративной колонки C18 (25{{39 }} мм, внутренний диаметр 21,2 мм, 5 мкм) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Франция) при скорости потока 21,24 мл/мин. Подвижная фаза состояла из 0,1 % муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и метаноле (растворитель Б). Разделение проводили по следующему градиенту: 1) для ВС1_F6 40 % Б (0–5 мин), 40–70% В (5–20 мин) и 70–90% (20–30 мин); (2) для BC1_F8, 40–70 процентов B (0–15 мин) и 70–90 процентов (15-25 мин). Хроматограммы получали при 254 и 280 нм.

2.9.2 Твердофазная экстракция (ТФЭ)

Для получения наиболее полярной фракции БЦ2-ЭПП (200 мг в 5 мл МеОН в смеси с 350 мг С18-силикагеля после упаривания) очистку проводили на твердофазной экстракционной колонке С18. (2 г/15 мл, Thermo Scientific™, Вильбон-сюр-Иветт, Франция) с водой: MeOH 7:3 (10 мл) и водой: MeOH 6:4 (10 мл). Пробирки 4–10 объединяли для формирования полярной фракции ВС2 (ВС2_ТФЭ) на основе их профилей ВЭЖХ-УФ (330 нм).

2.10 Тесты на антиоксиданты и анти-AGE

2.10.1 Удаление радикалов DPPH

Оценка удаления радикалов DPPH бенинскими EEP была выполнена, как описано ранее. (ДМСО). Аликвоты (100 мкл) этих разбавленных растворов помещали в 96-луночные планшеты в трех экземплярах. Около 25 мкл свежеприготовленного раствора DPPH (1 мМ) добавляли к 75 мкл абсолютного EtOH, используя инжектор устройства для считывания микропланшетов (Infinite® 200, Tecan, France) до получения конечного объема 200 мкл на лунку. Через 30 мин в темноте при температуре окружающей среды определяли оптическую плотность при 517 нм. EtOH использовали в качестве холостого опыта, тогда как 10, 25, 50 и 75 мкМ растворы тролокса (гидрофильного аналога -токоферола) использовали для калибровочной кривой. Образец этанольного раствора хлорогеновой кислоты (0,02 мг/мл) использовали в качестве стандарта контроля качества. Результаты выражали в эквивалентах тролокса (микромоль ТЕ на г экстракта).

2.10.2 Анализ Anti-AGE

Влияние экстрактов прополиса и пяти основных выделенных производных нарингенина на образование КПГ определяли, как описано ранее. 13}},5 М) вместе с тестируемым соединением (от 3 мкМ до 3 мМ) или экстрактом (от 1 мкг до 1 мг) в 50 мМ фосфатном буфере при рН 7,4 (NaN3, 0,02%). Растворы инкубировали в 96-луночных микротитрационных планшетах при 37°C в течение 24 часов в закрытой системе перед измерением флуоресценции AGE. Для каждого измерения вычитали флуоресценцию инкубированного образца в идентичных условиях без D-рибозы. Флуоресценцию AGE, подобную пентозидину (возбуждение при 335 нм, эмиссия при 385 нм), измеряли с помощью флуорометрии.52 Значения IC50 определяли как количество экстракта (мкг/мл) или положительного контроля (мкМ), необходимое для снижения образования AGE на 50%. относительно отрицательного контроля. В соответствии со статистическим проверочным анализом53 для точного определения IC50 достаточно одного анализа.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Хроматографическое профилирование

Общее ЖХ-профилирование восьми бенинских и конголезских ЭПП с использованием квазиуниверсального детектора ELSD показало, что все образцы содержали неполярные соединения, элюированные в конце хроматограммы (рис. 1). BC1 также представлял большое количество более полярных соединений, а BC2 демонстрировал некоторые среднеполярные соединения в меньших количествах. Неполярные соединения в CG EEP оказались совершенно отличными от бенинских.

Таким образом, профилирование ELSD привело к трем различным исходным образцам, состав которых был дополнительно исследован: BC1, BC2 и CG.

Во-первых, были проведены анализы ГХ-МС, сравнивающие фрагментацию МС с базой данных NIST, чтобы охарактеризовать химические классы и, по возможности, идентифицировать составляющие. Предполагаемая идентификация (на основе процента совпадения с базой данных NIST) и химические классы соединений представлены в таблице 2 (данные профилирования ГХ-полного ионного тока [TIC] показаны на рисунке SI-2).

Все бенинские EEP представляли одинаковые профили неполярных соединений, обозначенных буквами от A до F, но их количество могло варьироваться. Предположительно они были идентифицированы как -или -амринон (А), -амирин (В), лупенон (С), -амирин (D), -или -амиринацетат (Е) и лупеолацетат (F) (см. рис. SI). -3), уже описанные как основные НЧ мексиканского прополиса.54 Zhang et al. (2014) и Tamfu et al. (2020) также описали тритерпеноиды в виде ацетатов амирина/лупеола и амирина/лупеола в различных образцах африканского прополиса.41,55 Только BC1 представил дополнительные НЧ, элюированные между Rt 10 и 15 минутами, предположительно метоксилированные стильбеноиды или фенантрены в соответствии с характером их фрагментации. Конголезский EEP продемонстрировал профиль, отличный от бенинского, с этиловыми эфирами кислот C16 и C18 как более летучими соединениями, связанными с хорошей оценкой соответствия 94 процента, производным фенола при Rt 13,1 мин, тремя производными резорцина в диапазоне 14–14%. 17 мин, а различные виды тритерпеновых производных после Rt 21 мин.

Кроме того, ПКП анализировали с помощью ВЭЖХ-ДАД-МС для визуализации нелетучих НЧ (см. рис. SI-4). Различное профилирование показало, что BC1 EEP демонстрирует большое количество среднеполярных соединений с хромофорами, поглощающими при 280 нм, а также BC2 в меньших пропорциях, а CG обладает очень плохим УФ-профилем при 280 нм.

3.2 Химический состав ВС1 и ВС2

Для идентификации их основных NP с использованием дерепликации ЯМР 13C на основе MixONat и подходящих DB затем проводили грубое фракционирование BC1 и BC2 EEP с помощью флэш-хроматографии. Действительно, для BC1 анализ ГХ-МС выявил наличие метоксилированных стильбеноидов или фенантренов, что побудило нас построить специфические стильбеноиды_фенантреноиды DB2. Для BC2, за исключением более полярных соединений при Rt 3,8 мин, все соединения показали УФ-спектры флаванонов-дигидрофлавонолов, что позволило предположить создание Flavanones DB3.

Как показано в таблице 3, дигидрофенантрены 1 и 3–5, фенантрены 2 и 6 и дигидростильбен 7 (рис. 2) были предложены MixONat в BC1 EEP и подтверждены сравнением с литературными данными (см. вспомогательную информацию). При необходимости использовали MW-фильтр на основании данных ВЭЖХ-МС.

Точнее, среди 9,10-производных дигидрофенантрена из 2681 NP в DB2 MixONat предложил 6-метоксицелонин (2,7-дигидрокси-3,5-диметокси{ {10}},10-дигидрофенантрен; 3, ранг 1, оценка 0,75, цифры SI-13 и SI-14) в БК{{ 18}}F5 и его присутствие было подтверждено сравнением с опубликованными данными ЯМР. Его еще идентифицировали у видов Combretaceae56 и у орхидеи Bulbophyllum vaginatum; 57 и 2,7-дигидрокси-3,4,6-триметокси- 9,10-дигидрофенантрен (4, ранг 1, оценка 0,88, рисунки SI{{33). }} и SI-16) предполагалось в BC1_F2. Соединение 4 уже было описано в сенегальском прополисе58, и его присутствие было подтверждено на основании данных, опубликованных Pettit et al. из африканского дерева Combretum caffrum59 и Lu et al. из Dioscorea nipponica Makino.60

Процесс дерепликации на основе ЯМР 13С также предсказал 2,6-дигидрокси-3,4,7-триметокси-9,10-дигидрофенантрен (5, ранг 8, оценка 0.76, рисунки SI-15 и SI-16) в BC1_F2 и 2,6,7-тригидрокси{{20 }},4-диметокси-9,10-дигидрофенантрен (1, ранг 2, оценка 0.5, рисунки SI-5 и SI-6 ) в BC{{30}}F6-1 при использовании молекулярного фильтра с молекулярной массой 288 Да. Для 1 оценка была довольно низкой (0,5); поэтому были проведены дополнительные 2D ЯМР-эксперименты (гетероядерные множественные квантовые корреляции [HMQC], гетероядерная множественная связность [HMBC], спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера [NOESY], ср. рисунки SI-7–SI-10) выполняется для подтверждения структуры; для 5 оценка составила 0,76, т. е. выше 0,70. Эти два НЧ (1 и 5) были впервые упомянуты Letcher et al. у видов Combretum61,62 и 1 уже был обнаружен в сенегальском прополисе.58

Среди производных фенантрена MixONat выдвинул гипотезу о 2,6,7-тригидрокси-3,4-диметоксифенантрене (2, ранг 1, оценка 0,88, рисунки SI-11 и SI{{10}}) в BC1_F8-1, что было подтверждено сравнением с его спектральными данными, описанными Letcher et al. в Combretum apiculatum. 61 2,7-дигидрокси-3,4,6-триметоксифенантрен (6, ранг 5, оценка 0,94, рисунки SI-17 и SI-18) ранее выделенный из Photolida Chinensis63, был предложен в BC1_F4.

Комбретастатин B{{0}} (7), дигидростильбен, был предложен MixONat на первом месте (оценка 1,0, рисунки SI-17 и SI-19) в BC1 EPP при использовании фильтр MW (MW 304 Да) и подтверждено сравнением с данными ЯМР, описанными Pettit et al. у Combretum caffrum. 59

Соединения 2, 6 и 7 уже были идентифицированы в сенегальском прополисе.58

Данные 1 H и 13 C ЯМР 1–7 доступны в дополнительной информации.

Для BC2 было идентифицировано семь соединений, принадлежащих к двум структурным классам полифенолов, производным хромон-С-глюкозида и пренилфлаванона (8–14), некоторые из которых были впервые описаны в прополисе (рис. 3).

Процесс на основе ЯМР 13C с использованием MixONat и DB1-DB5 не дал соответствующих результатов, указывающих на исходные НЧ. Два основных продукта (8–9) были полностью охарактеризованы как смесь с использованием масс-спектров и данных 1D и 2D ЯМР (1H, 13C, HMQC, HMBC, ср. Рисунок SI-20–SI-23) и идентифицированы как флорин (8) и изобифлорин (9), два хроманон-C-глюкозида, недавно описанные в прополисе, ранее описанные в Pancratium biflorum64 и гвоздике Eugenia caryophyllata соответственно.65

Что касается производных флаванона, среди 688 NP в DB3 MixONat предложил 6-пренилнарингенин (10, ранг 1, оценка 0,95, рисунки SI- 24 и SI{{8 }}) уже описан в нигерийском красном прополисе66 в BC{{10}}F7-1. 6,8-дипрениларомадендрин (12, ранг 1, оценка 1.0, рисунки SI-28 и SI-29) и 6,8-дипренилнарингенин (лонхокарпол А ) (13, ранг 10, оценка 0,84, рисунки SI-30 и SI-31), ранее обнаруженные в образцах прополиса в Камеруне,42 были подтверждены в Британской Колумбии2_F{ {30}} и BC2_F5 соответственно. 6-Геранилнарингенин (14, ранг 1, оценка 0,84, рисунки SI-32 и SI-33), ранее описанный в прополисе с Соломоновых островов,67 был выдвинут и подтвержден в Британской Колумбии{{41 }}Ф7-5. Наконец, MixONat предложил 6-диметилаллилнарингенин (11) на втором месте в BC2_F6 (ранг 2, оценка 0,65, рисунки SI-26 и SI- 27). Изомер в положении 8 был предложен в качестве первого положения, но сравнение с литературными данными 68,69 показало, что это изомер в положении 6. Соединение 11 было новым для прополиса, но уже описано в органических экстрактах Monotes africanus. 70 1 Данные ЯМР H и 13C 8–14 доступны в дополнительной информации.

【Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】