Влияние цистанхи на апоптоз дофаминергических нейронов, индуцированных нейротоксином 1-метил-4-фенилпиридинием (MPP)

Контакт: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Тянь Цзиюй, Чэнь Цзяньцзун

(Традиционная китайская медицина и китайский исследовательский центр Materia Medica больницы Сицзин, FMMU, Сиань 710032)

Абстрактный

Объективный: Исследовать эффектыЦистанхе на первичной культуре дофаминергических нейронов апоптозной клетки, индуцированной 1-метил-4-фенилпиридинием (MPP+).Метод: Для приготовления сыворотки кролика, состоящей изЦистанчеиспользует метод сывороточной фармакологии. Затем анализируют влияние цистанхи на клетку апоптоза нейронов DA изМПП+индуцированные модели с использованием морфологических, проточной цитометрии, окрашивания TUNEL.Результат: Обработка 200 мкмоль/лМПП+в течение 24 ч или более индуцированный апоптоз в нейронах DA. ПослеМПП+обработанный, коэффициент апоптоза группы, содержащей эквивалентную дозировку сыворотки Цистанче составляет 6,3%, группаМПП+только лечится составляет 30,2%. Количество клеток апоптоза группы В и С значительно меньше группы Е (P<0.05).>Заключение: Содержащаяся в сыворотке кровиЦистанчезащищенный апоптоз DA нейронов, индуцированныйМПП+.

Ключевые слова：Цистанче;1-метил-4-фенилпиридиний(MPP+); дофаминергические нейроны; апоптоз

В настоящее время основная терапия дляБолезнь Паркинсонапредставляет собой заместительную терапию препаратами соединения леводопы (L-допы), которые не могут контролировать развитие заболевания. По мере прогрессирования заболевания дозировка увеличивается, и вообще говоря, в течение 3 – 5 лет лечебный эффект уменьшается, двигательные симптомы колеблются, появляются дискинезии, вызванные лекарственными препаратами. Недавние исследования показали, что L-допа оказывает влияние на индуцирование апоптоза на нейронах, культивируемых in vitro[1, 2], а затем было высказано предположение, что нейротоксический эффект эндогенного дофамина приводит к потере дофаминергических нейронов вБолезнь Паркинсона. Одна из причин [3]. В долгосрочной клинической практике мы использовали китайскую медицину дляпитание печени и почекв сочетании с препаратами леводопы для лечения БП и достиг хороших результатов [4-6]. В этом эксперименте изучалось защитное действие традиционной китайской медицины на дофаминергический апоптоз нейронов и его механизм на молекулярном и клеточном уровнях.

1. Материалы и методы

1.1 Материалы

ДМЭМ средняя,1-метил-4-фенилпиридин ум, MPP+, фетальная бычья сыворотка, приобретенная у компании Gibco.Цитарабин, поли-l-лизин, ФАПЧбыли приобретены у компании Sigma. 24-луночная культуральная плита, 25см2

Пластиковые колбы для культивированиябыли приобретены у компании NUNC.Китайская медицинамы были использованы, были куплены у Сианьской фабрики отваров. Животные, которых мы использовали, предоставляются центром животных школы.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Подготовка и экспериментальная группировка медикаментозной сыворотки

Цистанч готовят в виде лиофилизированного порошка для консервации и разбавляют дистиллированной водой при использовании. Сыворотка для животных была приготовлена из новозеландского ушастого белого кролика.сыворотка, все из которых были здоровыми самцами, весом 2,5-3,0 кг. Эквивалентную дозу животным преобразуют в соответствии с площадью поверхности тела и случайным образом делят на пустую контрольную группу сыворотки; 1/2 эквивалентной дозы групповой сыворотки (доза цистанческого сырья лекарственного средства 0,8 г/кг); группа эквивалентных дозсыворотка(Доза цистанче представляет собой оригинальный лекарственный материал Цистанче цистанче 1,6 г/кг); 2-кратная эквивалентная дозасыворотка(доза препарата Цистанче составляет исходный лекарственный материал 3,2 г/кг). Обжиг два раза в день в течение в общей сложности 3 дней, через 1 час после последнего обливания, каротидного кровопускания, на ночь при 4°C, центрифугирование при 2500 об/мин в течение 25 минут, тщательное отделение сыворотки, инактивация при 56°C в течение 30 минут и всасывание через фильтрующую мембрану 0,22 мкм Отфильтруйте бактерии и храните при -20°C. В тех же условиях путем гаважа готовили пустую контрольную сыворотку кролика с равным объемом нормального физиологического раствора. Эксперимент был разделен на 5 групп. Группа А была пустым кроликомсывороткаконтрольная группа культуры; Группа B быласывороточная культура + MPPгруппа лечения, содержащая в 2 раза эквивалентную дозу; Группа C быласывороточная культура + MPPгруппа лечения, содержащая эквивалентную дозу; Группа D представляла собой контрольную группу сывороточной культуры, содержащую 1/2 эквивалентной дозы сывороточной культуры + группу лечения MPP; Группа Е - пустая культура сыворотки кролика + группа лечения MPP.

Польза цистанхе

1.3 Культивирование дофаминергических нейронов среднего мозга

Три крысы SD 14 дней беременности были отобраны и убиты прямым введением воздушной эмболии в сердце; эмбриональных крыс вынимали в асептических условиях и помещали в чашку Петри, наполненную ледяным раствором D-Hanks. Ткань мозга фетальной крысы была рассечена и отделена под стереомикроскопом. Метод отсчета [7] был несколько улучшен. Мозговые оболочки и сосудистая ткань были отслоены, а ткани в областях A8, A9 и A10 вентрального среднего мозга были разделены. Добавьте 1 мл 0,125% панкреатина и поместите его в инкубатор с температурой 37 °C примерно на 20 минут, добавьте соответствующее количество культуральной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, чтобы прекратить пищеварение, и используйте аспирацию

Пипетку вылейте в однородную клеточную суспензию, центрифугируйте со скоростью 1500 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре, осторожно удалите надосадочное вещество, пипетку 15 раз тонкошейной пипеткой и дайте ей постоять 5 минут. В 24-луночную культуральную пластину лизина добавляют культуральную среду к каждой лунке, чтобы скорректировать плотность клеток до 2×105 клеток/мл, добавляют культуральную среду до 0,5 мл на лунку и добавляют цитарабин через 3 дня культивирования (конечная концентрация 10 мкмоль/л), ингибируют рост ненейронов.

1.4 Иммуноцитохимическое окрашивание тирозингидроксилазы (TH)

Используя метод SABC, разбавитель антител содержит бычий сывороточный альбумин 1 г/100мл (Boster Company, Ухань), 0,3% Тритон-100 (Sigma, США), NaN3 80мг/100мл, разбавленный PBS до 100мл, дорегулируйте рН до 7,6. Культуру прекращали на 7-й день, промывали D-PBS в течение 5 мин 3 раза, свежеприготовленный 4% параформальдегид фиксировали при комнатной температуре в течение 30 мин и промывали D-PBS в течение 5 мин 3 раза; с перекисью водорода 1:1:8, метанолом и раствором PBS инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, промыть D-PBS в течение 5 минут, добавить 5% блокирующую козью сыворотку в течение 30 минут при комнатной температуре, промыть D-PBS в течение 5 минут, и добавить козье антимышечное антитело TH, разбавленное разбавителем антител (разбавление 1:1000, Calbiochem), на ночь при 4°C, промыть D-PBS в течение 3 мин 3 раза, добавить биотинилированный мышиный анти-крысиный IgG, разбавленный разбавителем антител (разведенный 1:200, Sigma США), действовать при комнатной температуре в течение 4 часов, промыть D-PBS в течение 3 мин 3 раза, добавить комплекс HRP, разбавленный разбавителем антител в течение 2 ч при комнатной температуре, и промыть D-PBS в течение 3 мин 3 раза. Промойте разбавитель DAB в течение 3 минут, добавьте в клетки готовый к использованию хромогенный реагент DAB (Wuhan Boster Company) и наблюдайте за цветом под перевернутым микроскопом.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Обращение с наркотиками

Морфологические наблюдения культивируемых нейронов проводились под фазоконтрастным микроскопом каждый день, и изменения записывались с помощью фотографий. После культивирования в течение 12 часов клетки наблюдали под перевернутым микроскопом, и препараты добавляли непосредственно перед слиянием. Содержание сыворотки в каждой группе составляло 10%. После культивирования в течение 3 дней МПП+ добавляли к конечной концентрации 200 мкмоль/л. После инкубации в инкубаторе 37°C, 5% CO2 в течение 24 часов, проводят различные проверки.

Цистанче

1.6 Обнаружение проточной цитометрии

Медикаментозное лечение было таким же, как и раньше. После того, как каждая группа была обработана, адгезивные клетки PC12 переваривали с 0,125% трипсина, и клетки брали около 1×106 PBS. Клетки промывали дважды, добавляли 490 мкл связывающего буфера, тщательно перемешивали клетки и добавляли 5 мкл аннексина V. FITC и 10 мкл растворенного PI в клеточной суспензии аккуратно перемешать, поместить в пробирку при 4 °C, инкубировать в течение 10 мин в темноте и протестировать на проточном цитометре COULTER EPICS (Beckman Coulter, США).

1.7 Маркировка конца in situ (TUNEL) для выявления клеточного апоптоза

Маркировка ДНК in situ культивируемых нейронов использует набор для обнаружения апоптоза Бостера (MK1022), и шаги следующие: Возьмите дофаминергические нейронные клетки каждой группы после обработки MPP+ (слайд перед первичной культурой предварительно культивируется обработкой полимерным лизином), фиксируется параформальдегидом 40 г / л в течение 1 часа, свежая 3% уксусная кислота (pH2,5) при комнатной температуре в течение 10 минут, нейтрализовать щелочную фосфатазу, добавить 0,1 моль/л TBS (pH7,5) 1:200 свежеразбавленной протеиназы K при переваривании при 37°C в течение 20 секунд, добавить 1 мкл TdT и DIG-d-UTP к каждому слайду и 18 мкл буферного раствора в течение 2 ч при 37°C; добавлять 50 мкл блокирующего раствора на каждый слайд, при комнатной температуре в течение 30 мин; Добавить 50 мкл биотинилированного антидигоксигенинового антитела, разведенного блокирующим раствором; реагировать в течение 30 мин во влажном ящике при 37°C; добавляйте 50 мкл SABC-AP, разбавленного 0,1 моль/л TBS к каждому слайду; BCIP/NBT (0,1 моль рН9,5/л TBS, разбавленного 1:20) добавляли к образцу для развития цвета в течение 30 минут; в то же время альтернативный контроль (вместо смеси TdT/биотин-dUTP был использован буфер TdT) для фотомикрографии и инвертированного фазово-контрастного микроскопа (200×) наблюдения за апоптотическими клетками. Подсчитайте положительные клетки под фазово-контрастным микроскопом, подсчитайте 5 полей на скважину в каждой группе, в общей сложности 6 лунок.

2. Результаты экспериментов

2.1 Морфологическое наблюдение культивируемых нейронов

Наблюдается фазоконтрастным микроскопом OlympusIX70: через 5 часов после посева большая часть клеток прилипает к стенке, клетки рассеиваются, тело клетки круглое, ядро невидимо, а показатель преломления сильный. После культивирования в течение 24 часов клеточные выступы росли и постепенно удлинялись. Через 48 ч большая часть клеток выступала с разветвленными нитевидными выступами. Морфология клеток была разнообразной, которая была биполярной, триполярной и многополярной, и постепенно образовывала разреженную сеть. Тело клетки было увеличенным, круглым и эллиптическим. После повреждения MPP+ клетки сначала набухли, показатель рефракции увеличивался, клетки находились в дегенеративном состоянии, а клетки окончательно сжимались и отваливались. Различные дозы сыворотки, содержащей соединения китайской медицины, оказывают защитное действие на повреждение MPP+. После того, как культуру окрашивали иммунными клетками TH, было замечено, что TH-положительные клетки были коричневыми с нейритовым ростом. После добавления эквивалентной дозы сыворотки традиционной китайской медицины доля TH-положительныхНейроновможет достигать 55% ~ 60%.

2.2 Анализ результатов испытаний проточной цитометрии (см. рисунок 1)

Фосфатидилсерин (ПС), расположенный внутри клеточной мембраны на ранней стадии апоптоза, мигрирует наружу клеточной мембраны. Фосфатидилсвязывающий белок V (Annexin V) представляет собой кальций-зависимый фосфолипид-связывающий белок, который обладает высоким сродством к PS. Поэтому Annexin V может быть использован в качестве зонда для обнаружения PS, выставленного на поверхность клеточной мембраны. В то же время в сочетании с методом исключения ПИ для двойникаокрашиваниеапоптотических клеток, апоптотические клетки могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии. В правом нижнем квадранте рис.1 (FITC+/PI-) отображаются сведения об апоптозе каждой группы. Доля клеток, частота апоптоза каждой группы составила 4,1%, 5,8%, 6,3%, 28,6%, 30,2%.

2.3 Анализ результатов окрашивания TUNEL

Те, у кого сине-фиолетовые частицы в ядре, являются положительными клетками, то есть апоптотическими клетками. Доля апоптотических клеток в каждой группе подсчитывалась под световым микроскопом. Количество апоптотических клеток на поле зрения в каждой группе составляло: группа А 2,13±0,34; Группа B 4.92±0.67; Группа C 6.20±1.47; Группа D 10.33±1.51; Группа E 12.74±2.51. Послеt-тестовый анализ,группы B и C сравнивались с группами E (P<0.05). the="">Результатыв основном согласуются срезультаты проточной цитометрии.

3. Обсуждение

Болезнь Паркинсонаотносится к категории «синдром тремора» в китайской медицине. Традиционная китайская медицина считает, что наступление БП – это в основном череда проявлений постепенного истощения печени и почек у пожилых людей и потери питания мозгового меридиана костного мозга. Основное лечение заключается в том, чтобыпитание печени и почек, успокоить печень и устранить ветер. Традиционная китайская медицина может сыграть свою роль в "снижение токсичности и повышение эффективности" в леченииБолезнь Паркинсона, но механизм его действия в настоящее время не очень ясен. Большое количество экспериментальных данных в современной медицине указывают на то, что окислительный стресс является одним из факторов, вызывающих гибель нервных клеток БП [3]. Исследования показали, что общие гликозиды цистанхи могут эффективно удалять различные активные свободные радикалы кислорода и защищать ДНК от окисления, вызванного ОН[8]. Экстракт цистанча тубулозид В может ослабить цитотоксичность, вызваннуюМПП+,ослабляют накопление активных форм кислорода в клетке и оказывают антагонистическое действие на апоптоз и окислительный стресс, вызванныйМПП+[9]. Традиционная китайская медицина может активировать и усиливать собственный защитный сигнальный путь, противостоять внешним повреждениям и восстанавливать равновесие. Это одна из целей модернизации традиционной китайской медицины. После заместительной терапии дофамином люди теперь в целом ценят нейропротекторную терапию, которую называют второй революцией в леченииБолезнь Паркинсона. В этом эксперименте изолированные дофаминергические нервные клетки среднего мозга культивировали с помощью сывороточной китайской медицины, и было установлено, что Цистанче обладает определенным нейропротекторным действием. В этом эксперименте были использованы два метода обнаружения проточной цитометрии и окрашивания TUNEL, чтобы одновременно обнаружить, что сыворотка группы эквивалентной дозы и сыворотка группы эквивалентной дозы лекарственной сывороточной культуры Cistanche могут уменьшить первичный культивируемый дофаминовый нерв среднего мозга, вызванныйМПП+Количество апоптотических клеток оказывает определенное защитное действие на апоптотические клетки. Традиционная китайская медицина может защитить дофаминергические нейроны от повреждения на ранней стадии, что является более важной мерой, чем другие методы лечения. В этом смысле холистическое лечение китайской медицины является лекарством от первопричины, и его можно рассматривать как один из нейропротекторных методов лечения, которые люди ценят в настоящее время.

Ссылки

1. Зив И., Зилха-Фальб Р., Оффен Д. и др. Леводопа индуцирует апоптоз в культивируемых нейрональных клетках – возможный ускоритель нигростриатальной дегенерации при болезни Паркинсона? Мов Дизорд, 1997, 12(1):17

2. Дженнер П.Г., Брин МФ. Нейротоксичность леводопы: экспериментальные исследования в сравнении с клинической значимостью. Неврология,1998,50(6 Suppl 6): S39

3. Маруяма В., Наой М. Гибель клеток при болезни Паркинсона. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): II6

4. Чэнь Цзяньцзун, Цзян Вэнь, Ши Цзянь и др. Клиническое наблюдение за лечением болезни Паркинсона со стороны печени и почек: отчет о 60 случаях. Журнал Чэндуского университета традиционной китайской медицины, 1999, 22(3): 14

5. Чэнь Цзяньцзун, Чэнь Сяоли, Ли Цзюньчан и др. Клиническое наблюдение за 40 случаями болезни Паркинсона, лечимыми методом питания печени и почек. Исследования в области китайской медицины, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan No. 1 пероральная жидкость при лечении 40 случаев болезни Паркинсона. Журнал Аньхойского колледжа традиционной китайской медицины, 1999, 18(2): 9

7. Симода К., Сове Ю., Марини А. и др. Высокий процентный выход тирозингидроксилаз-положительных клеток из культуры мезенцефальных клеток крысы Е14. Brain Res,1992,586 (2):319

8. Ван Сяовэнь, Цзян Сяоянь, У Лия Имин и др. In vitro очистка свободных радикалов и защитное воздействие на ОН·индуцированное повреждение ДНК, вызванное общими гликозидами цистанхи. Китайский фармацевтический журнал, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubuloside B из cistanche salsa Спасает нейронные клетки PC12 из 1-метил-4-фенилпиридиния ион-индуцированного апоптоза и окисления. Стресс.Planta Med,2002,68(11):966