Доступность хроматина и экспрессия микроРНК в клетках-предшественниках нефрона во время развития почек

Для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Эндрю Клагстон^1,2,3, Эндрю Боднар^2,3, Дебора Мальта Серкейра^2,3, Ю Ленг Фуа^2,5,6, Алисса Лоулер^8,9,10, Кристи Боггс⁷, Андреас Пфеннинг^8,10, Жаклин Хо^2,3*и Деннис Костка^1,4*

¹Кафедра биологии развития, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, США²Исследовательский центр Рангос, Питтсбургская детская больница UPMC, Питтсбург, Пенсильвания, США³Кафедра педиатрии, отделение нефрологии, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Пенсильвания, США⁴Кафедра вычислительной и системной биологии и Питтсбургский центр эволюционной биологии и медицины, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, США⁵Отделение генетической и геномной медицины, отделение педиатрии, Детская больница UPMC в Питтсбурге, Питтсбург, Пенсильвания, США⁶Отделение патологии, лаборатория клинической биохимической генетики, детская больница UPMC в Питтсбурге, Питтсбург, Пенсильвания, США⁷Кафедра педиатрии, отделение гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Медицинская школа Университета Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания, США.⁸вычислительная биология,⁹Биологические науки и¹⁰Институт неврологии, Университет Карнеги-Меллона, Питтсбург, Пенсильвания, США

Абстрактный

Нефроны млекопитающих происходят из популяцииклетки-предшественники нефрона, и изменения в транскриптомах этих клеток способствуют прекращению нефрогенеза, важной детерминанты числа нефронов. Чтобы охарактеризовать экспрессию микроРНК (миРНК) и идентифицировать предполагаемые цис-регуляторные области, мы собрали клетки-предшественники нефрона у мышей.почкив эмбриональный день 14,5 и в постнатальный нулевой день и анализировали экспрессию малых РНК и доступный для транспозазы хроматин. Мы обнаружили экспрессию 1104 микроРНК (114 с изменениями экспрессии) и 46 374 доступных областей хроматина (2103 с недоступными изменениями). В масштабах всего генома наши данные подчеркивают такие процессы, как клеточная дифференцировка, миграция клеток, взаимодействия внеклеточного матрикса и сигнальные пути развития. Более того, они идентифицируют новые кандидаты в цис-регуляторные элементы для Eya1 и Pax8, оба гена играют роль в дифференцировке клеток-предшественников нефрона. Наконец, мы связываем микроРНК, изменяющие экспрессию, включая let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p и miR{{ 20}}p, с цис-регуляторными элементами-кандидатами и генами-мишенями. Эти анализы выдвигают на первый план новые предполагаемые цис-регуляторные локусы для miRNA в предшественниках нефрона.

Введение

Функциональная единицапочкаНефрон служит для фильтрации отходов и поддержания нормального гомеостаза воды, кислотно-щелочного баланса и электролитов в организме. Количество нефронов у людей широко варьирует (обычно от двухсот тысяч до более миллиона нефронов (Hughson et al., 2003)) и устанавливается до рождения у людей (примерно в постнатальный день 2-3 у мышей (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Нефроны не могут регенерировать после рождения, а уменьшение количества нефронов связано с повышенным риском хронического заболевания почек и гипертонии (Bertram et al., 2011). Число нефронов, в свою очередь, в значительной степени определяется популяцией клеток, называемыхклетки-предшественники нефрона(Себриан и др., 2014b). На последних стадияхпочкаВ процессе развития предшественники нефронов увеличивают свою склонность к дифференцировке, что постепенно истощает их популяцию и знаменует окончательное прекращение нефрогенеза (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Понимание механизмов, которые регулируют прекращение нефрогенеза, имеет важное значение для определения наличия нефронов и риска последующего заболевания почек.

В течениепочкаразвитие, самообновляющиеся Cited1 plus /Six2 plus предшественники нефрона индуцируются, чтобы стать праймированными предшественниками Cited1-/Six2 plus, и впоследствии дифференцироваться в Wnt4-экспрессирующие почечные везикулы в ответ на Wnt9b/ -катенин (McMahon и др., 2016; Рамбал и др., 2011). Внутренние транскрипционные изменения в ранних по сравнению с поздними предшественниками нефронов включают гены и пути, которые влияют на старение стволовых клеток, в частности, mTor и его репрессор гамартин (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Действительно, считается, что гамартин снижает чувствительность предшественников нефрона к сигналам самообновления и таким образом способствует прекращению нефрогенеза (S. Chen et al., 2015). В соответствии с идеей о том, что ранние предшественники нефрона имеют большую тенденцию к самообновлению, наблюдение, что доступность хроматина повышена для сайтов связывания основных факторов транскрипции клеток-предшественников нефрона, включая Six2 и Wt1, по сравнению с поздними предшественниками нефрона (Hilliard et al. , 2019). Было показано, что эти факторы транскрипции связывают энхансерные последовательности, расположенные в «регуляторных горячих точках» генома (O'Brien et al., 2018). Индукция предшественников нефрона происходит из-за повышения уровня -катенина, что приводит к активации комплексов Lef1/Tcf7 в генах, отвечающих за активацию программы нефрогенеза (Park et al., 2012), и предполагается, что они образуют комплексы с Tcf7l1 и Tcf7l2. для создания и поддержания регуляторных петель хроматина, которые облегчают активацию генов (Guo et al., 2021).

Нажмите чтобыПорошок цистанхе тубулозы для лечения заболеваний почек

Недавние исследования выявили участие микроРНК (миРНК) в регуляции прекращения нефрогенеза. miRNA представляют собой короткие некодирующие молекулы РНК, которые нацеливаются на транскрипты матричной РНК (мРНК) для снижения трансляции или усиления деградации посредством РНК-индуцированного комплекса молчания (RISC) (Bartel, 2009). Белок Lin28b является известным репрессором семейства let-7 miRNAs (Heo et al., 2008). Экспрессия Lin28b снижается в предшественниках нефрона по мере развития нефрогенеза, и это совпадает с увеличением экспрессии семейства let{8}} miRNA (Yermalovich et al., 2019). Кроме того, условная индукция экспрессии Lin28b в линии Wt1- приводит к репрессии let-7 miRNA, достаточной для продления нефрогенеза (Yermalovich et al., 2019). Неизвестно, регулируют ли др. miRNAs время нефрогенеза. Кроме того, хотя были идентифицированы энхансеры, которые регулируют экспрессию длинных некодирующих РНК во время нефрогенеза (Nishikawa et al., 2019), ни один из них не регулирует экспрессию микроРНК в предшественниках нефрона.

В этом исследовании мы стремились одновременно идентифицировать новую микроРНК, которая способствует прекращению нефрогенеза, наряду с потенциальными цис-регуляторными свойствами. Таким образом, чтобы наблюдать за изменениями в экспрессии миРНК и доступности хроматина между 14,5 дня эмбриона (E14.5) и нулевым днем ​​постнатального развития (P0), мы создали согласованные наборы данных мРНК-seq и ATAC-seq из первичных и непассированныхклетки-предшественники нефронав этих двухвременных точках. Мы идентифицировали 114 микроРНК, которые по-разному экспрессируются вклетки-предшественники нефронамежду этими двумя временными точками, а также 2103 области изменяющейся доступности хроматина, которые мы называем дифференциально доступными областями (DAR). Анализы обогащения предсказанных генов-мишеней значительно меняющихся микроРНК, а также среди геномных местоположений DAR включают пути, которые влияют на дифференцировку эпителиальных клеток, миграцию клеток, взаимодействия внеклеточного матрикса и ключевые пути передачи сигналов развития, такие как передача сигналов Wnt, Notch и TGF. . Мы наблюдаем значительные изменения в доступности хроматина и представляем несколько линий доказательств, указывающих на то, что две геномные области являются предполагаемыми энхансерами для генов Eya1 и Pax8 в клетках-предшественниках нефрона. Наконец, мы определили последовательную доступность хроматина и изменения экспрессии миРНК для 33 пар миРНК и DAR, включая let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p и miR-9-3p, а также представляют предполагаемые гены-мишени, экспрессируемые в предшественниках нефрона для дифференциально экспрессируемых микроРНК.

Полученные результаты

Выделение популяций клеток-предшественников нефрона из E14.5 и P0почки

Клетки-предшественники нефронабыли выделены с помощью положительного отбора по Itg 8 на E14.5 или на P 0, и каждый образец был разделен для выполнения мРНК-seq, ATAC-seq и контроля качества (дополнительная фигура 1 AB). Количественная ПЦР (qRT-PCR) подтвердила, что маркерные гены предшественников нефрона Six2 и Cited1 (Huang et al., 2016) высоко экспрессируются в изолированных образцах предшественников нефрона по сравнению с целыми образцами.почка, в большей степени, чем маркеры для других типов клеток (включая зачаток мочеточника (Caleb) (Cebrian et al., 2{{1{0}}}14a), эндотелиальные клетки (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), почечная строма (Pdgfr) (S. Chen et al., 2015) и почечный везикул (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (дополнительный рисунок 1 C). Что касается пола, помет, используемый для образцов E14.5, варьировался от от 27 до 50 процентов самок, а пометы для образцов P0 варьировались от 31 до 75 процентов самок.В среднем образцы E14.5 составляли 38 процентов самок, а образцы P0 составляли 49 процентов самок (дополнительный рисунок 1 D). - совпадающие популяции клеток-предшественников нефрона позволили нам проанализироватьдоступность хроматинаэкспрессия малых РНК на тех же стадиях развития в двух временных точках (E14.5 и P0).

Ранние и поздние предшественники нефрона имеют разные профили транскрипции микроРНК.

Секвенирование малых РНК выявило 1,104 известных транскрипта микроРНК и идентифицировало 114 микроРНК, которые демонстрируют значительное изменение экспрессии между образцами E14.5 и P{{10}} (ложная частота обнаружения ( FDR)=0.05; дополнительная таблица 1). Половина дифференциально экспрессируемых миРНК демонстрируют повышенную экспрессию на P0 по сравнению с E14.5, а анализ основных компонентов подчеркивает большую однородность экспрессии миРНК среди образцов E14.5 по сравнению с P0 (рис. 1А). Иерархическая кластеризация выявляет четкую группировку miRNAs на те, у которых экспрессия увеличивается и снижается между E14.5 и P0 соответственно (рис. 1B). Члены семейства миРНК let-7являются одними из обнаруженных наиболее высокоэкспрессируемых миРНК, и мы отмечаем, что все члены семейства со значительными изменениями демонстрируют повышенную экспрессию на P0 (данные не показаны). Это согласуется с результатами, показывающими, что снижение экспрессии Lin28b приводит к широкому увеличению экспрессии семейства let-7 в ходе нефрогенеза (Yermalovich et al., 2019). Другие микроРНК со значительно более высокой экспрессией на P0 включают miR-429-3p, члена семейства miR-200, который, как известно, влияет на дифференцировку подоцитов (Z. Li et al., 2016), и обе miR{{30 }}a-5p и miR-125b-5p. Последние два из них, как известно, репрессируют транскрипты Lin28 в различных клеточных средах (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). миРНК со значительно более низкой экспрессией на P0 включает ангиогенез- (S. Wang et al., 2008) и стимулирующую пролиферацию (Schober et al., 2014) miR-126.

Инструмент DIANA miRPath позволяет анализировать пути KEGG микроРНК на основе их соответствующих генов-мишеней, как это предсказано микро-T-CDS (Vlachos et al., 2015). Мы обнаружили, что микроРНК с наибольшими изменениями в экспрессии между E14.5 и P 0 (вверх или вниз) - это те, которые регулируют пути, играющие ключевую роль в нефрогенезе (рис. 1C, дополнительная фигура 2). Например, Tgf- секретируется окружающими стромальными клетками, чтобы способствовать дифференцировке предшественников нефрона (Rowan et al., 2{{50}}}18), и мы отмечаем сниженную экспрессию среди миРНК предшественников нефрона, нацеленных на нижестоящие эффекторы «TGF-сигнальный путь» (KEGG-путь mmu04350, p-значение 1,45e- 6). «Сигнальный путь MAPK» (mmu04010) влияет на организацию и подготовку предшественников нефрона к дифференцировке и регулирует их взаимодействие с внеклеточным матриксом (ECM) через Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Мы отмечаем значительное количество микроРНК с повышающей и понижающей регуляцией, которые нацелены на разные гены в этом сигнальном пути MAPK (значения p 3,5e- 6 и 3,0e- 4 для верхних и нижних списков соответственно). . Наконец, путь KEGG «Взаимодействие с рецептором внеклеточного матрикса (ECM)» (mmu04512) является наиболее значительно обогащенным идентифицированным путем, а составляющие его гены гораздо в большей степени нацелены на микроРНК, экспрессия которых увеличивается со временем (значение p 7,4e{ {32}} среди увеличивающихся микроРНК по сравнению с 1.1e-2 среди уменьшающихся). Связанные с ВКМ гены нацелены на некоторые из наиболее экспрессируемых и значительно увеличивающихся микроРНК, которые мы обнаруживаем, включая miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, и пусть-7f-5p. В частности, miR-196a-5p является наиболее экспрессируемой микроРНК в наших образцах, и ее уровень 8-кратно увеличивается между E14.5 и P0. Генные транскрипты, которые были предсказанными мишенями микроРНК (с использованием TargetScan (Agarwal et al., 2015)) с повышенной экспрессией на P0, включают Bach2, предполагаемую молекулярную связь между путями MAPK/AP1 и Six2/ -catenin для самообновления и дифференцировки. в предшественниках нефрона соответственно (Hilliard et al., 2019).

Чтобы идентифицировать предполагаемые мишени для дифференциально экспрессируемых миРНК в предшественниках нефрона, мы использовали компьютерную аннотацию миРНК, предоставленную в miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), и аннотированные экспериментальные взаимодействия миРНК-мРНК из ступки (HY Huang et al., 2020) в сочетании с нашим ранее созданным набором данных для секвенирования одноклеточной РНК E14.5 (Bais et al., 2020). Таким образом, мы создали список потенциальных взаимодействий миРНК-мРНК, основанный на дифференциальной экспрессии миР между E14.5 и P0 в предшественниках нефрона с соответствующим изменением экспрессии гена-мишени между самообновляющимися и праймированными предшественниками нефрона, а также праймированными и дифференциация предшественников нефрона (рис. 2). Наш анализ показывает, что Meis2 и Hmga2 являются потенциальными мишенями семейства let-7 микроРНК в предшественниках нефронов (рис. 2), при этом сниженная экспрессия Meis2 и Hmga2 связана с повышенной экспрессией членов семейства let-7. в дифференцировке или старении предшественников нефрона. Фактор транскрипции Meis2 сильно экспрессируется в предшественниках нефрона и строме почки во времяпочкаразвития (Lam et al., 2014) и связан с регуляцией клеточной пролиферации в других контекстах (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 представляет собой белок, не связывающий гистоновый хроматин, он сильно экспрессируется в стволовых клетках и ассоциирован с различными мезенхимальными опухолями (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Точно так же увеличение экспрессии Jag1 связано с уменьшением экспрессии miR-34b-5p, miR-983p и miR-200a-3p при дифференциации или стареющие предшественники нефронов (рис. 2). Jag1 является ключевым лигандом в передаче сигналов Notch, экспрессия которого увеличивается по мере дифференцировки предшественников нефрона (Chung et al., 2016). Все предсказанные или аннотированные мишени микроРНК для генов с изменениями экспрессии между самообновляющимися, праймированными и дифференцирующимися предшественниками нефрона доступны в Приложении.

Рисунок 1. Существенные изменения в экспрессии miRNA между предшественниками нефрона E14.5 и P0. A) Анализ основных компонентов показывает, что момент времени развития является основным фактором, влияющим на изменение экспрессии miRNA. B) Тепловая карта, изображающая относительную экспрессию всех значительно меняющихся микроРНК. Столбцы, содержащие образцы E14.5 слева, отмечены светло-зеленым цветом, а столбцы с образцами P0 справа отмечены темно-зеленым цветом. C) Обогащение генов из конкретных путей KEGG среди предсказанных генов-мишеней микроРНК с повышенной и пониженной регуляцией (красные и синие столбцы соответственно). Минимальное включенное значение p равно 1e-5.

Рисунок 2. Взаимодействия микроРНК-мРНК с возможной ролью в старении и дифференцировке клеток-предшественников нефрона. Показаны микроРНК (кружки) и мРНК (квадраты). миРНК с повышенной экспрессией между E14.5 и P0 показаны красным цветом, миРНК с пониженной экспрессией показаны синим цветом. Аннотированные гены-мишени (из mirDB и mir TarBase) с возрастающей экспрессией между самообновляющимися, праймированными или дифференцирующимисяклетки-предшественники нефрона(Bais et al., 2020) показаны красным, мРНК с уменьшающейся экспрессией — синим. Ребра из mirDB и mirTarDB, которые не согласуются с наблюдаемыми изменениями выражения, были опущены, но включены в дополнительную таблицу 2.

Ранние и поздние предшественники нефрона имеют различное окружение хроматина.

Данные ATAC-seq для предшественников нефрона E14.5 и P0 позволили нам идентифицировать 46 374 области доступного хроматина (с неснижаемой частотой обнаружения (Boleu et al., 2015) порога {{ 22}}.1, см. (дополнительный рисунок 3 C, дополнительная таблица 3), объединенные по образцам и моментам времени. Мы отмечаем, что наши данные соответствуют рекомендациям ATAC-seq проекта ENCODE (ENCODE, nd) (дополнительный рисунок 3 A, B) и что мы наблюдаем повышенную степень сохранения среди пиков IDR, чем наблюдаемые в рандомизированных контролях (дополнительная фигура 3 D). Среди IDR, о которых мы сообщаем, 3576 содержат энхансеры, задокументированные в VISTA (Visel et al., 2007) и/или Базы данных энхансеров FANTOM5 (de Rie et al., 2017) и 13 495 содержат последовательности ДНК с предсказанными регуляторными ролями по крайней мере в одной ткани или типе клеток мыши в соответствии с EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Анализ основных компонентов (с поправкой на половые различия между образцами) выявил четкую группировку образцов по времени развития (рис. 3А). Чтобы идентифицировать геномные локусы с изменениями доступности хроматина, мы сравнили сигнал ATAC-seq между образцами E14.5 и P0. Мы наблюдали 2,103 DAR, контролируя FDR на уровне 10 процента. Из них 1323 (55 процентов) показали повышенную доступность на P0 по сравнению с E14.5, а иерархическая кластеризация выявила четкое различие между DAR, которые открываются и закрываются между E14.5 и P0 соответственно (рис. 3B).

Следы факторов транскрипции идентифицировали с помощью HINT и сопоставляли с ДНК-связывающими белками с использованием мотивов из базы данных HOCOMOCO 11 (Кулаковский и др., 2018). Среди 431 протестированного мотива DAR, содержащие следы нескольких белков факторов транскрипции, связанных с нефрогенезом, демонстрируют увеличение доступности между E14.5 и P0. Среди отпечатков, находящихся в DAR, доступность которых в среднем увеличивается, первые шесть принадлежат следам фактора транскрипции, совпадающим с Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd. (0,13), Six4 (0,13), Июнь (0,12) и Фос (0,11). Следы, аннотированные в закрывающих DAR, включают факторы транскрипции E2F2 и E2F4, которые, как известно, влияют на ход клеточного цикла (Gaude et al., 2011) и способствуют пролиферации клеток (D. Wang et al., 2000) в других клеточных контекстах (дополнительный рисунок). 4).

Чтобы оценить биологический контекст открытия и закрытия DAR, мы использовали инструмент обогащения аннотаций геномных регионов (GREAT) (McLean et al., 2010), чтобы выделить наборы генов с обогащением связанных изменяющихся областей хроматина. При таком подходе мы идентифицируем биологические процессы Gene Ontology (GO), тесно связанные с развитием предшественников нефрона: в частности, наиболее обогащенным процессом среди открывающихся DAR является «Регуляция дифференцировки эпителиальных клеток» (GO: 0030856, биномиальное значение Q {{3 }}.5e-5) и «Положительная регуляция дифференцировки эпителиальных клеток» (GO:0030858, биномиальное значение Q=5e-3) входят в десятку наиболее значительно обогащенных ( Дополнительный рисунок 5). Оба согласуются с увеличением склонности предшественников нефрона к мезенхимально-эпителиальным переходам (MET) по мере их дифференцировки (S. Chen et al., 2015). Другие значительно обогащенные пути включают «позитивную регуляцию сигнального пути Notch» (GO:0045747, биномиальное значение Q=2e-5), что согласуется с ролью, которую передача сигналов Notch играет в стимулировании дифференцировки предшественников нефрона. Чанг и др., 2016). Обнаруженные 10 083 закрывающих DAR не выявили значимых терминов GO на основе критериев значимости GREAT по умолчанию (см. Дополнительный рисунок 5).

Рисунок 3. Различия в доступности хроматина характеризуют E14.5 по сравнению с P0клетки-предшественники нефрона.A) Анализ основных компонентов образцов ATAC-seq выделяет моменты времени развития как основной источник изменчивости. B) Тепловая карта, показывающая значительно изменяющиеся области IDR в образцах ATAC-seq. Образцы/столбцы E14.5 отмечены светло-зеленым цветом, а образцы/столбцы P0 отмечены темно-зеленым цветом. C) Термины биологического процесса GO обогащены геномными областями, которые открываются между E14,5 и P0 в соответствии с GREAT, ранжированными по биномиальному P-значению, FDR Меньше или равно 0.001.

Далее мы исследовалидоступность хроматинав областях генома, содержащих промоторы и энхансеры для генов с опубликованными ролями в дифференцировке клеток-предшественников нефрона. Среди них фактор транскрипции Six2 имеет решающее значение для поддержания мультипотентностиклетки-предшественники нефрона(Self et al., 2006), и во всех образцах мы наблюдали доступный хроматин, окружающий его промотор, и известный энхансер Six2 примерно в 50 т.п.н. выше сайта начала транскрипции Six2 (TSS) (O'Brien et al., 2018) (рис. 4А, В, области, заштрихованные синим цветом). Мы также отмечаем области доступного хроматина на промоторе и опубликованный энхансер для белка Gdnf (рис. 4D, E), который секретируется предшественниками нефрона для стимуляции ветвления зачатка мочеточника (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996). ). Этот энхансер расположен примерно на 113 т.п.н. выше промотора гена и, как известно, реагирует на передачу сигналов Wnt в контексте развития предшественников нефрона (Park et al., 2012). В то время как промотор для Gdnf существенно не меняется с течением времени, аннотированный энхансер значительно увеличивает недоступность. Мы также отмечаем области доступного хроматина, окружающие опубликованный энхансер, активный в предшественниках нефрона для Eya1, расположенный примерно на 325 т.п.о. выше TSS гена (Park et al., 2012) (дополнительная фигура 6). Eya1 является фактором транскрипции, который взаимодействует с Six2 для поддержания мультипотентности предшественников нефрона (J. Xu et al., 2014).

Мы наблюдаем несколько DAR, которые не перекрывают известные регуляторные функции, но охватывают области, которые, по прогнозам, обладают энхансерной активностью для определенных генов в различных типах клеток мыши, как указано в EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). В дополнение к опубликованному энхансеру Eya1 (Park et al., 2012) (дополнительный рисунок 6), замыкающий DAR в одном из интронов Eya1 (рисунок 5A-B) охватывает область, которая, по прогнозам, обладает энхансерной активностью в отношении гена Eya1 у мышей. нейральные клетки-предшественники и клетки-предшественники гранулоцитов-моноцитов (Gao & Qian, 2020). В соответствии со снижением активности энхансера мы ранее наблюдали, что экспрессия Eya1 снижается в дифференцирующихся предшественниках нефрона с использованием данных scRNA-seq E14.5 (дополнительная фигура 7) (Bais et al., 2020). Это согласуется с опубликованными данными ChIP-seq в первичных предшественниках нефрона E16.5, которые демонстрируют отсутствие метки активного энхансера, H3K27ac, и отсутствие связывания с Ctnnb1, Lef1, Six2 и Tcf7 (рис. 5) (Guo et al. ., 2021). Этот потенциальный энхансер также содержит следы фактора транскрипции для Hoxd10 в пределах его пика, фактора транскрипции, который необходим для дифференцировки и интеграции предшественников нефрона во время мезенхимально-эпителиальных переходов (MET) (Yallowitz et al., 2011).

DAR, увеличивающий недоступность хромосомы 24, перекрывает область хроматина с предполагаемой энхансерной активностью фактора транскрипции Pax8 в клетках, культивируемых из мышиных почек, кишечного эпителия и матки (Gao & Qian, 2020). Pax8 частично дублирует Pax2, но по крайней мере один из этих двух транскрипционных факторов необходим в предшественниках нефрона дляпочкаразвития (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Ранее мы наблюдали, что экспрессия Pax8 увеличивается в дифференцирующихся и дифференцированных предшественниках нефрона (дополнительная фигура 7), и мы отмечаем значительное увеличение доступности в DAR, которое охватывает эту регуляторную функцию. Эта область также связана с активной энхансерной меткой, H3K27ac, и связыванием Ctnnb1, Lef1, Six2 и Tcf7 в опубликованных данных ChIP-seq от первичных предшественников нефрона E16.5 (рис. 5) (Guo et al., 2021). Мы наблюдаем ряд следов транскрипционных факторов, которые попадают в высококонсервативный пик доступности этого DAR, в том числе два для Sall1, ядерного фактора, который, как известно, влияет на нефрогенез (Kanda et al., 2014), и семь тесно сгруппированных следов для MYC-ассоциированного цинкового пальца. белок (Maz), фактор транскрипции, который, как было показано, оказывает дозозависимое действие напочкаразвитие у людей и мышей (Haller et al., 2018). Дополнительная таблица 3 содержит полный список доступных областей, которые мы находим, а также их соответствующую статистику дифференциальной доступности, аннотации для генов, экзонов и промоторов, которые они перекрывают, а также списки выявленных следов ключевых факторов транскрипции, связанных с нефрогенезом.

Рисунок 4. Профили ATAC-seq в известных и предполагаемых регуляторных локусах. Для каждой панели сверху вниз грани обозначают кратное обогащениедоступность хроматинав образцах E14.5 и P0 с IDR и DAR, обозначенными как блики синим (неизменный IDR) и зеленым (начальный DAR). и красный (закрытие DAR). На следующем фасете показаны аннотации генов, нуклеосомные позиции (серые) и области без нуклеосом (красные), измеренные в объединенных образцах E14.5 и P0, а также баллы сохранения PhastCon60 (черный цвет означает 1{{ 12}}0 процентов консервативности, белые 0 процентов консервативности A) Промотор и тело гена фактора транскрипции Six2. B) Enhancer for Six2, опубликованный Park et. др. C) Дифференциально доступный энхансер для Gdnf с повышенной доступностью при P0. D) Промоутер для Gdnf.

Рисунок 5. DAR, перекрывающие потенциальные новые энхансеры для генов, связанных с нефрогенезом. A и C) Панели изображают карту области 1 MB, окружающей интересующий ген, с генами, кодирующими белок, выделенными зеленым цветом, и предполагаемое взаимодействие энхансер/промотор в виде черной петли. . B и D) Сверху вниз на панелях изображено обогащение складокдоступность хроматинаизмерены в образцах E14.5 и P0, при этом IDR выделены зеленым (открытие) и красным (закрытие), с последующими измерениями ChIP-seq в этих областях, измеренными Guo et. др. в первичном предшественнике нефронаклетки(Гуо и др., 2021). На третьей панели показаны аннотации генов (синие) и предполагаемые регуляторные элементы из Enhancer Atlas 2.0 (красные), а на четвертой панели обозначены следы факторов транскрипции, идентифицированные в данных ATAC-seq. На пятой панели изображены нуклеосомы (серые) и NFR (красные), а нижняя панель указывает на сохранение. A) Область 1MB, содержащая тело гена для Eya1 и потенциальный энхансер Eya1, примерно на 325 т.п.о. выше по течению. B) Область размером 4,5 т.п.н., содержащая потенциальный энхансер Eya1. C) Область 1MB, содержащая локус гена Pax8 и предполагаемый энхансер. D) Область размером 4,5 т.п.н., содержащая предсказанный энхансер и его перекрывающийся DAR.

Топологически связанные домены помогают идентифицировать потенциальные связи энхансер-миРНК.

Топологически ассоциированные домены (TAD) представляют собой области организации хроматина более высокого порядка размером в мегануклеотиды, возникающие в результате упаковки хроматина в ядро ​​в трехмерном пространстве (Dixon et al., 2012), а взаимодействия энхансер-промотор обычно ограничиваются элементы в пределах одного и того же TAD (Symmons et al., 2014). Мы аппроксимировали TAD из предшественников нефрона, используя аннотации, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши (ESC) (Y. Wang et al., 2018). Чтобы выявить возможные цис-регуляторные области миРНК, мы сопоставили изменения вдоступность хроматинас дифференциально экспрессируемой миРНК в пределах одного и того же TAD. В целом, 42 778 уникальных доступных областей (около 92 процентов) расположены внутри аннотированных TAD, и из них 3 0 626 (около 72 процентов) не перекрываются с известным промотором. Сюда входят 2103 DAR, 1180 и 923 которых открываются и закрываются с течением времени соответственно. Пятнадцать открывающих DAR разделяют TAD с одной или несколькими микроРНК с повышенной экспрессией между E14.5 и P0, а девять закрывающих DAR разделяют TAD с одной или несколькими микроРНК с пониженной экспрессией. Рисунок 6 обобщает этот подход и иллюстрирует расстояния между DAR и их согласованными микроРНК, которые варьируются от 27 т.п.н. до более 1 т.п.н. (в среднем: 447 т.п.н.). В таблице 1 подробно описаны наборы возможных отношений DAR-миРНК, при этом один DAR указан для каждой совпадающей миРНК.

Среди аннотированных пар miRNA-энхансер мы отмечаем три, представляющие особый интерес. Во-первых, был идентифицирован открывающий DAR в 120 кб ниже let-7c-5p и в 73 кб ниже miR-125b-5p, который связан с Six2. сайт связывания в ранее опубликованном наборе данных ChIP-seq предшественника нефрона E16.5 (рис. 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p является одной из обнаруживаемых нами микроРНК let-7 с максимальной экспрессией, и известно, что семейство let-7 также репрессирует транскрипты Lin28b (Slack & Ruvkun, 1997; Чжу и др., 2011). Мы отмечаем, что Hmga2 и Meis2 также идентифицированы как потенциальные новые мишени семейства let-7 в предшественниках нефрона (Рис. 2). Было также показано, что miR-125b-5p репрессирует транскрипты Lin28 в гемопоэтических клетках и типах клеток-предшественников мышей (Chaudhuri et al., 2012). Во-вторых, miR-9-3p является обратной комплементарностью miR-9-5p, микроРНК, которая, как недавно было показано, защищает отпочкафиброз путем воздействия на метаболические пути (Fierro-Fernández et al., 2020). Мы обнаруживаем более чем 10-кратное уменьшение транскриптов miR-9-3p между предшественниками нефрона E14.5 и P0, и мы идентифицировали потенциальный регуляторный элемент на расстоянии примерно 249 т.п.н. (рис. 7B). Мы наблюдаем следы факторов транскрипции для Snai1 и Snai2 в ассоциированных DAR, которые, как было показано, способствуют эпителиально-мезенхимальным переходам (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Наконец, мы сопоставили miR-181a-2-3p с возможным межгенным цис-регуляторным локусом 131kb выше по течению на хромосоме 2, где мы отметили след транскрипционного фактора для транскрипционного фактора Wt1, ключевого регулятора предшественника нефрона. выживаемость (Kreidberg et al., 1993) и связывание Six2 в опубликованном наборе данных ChIP-seq предшественника нефрона E16.5 (рис. 7C)) (Guo et al., 2021).

Таблица 1. Изменения экспрессии микроРНК, соответствующие одному или нескольким DAR в одном и том же TAD.

Рисунок 6. Поиск пар энхансер-кандидат-мишень-миРНК. А) Блок-схема, показывающая, как области доступности были расставлены по приоритетам для возможной регуляции экспрессии миРНК. B) Геномные местоположения каждой проверенной микроРНК относительно их энхансера-кандидата (оранжевая вертикальная полоса). Масштаб их логарифмического 2-кратного изменения показан по оси ординат, а миРНК с увеличением или уменьшением экспрессии выделены зеленым и красным цветом соответственно.

Рисунок 7. Четыре потенциальных пары микроРНК-мишень-энхансер. TAD выделены серым цветом, выровнены по начальным точкам и нарисованы в том же масштабе, чтобы проиллюстрировать относительный размер. Известные гены из Ensembl показаны фиолетовым цветом, а более темные области обозначают экзоны. Относительная доступность на E14.5 и P0 показана в виде гистограмм выше и ниже горизонтальной черной линии, соответственно, а также на врезках, иллюстрирующих накопление в указанном DAR вместе с данными ChIP-seq, опубликованными Guo et . др. (Го и др., 2021). Следы факторов транскрипции, идентифицированные HINT, перечислены в оранжевых баннерах. Гистограммы на отдельных панелях справа указывают на экспрессию миРНК (зеленый) и нормализованные события вставки Tn5 в предполагаемых энхансерных областях (оранжевый). A) Член семейства let-7 let-7c-5p очень сильно выражен вклетки-предшественники нефронаи соответствует "пику_54636" на расстоянии 119 КБ в межгенной области. B) miR-9-3p сопоставляется с DAR на расстоянии 249 КБ. C) miR-181a 2-3p расположена на расстоянии 131 т.п.н. от «пика_5887», возможного межгенного энхансера.

Обсуждение

В этом исследовании мы стремились одновременно идентифицировать новую микроРНК, которая способствует прекращению нефрогенеза, наряду с потенциальными цис-регуляторными свойствами. Мы идентифицировали 114 микроРНК, которые по-разному экспрессируются в клетках-предшественниках нефрона, а также 2,1{6}}3 DAR на стадии E14.5 по сравнению с P0.почки. Мы наблюдаем множество особенностей, которые предсказывают новые предполагаемые энхансеры для генов Eya1 и Pax8 вклетки-предшественники нефрона. Наконец, мы определили последовательныедоступность хроматинаизменения экспрессии микроРНК для 33 пар микроРНК и DAR, включая let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p и miR-9-3p и представляют предполагаемые гены-мишени, экспрессируемые в предшественниках нефрона для дифференциально экспрессируемых микроРНК. В совокупности наши данные демонстрируют, что изменения, присущие предшественникам нефрона и зависящие от стадии нефрогенеза, отражаются в хроматиновой среде клеток-предшественников и в ее транскриптоме микроРНК.

Среди изменений, которые мы наблюдаем в транскриптоме miRNA предшественников нефрона, мы отмечаем широкое увеличение экспрессии в семействе let{{0}} по мере старения предшественников. Это согласуется с предыдущими сообщениями: белок Lin28b и семейство микроРНК let-7 взаимно антагонистичны и образуют бистабильный переключатель, который управляет экспрессией let-7 у млекопитающих (Zhu et al., 2011), а у предшественников нефрона, переключение в сторону повышенной экспрессии let-7 напрямую влияет на сроки прекращения нефрогенеза (Ермалович и др., 2019). Мы также наблюдаем повышенную экспрессию miR-125b-5p, которая, как известно, подавляет экспрессию Lin28b в других клеточных контекстах (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). Семейство let-7 и miR-125b-5p входят в число 114 миРНК, которые дифференциально экспрессируются между E14.5 и P0 в предшественниках нефрона, что предполагает роль миРНК в развитии предшественников нефрона. не ограничивается let-7/Lin28b. Например, микроРНК, экспрессия которых снижается, включают двух членов семейства miR-200, которые, как сообщается, играют роль в дифференцировке подоцитов (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p и miR-429-3p. Далее мы наблюдаем снижение экспрессии miR-126a 5p, которая, как известно, способствует васкулогенезу (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Это может отражать общее мезенхимальное происхождение васкулогенных клеток и предшественников нефрона, а также обязательство подмножества этих клеток становиться предшественниками нефрона.

Анализ путей предсказанных генов-мишеней изменяющихся микроРНК с использованием DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) показывает обогащение MAPK и передачи сигналов TGF, которые являются ключевыми регуляторами предшественников нефрона (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018). ). Несколько других путей KEGG также чрезмерно представлены среди предполагаемых генных мишеней экспрессированных миРНК, включая пути, связанные с внеклеточным матриксом, актиновым цитоскелетом и фокальной адгезией: все важные аспекты клеточной миграции, дифференцировки, ветвления, прикрепления, поляризации и пролиферации. (Розарио и Дезимоне, 2010). Связанные с ECM гены нацелены на некоторые из наиболее высоко экспрессируемых и значительно увеличивающихся микроРНК, которые мы обнаруживаем, включая обнаруженный нами транскрипт с наивысшей экспрессией: miR-196a-5p. miR-196a-5p, как известно, нацеливается на Col1a1, Col1a2 и Col3a1 — гены, которые активируются в Pax2-дефицитных предшественниках нефронов, которые подвергаются трансдифференцировке в почечную строму (Naiman et al. др., 2017). Т.о., повышенная экспрессия miR-196a-5p может играть роль в укреплении границ клонов по мере старения предшественников. Кроме того, мы идентифицируем новые потенциальные взаимодействия миРНК-мРНК-мишени, которые могут способствовать прекращению нефрогенеза, включая активацию семейства let-7, которое может нацеливаться на Hmga2 и Meis2 (связанное с пролиферацией клеток) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) по мере старения предшественников нефрона. Hmga2 не играет известной роли впочкаразработка. Однако считается, что Meis2 имеет функциональное перекрытие с родственным транскрипционным фактором Meis1, который, как известно, необходим для развития почек (Hisa et al., 2004). Мы также наблюдаем подавление miR (miR-34b-5p, miR-983p и miR-200a-3p), которые могут быть нацелены на Jag1, который, как известно, активируется и играет важную роль в дифференцировке нефронов (Chung et al., 2016).

Наряду с изменением транскриптома микроРНК мы одновременно измеряли изменения в окружении хроматина клеток-предшественников нефрона между E14.5 и P0. Мы описываем два предполагаемых новых энхансера для Eya1 и Pax8, основываясь на (i) их близости к промоторам этих генов, (ii) их соответствующих изменениях вдоступность хроматинаво время развития в соответствии с изменениями экспрессии генов псевдовремени во время дифференцировки, (iii) следыпочкафакторы транскрипции развития, (iv) сохранение последовательности, (v) свидетельство функции энхансера в других тканях/типах клеток из Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020) и (vi) данные ChIP-seq в E16 .5 предшественники нефрона для метки активных энхансеров (H3K27ac) и связывания факторов транскрипции Ctnnb1, Lef1, Six2 и Tcf7. Мы наблюдаем снижение доступности хроматина для энхансера Eya1, что согласуется с ролью Eya1 в обеспечении мультипотентности предшественников нефрона и с сообщениями о том, что потеря Eya1 приводит к ранней эпителизации популяции предшественников (J. Xu et al., 2014; PX Сюй и др., 1999). Pax8 и его гомолог Pax2 вносят вклад в спецификацию клонов предшественников нефрона (Bouchard et al., 2002), а предшественники нефрона без по крайней мере одного из этих генов не будут подвергаться MET (Narlis et al., 2007). Повышенная доступность хроматина, которую мы обнаруживаем для предполагаемого энхансера Pax8, согласуется с повышенной экспрессией Pax8 в почечном эпителии по мере дифференцировки нефронов.

Анализ обогащения (McLean et al., 2010) DAR выявил «Регулирование эпителиальной дифференцировки» как наиболее значительно обогащенный термин среди открытых областей хроматина, что указывает на то, что обнаруженные нами DAR могут содержать регуляторные функции, управляющие сигналами дифференцировки и развития или реагирующие на них.клетки-предшественники нефронана типы эпителиальных клеток. Передача сигналов Notch является одним из наиболее значительно обогащенных терминов GO, идентифицированных среди открывающих DARs, и известно, что в предшественниках нефрона этот путь репрессирует экспрессию Six2 и способствует дифференцировке клеток-предшественников нефрона (Chung et al., 2016). Среди вовлеченных в этот путь генов есть Jag1, ключевой лиганд в передаче сигналов Notch, экспрессия которого, как сообщалось, обратно коррелирует с экспрессией Six2 и Hes1 (Chung et al., 2016). Отметим, что Jag1 является аннотированной мишенью для трех miRNAs с возрастающей экспрессией (miR34b-5p, miR98-3p и miR200a-3p, рис. 2). Наконец, мы наблюдаем обогащение генов, связанных с ремоделированием и морфогенезом кровеносных сосудов в открывающихся DAR, хотя это, по-видимому, является следствием генов, общих для этих путей развития и дифференцировки эпителиальных клеток, включая Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 и Hey2.

Изменения вдоступность хроматинасредиклетки-предшественники нефронабыли измерены в предыдущих исследованиях (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

В целом, наши результаты согласуются с этими предыдущими исследованиями, выделяя гены, связанные с Notchsignaling и Pax8-. Примечательно, однако, что в этих предыдущих исследованиях есть некоторые экспериментальные различия по сравнению с этим отчетом. Выделение GFP-экспрессирующих предшественников нефрона с использованием флуоресцентно-активированной клетки от мыши-репортера с трансгеном Six2-TGC потенциально сбивает с толку обнаружение того, что этот аллель имеет зарегистрированное уменьшение числа нефронов примерно на 45 процентов (Hilliard et al. , 2019; Воловельский и др., 2018). Кроме того, было показано, что культивируемые предшественники нефронов (выращенные с низкой или высокой дозой CHIR) имеют транскриптомы, отличные от транскриптомов первичных предшественников нефронов, что позволяет предположить, что доступность их хроматина также будет отличаться (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Поскольку целью нашего исследования было понять, как изменения ландшафта хроматина влияют на экспрессию микроРНК в ранних и поздних предшественниках нефрона, необходим анализ первичных предшественников нефрона.

Цистанхе лучше для почек

Комбинируя эти наблюдаемые изменения в окружении хроматина с соответствующими изменениями в экспрессии miRNA, мы вовлекаем несколько новых предполагаемых пар miRNA-энхансер в прекращение нефрогенеза для дальнейшего изучения. МиРНК miR-125a-5p и let-7c-5p, например, демонстрируют значительное увеличение экспрессии между E14.5 и P0. , и это подтверждается растущей недоступностью DAR (chr16: 77,719, 058 77, 720, 407) в том же TAD. Этот DAR также связан с сайтом связывания Six2 (Guo et al., 2021) и может обозначать энхансер, который влияет на экспрессию miR-125a-5p и/или позволяет{{18} }c-5p, что, в свою очередь, может способствовать дифференцировке посредством репрессии Lin28b. Точно так же мы наблюдаем возможный энхансер miR 181a, который, как известно, модулирует экспрессию ренина у людей (Marques et al., 2015) и считается терапевтической мишенью для снижения нефротоксичности из-за его способности подавлять BIRC6 и апоптоз (Liu et al. др., 2018). Наконец, мы наблюдаем замыкающий DAR, связанный с miR-9-3p, который имеет следы фактора транскрипции для белков Snai1 и Snai2, реагирующих на передачу сигналов Wnt. обратный комплемент miR-9-3p, miR-9-5p, известно, защищает отпочкафиброза (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 и Snai2, как было показано, способствуют метастазированию карциномы в клетки рака кожи мышей (Olmeda et al., 2008) и способствуют эпителиально-мезенхимальным переходам (EMT) у больных раком. (Sundararajan et al., 2019), в то время как известно, что miR-9 способствует ангиогенезу и миграции опухолевых эндотелиальных клеток (Zhuang et al., 2012). Может существовать механизм, при котором повышенная передача сигналов Wnt приводит к снижению экспрессии Snai1 и Snai2, что, в свою очередь, снижает экспрессию miR-9-3p для поддержки дифференцировки предшественников нефрона.

Наше исследование всесторонне идентифицировало изменения в ландшафте хроматина и транскриптоме микроРНК предшественников нефрона во время эмбрионального развития, и мы идентифицировали кандидатные цис-регуляторные области и микроРНК, которые могут играть роль в прекращении нефрогенеза. Обогащающий анализ данных mRNA-seq и ATAC-seq дает заманчивые подсказки относительно механизмов, которые могут быть задействованы, таких как пути, которые регулируют дифференцировку предшественников нефрона, включая Notch и TGF-. Мы также сообщаем о двух новых предполагаемых регуляторных элементах для Eya1 и Pax8, генов, которые, как известно, важны дляпочкаразвитие и потенциальные регуляторные последовательности для ключевых микроРНК, которые вовлечены в прекращение нефрогенеза.

Методы

Мышиные штаммы

Беременные самки дикого типа CD-1 были получены от Charles River Laboratories, Inc. (Уилмингтон, Массачусетс, США, RRID: MGI:5659424) ипочкибыли собраны из пометов в эмбриональный день E14.5 или P0. Всех животных содержали в виварии Исследовательского центра Рангос в Детской больнице Питтсбурга UPMC (Питтсбург, Пенсильвания, США), и все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете штата Нью-Йорк. Питтсбург. Пол каждого эмбриона или детеныша определяли с помощью ПЦР на геномной ДНК, выделенной из обрезков хвоста, с использованием следующих праймеров для гена Y-хромосомы Sry: SryF 5'-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3' и SryR 5'-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3', как опубликовано ранее (McFarlane et al., 2013).

Секвенирование и анализ малых РНК

Суммарная РНК, выделенная изклетки-предшественники нефронаоставшуюся после удаления клеточную фракцию ATAC-seq передали в центр секвенирования медицинских наук в детской больнице UPMC в Питтсбурге для подготовки библиотеки с использованием набора для подготовки библиотеки микроРНК QIAseq (Qiagen 3315{{10}}2). Одностороннее секвенирование библиотек мРНК-seq было выполнено на Illumina NextSeq500, и библиотеки были секвенированы примерно до 50 миллионов односторонних ридов на библиотеку. Затем секвенированные чтения были сопоставлены с геномом мыши mm10 с использованием пакета Rsubread (Liao et al., 2019) (версия 2.0.1) и аннотированы с известными микроРНК, перечисленными в miRBase (версия 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014). с функцией featureCounts пакета Rsubread. Дифференциальную экспрессию известных микроРНК измеряли с помощью пакета DESeq2 R (версия 1.26.0) (Love et al., 2014). Доля выровненных прочтений, аннотированных к известной микроРНК, а также доля эмбрионов женского пола на образец были включены в качестве кофакторов в модель тестирования, представленную DESeq2. Затем идентифицировали дифференциально экспрессируемые миРНК, контролируя частоту ложных открытий на уровне 5%, и направление их изменений (увеличение или уменьшение) определяли на основе их значения кратности изменения («увеличение», указывающее на более высокую экспрессию на P0 по сравнению с E14.5). . Обогащение регуляторных путей среди предсказанных генов-мишеней miRNA со значительным увеличением и уменьшением экспрессии было рассчитано с использованием инструментов DIANA miRPath версии 3.0 (Vlachos et al., 2015). Предсказанные транскрипты-мишени для микроРНК были извлечены из репозиториев TargetScan (Agarwal et al., 2015) и miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

Выделение предшественника нефрона

почкибыли вырезаны из пометов {{0}} эмбрионов E14.5 или детенышей P0, и каждый помет считался одним образцом. Одну почку на образец использовали для выделения тотальной РНК, которую использовали в качестве «контроля целой почки» в последующих анализах (см. ниже). Всего было отобрано по три пробы в каждый момент времени. Затем из каждого образца выделяли клетки коры головного мозга с использованием сортировки магнитно-активированных клеток (MACS), как было опубликовано ранее (Brown et al., 2011). Вкратце, почки подвергались частичному расщеплению 2 мМ коллагеназы А (Roche 11088793001) и 3,5 мМ панкреатина (Sigma P1625) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 15 минут при 37°С. Реакцию переваривания останавливали с помощью холодной 100-процентной фетальной телячьей сыворотки (FBS), клеточную суспензию собирали и ресуспендировали в холодном фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (DPBS) с 1 мМ ингибитором протеазы фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) (Sigma-Aldrich 10837091001). Клетки промывали и ресуспендировали в ледяном буфере для выделения, состоящем из 2% FBS в PBS, затем инкубировали с магнитными шариками (набор Dynabeads FlowComp Flexi, ThermoFisher 11061D), биотинилированными к антителам к интегрину альфа 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076). с использованием набора для мечения биотиновых белков DSB-X (ThermoFisher D-20655). Предшественники нефрона, связанные с этими гранулами, были выделены, как опубликовано ранее (Hemker et al., 2020), и объединены в почках для каждого образца. Аликвоту из 50 000 клеток-предшественников нефрона немедленно обрабатывали черездоступность хроматинапротокол подготовки библиотеки (см. ниже), а тотальную РНК экстрагировали из оставшейся клеточной суспензии с использованием набора Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Для подтверждения обогащенияклетки-предшественники нефронапо сравнению с другими типами клеток тотальная РНК была выделена из клеток-предшественников нефрона, а также из цельных клеток.почки(контроль всей почки, см. выше), а также количественную ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) для следующих маркеров: маркеры предшественников нефрона Six2 и Cited1 (L. Huang et al., 2016), а также для Lhx1, Pdgfr, Pecan и Caleb, которые маркируют почечный пузырек (Brunskill et al., 2014), почечную строму (S. Chen et al., 2015), эндотелий (Kobayashi et al., 2008) и зачаток мочеточника (Cebrian et al., 2014a). ) клетки соответственно; также см. Дополнительный рисунок 1. Gapdh (Barber et al., 2005) использовали в качестве гена домашнего хозяйства, а относительную количественную оценку рассчитывали с помощью метода 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). Праймеры для этих транскриптов включены в Таблицу 2.

Таблица 2. Праймеры для ОТ-ПЦР.

Доступность хроматинаподготовка библиотеки

Приблизительно 50,000клетки-предшественники нефронабыли использованы для создания каждой библиотеки секвенирования для ATAC-seq с использованием набора Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) с модификациями в соответствии с ранее опубликованным методом (Buenrostro et al., 2013). Вкратце, клетки суспендировали в ледяном неионном буфере для лизиса, состоящем из 10 мМ Трис, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ ингибитора протеазы PMSF и 0,05% Triton X-100 по объему, в течение 10 минут для лизиса клеток. мембран, оставляя нетронутыми ядерные мембраны. Интактные ядра предшественников нефрона ресуспендировали в транспозиционном буфере, содержащем фермент транспозазу, и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Свободную геномную ДНК, высвобожденную в процессе транспозиции, очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit (Qiagen 28004), а затем индексировали с помощью праймеров с прямым (i7) и обратным (i5) индексом из набора Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011). Индексное лигирование и амплификацию фрагментов осуществляли с использованием программы термоциклирования амплификации методом ПЦР.

Для определения оптимального количества циклов амплификации, необходимых для библиотеки ATAC-seq, была проведена побочная реакция количественной ПЦР с использованием SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) и 96-луночного термоциклера C100 (Bio-Rad) для расчета нормализованного репортерное значение (Rn) для каждого цикла. Номер цикла, при котором реакция достигала одной трети своей максимальной флуоресценции, определяли как оптимальное количество оставшихся циклов амплификации, а оставшийся объем индексированной реакции транспозиции ATAC-seq подвергали этому количеству дополнительных циклов в конечной амплификации. программа. Окончательные библиотеки очищали с использованием магнитных шариков Amture XP (Beckman Coulter A63881).

Доступность хроматинапоследовательность действий

Секвенирование парных концов библиотеки ATAC-seq было выполнено на Illumina NextSeq500 Центром секвенирования медицинских наук в Детской больнице UPMC в Питтсбурге с мультиплексированием с концентрацией библиотеки, которая, как ожидается, даст 90 миллионов считываний парных концов на образец. . Чтения были обработаны по качеству с помощью TrimGalore (BabrahamLab, 2014 г.) (версия 0.4.3) в «--парном режиме» и с остальными настройками по умолчанию. Прочтения были сопоставлены с геномом mm10 (Church et al., 2011) с использованием Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (версия 2.3.1) с настройками "--local -q -X 2000 -- м". Прочтения, полученные в результате ПЦР-дубликатов одного и того же фрагмента ДНК, были помечены с использованием функции MarkDuplicates от Picard Tools (Broad Institute, 2016) (версия 2.10.9) с настройками по умолчанию. Чтения, которые неоднозначно сопоставлялись более чем с одним местом в геноме, были случайным образом назначены одному из этих мест, если было меньше четырех возможностей, и были исключены в противном случае (ENCODE, nd) (с использованием скрипта Python, доступного на https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) с настройками "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (версия 1.3.1) использовался для фильтрации дублированных, неотображенных, потерянных и митохондриальных прочтений, а также для сортировки и индексации файлов BAM. Контроль качества данных ATAC-seq осуществлялся в соответствии с руководящими принципами ATAC-seq проекта ENCODE (ENCODE, nd), и выборка библиотек образцов была случайным образом уменьшена, чтобы каждая содержала 31 миллион считываний с парными концами, чтобы нормализовать различия в размерах библиотек.

Цистанхе может предотвратить почечную инфекцию

Идентификация доступных областей хроматина

Файлы BAM, содержащие отфильтрованные чтения ATAC-seq, были преобразованы в формат BED с парными концами с помощью Bedtools (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (версия 2.26.0) 'bombed ' с настройками "-bed pe -mate1". Области доступного хроматина идентифицировали с помощью инструмента Model-based Analysis of ChIP-seq (MACS2, версия 2.1.1.20160309) алгоритма вызова широких пиков (Zhang et al., 2008) с настройками "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --широкий --сдвиг 37 --размер текста 75 --сохранить-дубликат --модель". Чтобы определить доступные области с высокой степенью достоверности, были выполнены попарные сравнения (каждой комбинации повторов с заданной точки времени) и была рассчитана частота невоспроизводимых открытий (IDR) (Q. Li et al., 2011) с использованием общедоступного Реализация Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) с настройками "--широкий пик типа входного файла --rank p.value {{ 35}}мягкий-IDR-порог 0.1 --выходной-файл типа кровати". В частности, для каждой временной точки объединенный файл BED со всеми доступными регионами был отправлен с помощью аргумента «--список пиков» для каждого сравнения (например, при сравнении двух образцов E14.5 все широкие пики E14.5 между всеми тремя повторами). Области доступности, которые соответствовали IDR по крайней мере в двух попарных повторных сравнениях (с минимум 20-процентным перекрытием), были объединены в унифицированный набор доступных областей с высокой степенью достоверности («области IDR»).

Изменения в доступных областях хроматина

Доступность каждой области IDR в данном образце определяли количественно путем подсчета количества событий транспозиции, происходящих при нормализации содержания GC последовательности в образцах. Это было достигнуто с помощью пользовательского сценария (доступного в репозитории сопутствующего программного обеспечения, см. дополнительные данные). Изменения в этой доступности затем определялись путем сравнения этих значений в разные моменты времени с использованием программного пакета Limma-voom (версия 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Чтобы учесть пол эмбриона, доля эмбрионов женского пола в каждом образце была включена в качестве кофактора в линейные модели, используемые для дифференциального анализа доступности, и была удалена как пакетный эффект в визуализациях с помощью функции удаления пакетного эффекта пакета Limma. Дифференциально доступные области хроматина (DAR) считались значительно открывающимися (повышенная доступность между E14.5 и P0) или закрывающимися (пониженная доступность между E14.5 и P0) при контроле частоты ложных открытий на уровне 10 процентов. . Анализы функционального обогащения открывающихся и закрывающихся областей генома определялись путем предоставления соответствующих координат инструменту обогащения аннотаций геномных областей (GREAT, доступно по адресу http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010). ). Аннотации известных и предполагаемых энхансеров были получены из репозиториев FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) и EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Следы фактора транскрипции

Следы фактора транскрипции были идентифицированы путем объединения всех файлов BAM за один и тот же момент времени, а затем запуска программного обеспечения Regulatory Genomics Toolbox для идентификации следов TF (HINT) (версия 0.12.3), в частности модели следа для ATAC. данные -seq (доступны на сайте www.regulatory-genomics.org) (Z. Li et al., 2018). Это программное обеспечение было запущено с настройками "правая подсказка следа --организма=мм10 --последовательно --парного конца". Затем следы были аннотированы известными мотивами связывания мыши из базы данных HOCOMOCO 11 (Кулаковский и др., 2018) с использованием функции сопоставления мотивов HINT с настройками «анализ правого мотива, соответствующий --организму=mm10». Следы с оценкой HINT ниже 10 были исключены. Наконец, дифференциальные паттерны активности среди совпадающих по мотиву следов были измерены с использованием дифференциальной функции программы RGT-HINT с настройками «правый намек на дифференциальный --организм=мм10 --bc {{27} }NC 12 --выходные профили". Значительно изменяющиеся уровни активности определяли на основе порогового значения p, равного 0,05 (метод Фридмана-Немени).

Цистанхе может улучшить функцию почек

Нуклеосомная конфигурация

Выровненные чтения из одного и того же момента времени были объединены в один файл BAM, а пакет NucleoATAC (версия 0.3.4) использовался для выявления закономерностей длины чтения, указывающих как на связанные нуклеосомные диады, так и на участки без нуклеосом ( НО) (Schep et al., 2015). Это программное обеспечение было выполнено с настройками по умолчанию. Нуклеосомы были аннотированы как область из 146 п.н., сосредоточенная вокруг каждой диады, называемой нуклеосомной.

Экспрессия одноклеточной РНК

Данные об экспрессии генов одиночных клеток были обработаны для предыдущей рукописи (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) и были получены из Gene Expression Omnibus. (ГЕОИД GSE158166). Обработанные данные, включенные в дополнительную фигуру 7, включают типы клеток, уровни экспрессии генов, низкоразмерные (tSNE) вложения и аннотации псевдовремени относительно траектории, установленной между кластерами пролиферирующих и дифференцирующихся предшественников нефрона. Доступ к данным и их организация осуществлялись с помощью пакета SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

Взаимодействия микроРНК-мРНК при старении и дифференцировке клеток-предшественников нефрона

Гены с изменяющейся экспрессией между самообновляющимися, праймированными и дифференцирующимисяклетки-предшественники нефронабыли получены из дополнительных таблиц 3 и 4, опубликованных Bais et al. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Секвенирование иммунопреципитации хроматина в первичных предшественниках нефрона

Данные секвенирования иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq) для связывания -катенина, Lef1, Six2 и Tcf7 в первичных предшественниках нефрона были получены из файлов BedGraph в репозитории GEO (GSE131119) для Guo et al., 2021. Значения сигналов кратности обогащения были усреднены. по повторным образцам.

Скрининг регуляторных элементов, влияющих на экспрессию микроРНК

Для скрининга потенциальных энхансеров миРНК мы аннотировали миРНК и DAR топологически ассоциированными доменами (TAD), в которых они расположены, на основе аннотаций mm10 из эмбриональных стволовых клеток мыши, загруженных из 3D Genome Browser (доступно на http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Регионыдоступность хроматинаи miRNA считались кандидатами в энхансеры — пары miRNA, если они занимали один и тот же TAD и демонстрировали устойчивые изменения в доступности и экспрессии (увеличение доступности при увеличении экспрессии miRNA и наоборот). DAR рассматривались как возможные «регуляторные функции» только в том случае, если они не перекрывали известный конец промотора или экзона. Потенциальные пары миРНК и предполагаемых регуляторных элементов получали приоритет, если они 1) попадали в один и тот же TAD и 2) претерпевали значительные изменения между E14.5 и P0 (увеличение экспрессии миРНК и увеличение доступности области IDR, и наоборот) .

Благодарности

Шелби Хемкер и Абха Баис внесли свой вклад в экспериментальный дизайн. Секвенирование ATAC-seq и mRNA-seq было выполнено центром секвенирования медицинских наук в детской больнице UPMC в Питтсбурге.

Конкурирующие интересы

Конкурирующие интересы не заявлены

Финансирование

AC был поддержан грантами Национального института диабета и пищеварения иПочкаЗаболевания Национального института здоровья (T32DK061296-17). ДК был поддержан грантами Национального института общих медицинских наук при Национальном институте здравоохранения (R01GM115836). JH был поддержан грантами Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек при Национальном институте здравоохранения (R01DK103776 и 125015). DMC был поддержан Премией за развитие карьеры Сети по изучению нефротического синдрома (NEPTUNE) и стипендией Детской больницы Питтсбургского научно-исследовательского консультативного совета. YP был поддержан грантами Детской больницы UPMC в Питтсбурге и Североамериканского консорциума по митохондриальным заболеваниям.

Доступность данных

Предсказанные энхансеры мыши были получены из FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; файл доступен здесь), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; файл доступен здесь) и EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980; файлы мыши доступны здесь). базы данных. Геном mm10 мыши и его аннотации были загружены через проект Illumina genomes (доступен здесь). Файл сверхцепочки для повышения координат мм9 до мм10 был получен из браузера генома UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; файл доступен здесь). Аннотации TAD из эмбриональных стволовых клеток мыши были получены из браузера 3D Genome Browser (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; файл доступен здесь). Предсказанные мишени транскриптов микроРНК были получены из TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, файл доступен здесь) и из miRDB версии 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, файл доступен здесь). Данные ATAC-seq, включая местоположения IDR/DAR, аннотации и результаты дифференциального обогащения, доступны на GEO (GSE168339), как и данные мРНК-seq, включая аннотации и результаты дифференциальной экспрессии (GSE168342). Компьютерный код, используемый для обработки и анализа данных, а также для создания рисунков, доступен по адресу https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers.

Библиография

Абруццезе, М.П., ​​Билотта, М.Т., Фионда, К., Зингони, А., Сориани, А., Петруччи, М.Т., Риккарди, М.Р., Мольфетта, Р., Паолини, Р., Сантони, А., и Чиппителли, М. (2019). Фактор транскрипции гомеобокса MEIS2 является регулятором выживаемости раковых клеток и активности IMiDs при множественной миеломе: модуляция ингибиторами бромодомена и экстратерминального (BET) белка. Смерть клеток и болезни, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Агарвал, В., Белл, Г.В., Нам, Дж.В., и Бартель, Д.П. (2015). Прогнозирование эффективных сайтов-мишеней микроРНК в мРНК млекопитающих. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Андерссон Р., Гебхард К., Мигель-Эскалада И., Хуф И., Борнхольд Дж., Бойд М., Чен Ю., Чжао Х., Шмидл К., Судзуки Т. ., Нтини Э., Арнер Э., Вален Э., Ли К., Шварцфишер Л., Глатц Д., Райтель Дж., Лилье Б., Рапин Н., … Санделин, А. (2014). Атлас активных усилителей по типам клеток и тканей человека. Природа, 507 (7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

БабрахамЛаб. (2014). Обрезка в изобилии. В биоинформатике. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_изобилие

Байс, А.С., Серкейра, Д.М., Клагстон, А.С., Хо, Дж., и Костка, Д. (2020). Секвенирование одноклеточной РНК выявляет дифференциальную активность клеточного цикла в ключевых клеточных популяциях во время нефрогенеза. БиоРксив. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Барбер, Р.Д., Хармер, Д.В., Коулман, Р.А., и Кларк, Б.Дж. (2005). GAPDH как ген домашнего хозяйства: анализ экспрессии мРНК GAPDH на панели из 72 тканей человека. Физиологическая геномика. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Бартель, Д.П. (2009). Распознавание мишеней микроРНК и регуляторные функции. Ячейка, 136 (2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.МикроРНК

Бертрам, Дж. Ф., Дуглас-Дентон, Р. Н., Диуф, Б., Хьюсон, М. Д., и Хой, В. Е. (2011). Число нефронов человека: значение для здоровья и болезней. Детская нефрология, 26 (9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Болеу, Н., Кундадже, А., Бикель, П.Дж., и Ли, К. (2015). Невоспроизводимый коэффициент обнаружения (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Бушар, М., Суабни, А., Мандлер, М., Нойбюзер, А., и Басслингер, М. (2002). Спецификация нефрического происхождения Pax2 и Pax8. Гены и развитие. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Из: Предварительная проверка журнала

2021 Опубликовано Elsevier Inc.