Как изучить генетическое разнообразие Herba Cistanches?

Исследование генетического разнообразия Herba Cistanches, проведенное RAPD.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Цуй Гуанхун, Чен Мин, Хуан Луци*, Сяо Супин, Ли Да

(Институт китайской Материи медики, Китайская академия китайской медицины, Пекин 100700)

Абстрактный

Цель:Для изучения населениягенетическое разнообразиеизЦистанхе пустыннаяа такжеЦистанхе трубчатая.

Методы:Две дикие популяцииЦистанхе пустыннаяи четыре дикие популяцииЦистанхе трубчатаябыли проанализированы с помощью RAPD, игенетическое разнообразиепопуляций анализировали с помощью программного обеспечения POPGENE версии 1.31.

Полученные результаты:Средний процент полиморфных локусовЦистанхе пустыннаябыло 47,37 процента, полиморфные локусы двух популяций составляли 39,47 процента и 35,53 процента, а среднее разнообразие генов Nei составляло 0.135 8. У Шеннона было больше. Индекс информации о статусе равен 0.207 2, а коэффициент генной дифференциации Gst {{1{{2{0}}}}}.254 6. Средний процент полиморфных локусов у Cistanche составлял 27,59%, а процент полиморфных локусов в каждой популяции колебался от 19,54% до 25,29%, из которых у популяции Andier были самые высокие 25,29%, а среднее генное разнообразие Nei равнялось 0. { {21}}, информационный индекс полиморфизма Шеннона 0,1258, коэффициент дифференцировки генов Gst =0.175 5.

Вывод:Цистанхе пустыннаяа такжеЦистанхе трубчатаяимеют определенную дифференциацию среди популяций.генетическое разнообразиеу пустынной цистанхе значительно выше, чем у цистанхе трубчатой, и дифференцировалась на два экотипа.

Ключевые слова: цистанхе пустынная; Цистанхе трубчатая; РАПД; генетическое разнообразие

[Классический номер китайской библиотеки] S 567 [Идентификационный код документа] A [Номер статьи] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Цистанхе — паразитическое растение, относящееся к роду Цистанхе семейства лидановых, также известное как Дайун, которое является ценным китайским лекарственным материалом. Основными растениями-источниками цистанхе пустынной в моей стране являютсяЦистанхе пустыннаяYCMa и C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Растениями-хозяевами Cistanche Deserticola являются Haloxylon ammodendron и Haloxylon ammodendron, которые в основном распространены в Алашаньской лиге во Внутренней Монголии, северном Синьцзяне, Цинхае, Ганьсу и других местах. Распространение Cistanche Deserticola такое же, как и у растений-хозяев. В моей стране Cistanche cistanche распространен только в округах вокруг пустыни Такла-Макан к югу от гор Тянь-Шань в Синьцзяне, и его распространение не полностью синхронизировано с тамариксом-хозяином. Другие регионы, такие как северный Синьцзян, Ганьсу, Цинхай, Нинся, Внутренняя Монголия, Шэньси и другие места произрастания тамарикса, не являются паразитическими Cistanche Tubula [2]. Из-за быстрого роста спроса на цистанхе в последние годы, что привело к исчезновению его ресурсов, ресурсы дикой цистанхе сократились до нескольких основных районов производства. Оба были занесены в список находящихся под угрозой исчезновения охраняемых видов растений в моей стране [3], среди которыхЦистанхе пустыннаябыл включен в Приложение II СИТЕС [4].

После нескольких лет исследований исследования по искусственному разведению цистанхе увенчались успехом, и они находятся в стадии широкомасштабного продвижения и посадки. Тем не менее, как предотвратить сокращение видов цистанхе во время промышленного производства, как восстановить ограниченную дикую популяцию как можно скорее и сохранить ценные ресурсы дикой зародышевой плазмы, являются ключом к достижению ее устойчивого использования. Что касается охраняемого наследия Цистанче [Дата получения], 2004-03-11 [Проект фонда] Проект социального обеспечения Министерства науки и технологий (2001.109); Министерство науки и технологий Проект «Десятая пятилетка» (2001BA701A09a) [Автор, ответственный за переписку] * Хуан Луци, тел.: (010) 64014411-2955, электронная почта: huangluqi @263.net Изучение передачи все еще продолжается пустой. В этом исследовании используется технология RAPD для изучения 2 диких популяцийЦистанхе пустыннаяи 4 дикие популяцииЦистанхе трубчатая, и анализировать как разницу вгенетическое разнообразиеОжидается, что он обеспечит важную экспериментальную генетическую основу для защиты цистанхе, драгоценного китайского лекарства.

цистанхе

1. Материал и методы

1.1 Материалы

Цистанхе пустыннаябыл собран в уезде Джимсар в Синьцзяне и в районе Цзиланьтай Древней лиги Алкса во Внутренней Монголии. Популяции цистанхе были собраны в уездах Минфэн и Ютянь, Синьцзян. Округ Минфэн в настоящее время является районом с наибольшим урожаем Cistanche cistanche, с самой высокой плотностью и относительно полными сообществами естественных лесов. Точки отбора проб Андил, Савузек, Ятонггуз и Дахэян уезда Ютянь являются основными производственными районами, которые расположены в реках Андир, Ейике, Ятонгузи и Келания. В низовьях реки расстояние между популяциями составляет более 50 км. В каждой популяции были случайным образом отобраны 19-30 особей. Образцы быстро высушивали на силикагеле и использовали для выделения ДНК (табл. 1).

Таблица 1. Выборочные популяции и районы произрастания цистанхе пустынной и цистанхе трубчатой.

1.2 Экстракция ДНК

В методе выделения тотальной ДНК используется метод с высоким содержанием солей и низким pH [5]. Образец ДНК подвергали спектрофотометру для определения концентрации ДНК-матрицы, затем для RAPD-анализа использовали электрофорез в 1-процентном агарозном геле, окрашивание EB, наблюдение и фотографирование в ультрафиолетовом свете, электрофорез ДНК с четкими полосами и меньшим количеством хвостов.

1.3 Скрининг RAPD-праймеров

Поскольку в эксперименте установлено, что один и тот же праймер неудовлетворительно влияет на одновременную амплификацию обоихЦистанхе пустыннаяи Cistanche tubulosa, праймеры подвергали независимому скринингу. Для амплификации и скрининга использовали 150 случайных праймеров (10 п.н.), 25 мкл реакционной системы Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.; в каждом праймере использовались 2 матрицы популяции и 1 стерилизованная бидистиллированная вода в качестве контрольного бланка, и было получено 10 праймеров для амплификации Cistanche Deserticola с четкими полосами, сильным полиморфизмом и хорошей воспроизводимостью: S490, S1 101, S{{ 8}}, С1 137, С1 165, С1 218, С1 222, С2 015, С2 112, С{{15 }}; 10 праймеровЦистанхе трубчатая: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 ПЦР-амплификация и обнаружение продукта

Отобранные праймеры использовали для амплификации матричной ДНКЦистанхе пустыннаяа такжеЦистанхе трубчатаяпо ПЦР. Геномную ДНК разводили до 50 нг·мкл -1 в соответствии с измеренной концентрацией в качестве матрицы. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл, из которых 1 0 × ПЦР-буфер 2,5 мкл, Mg2 плюс 1,5 мкл, Taq (5 ед.·мкл -1) 0,2 мкл, смесь dNTP (каждая по 2,5 мМ) 1 мкл, 5 мкМ Праймер 1 мкл, матричная ДНК 1 мкл, стерилизованная бидистиллированная вода 18,8 мкл, вышеуказанный раствор для амплификации ПЦР является продуктом Shanghai Sangon. Амплификацию проводили на термоциклере PTC-100. Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94 градусах в течение 5 минут, а затем 40 циклов. Каждый цикл включал 94 градуса 45 секунд, 34 градуса 1 минуту, 72 градуса 1 минуту 30 секунд и, наконец, удлинение при 72 градусах в течение 5 минут. Амплифицированные продукты подвергали электрофорезу на 2,0-процентном агарозном геле (содержащем EB) в буфере 1×TAE, наблюдали и фотографировали в системе визуализации геля SYNGENE.

1.5 Статистика и анализ данных

В спектре электрофореза сравнивают соответствующее положение продукта реакции на геле по эталону молекулярной массы и оценивают молекулярную массу амплифицированного продукта. Полоса с полосой записывается как 1, а полоса без полосы записывается как 0, формируя матричный график 0/1 и вводя его в компьютер, используя POPGENE32 для расчета процента полиморфных сайтов. (PPL) каждой популяции, индекс генного разнообразия Нея (H), информационный индекс полиморфизма Шеннона (I), коэффициент генной дифференциации (Gst), генное разнообразие (Ht),Генетическое разнообразие(Hs), генетической идентичности Nei (1978) (I) и генетической дистанции (D) внутри популяции, а также кластерный анализ был выполнен с использованием метода UPGMA.

2. Результаты и анализ

2.1 Генетическое разнообразие цистанхе

Во всех образцах получены полосы с молекулярной массой от 200 до 2 200 п.н. (рис. 1, 2). Всего выявлено 76 локусов в 60 образцах из 2 популяций.Цистанхе пустынная, 36 из которых были полиморфными локусами, что составляет 47,37%, H=0.135 8, I=0.207 2. Среди них PPL Jimsar составляет 39,47 процента, а Gilanty — 35,53 процента. Н равно 0. 0 95 3 и 0.1 070 соответственно, и я 0.15 12 и 0.163 7 соответственно. Всего у {{20}} особей из 4 популяций цистанхе выявлено 87 локусов, из них 24 полиморфных локуса, что составляет 27,59%, H=0.084 8, Я=0.1278. Самый высокий PPL был у Андила - 25,29 процента, в то время как PPL был ниже у Савузека и Ятунгуси (оба по 19,54 процента). H – 0.062 1 -0.080 0, I – 0.095 0 -0.116. Размер H и I согласуется с тенденцией размера PPL каждой популяции, а коэффициенты самые большие в Андье, за которым следует Даян. В случае того же PPL, H=0.{{40}} Савузека H=0.097 0 немного больше, чем 0.{{44 }} и 0.095 0 Ятунгуски (табл. 2).

Рисунок 1. Полосы некоторых образцов пустыни, усиленные RAPD.Цистанхе пустынная, грунтовка S490 1-10. Гарантийные образцы; 11-20. Образцы Джимпстер Маркер М-ДНК (200 - 2 000 п.н.)

Рисунок 2. Полосы RAPD-амплификации некоторых образцов Cistanche Tubulosa, праймер S2 042 1-20. Образец Xinjiang Andier Маркер M-ДНК (200 - 2 000 п.н.)

Таблица 2генетическое разнообразиеизЦистанхе пустыннаяа такжеЦистанхе трубчатаянаселения

2.2 Анализ генетической изменчивости цистанхе

По уровнюгенетическое разнообразиев популяциях (Hs), дифференциация между популяциями (Dst) и доля генетических различий между популяциями в общих генетических различиях (Gst), можно видеть, что общее генетическое разнообразие Cistanche Deserticola Ht=0.{{ 1}}, где Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, из них Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (табл. 3). Приведенные выше результаты показывают, что среди популяций существует определенная степень генетической изменчивости. На изменчивость пустынных популяций Cistanche Deserticola приходилось 25,46% общей изменчивости, а на изменчивость популяций Cistanche tubulosa — 17,55% общей изменчивости.

Таблица 3 Анализ генетической изменчивостиЦистанхе пустыннаяа такжеЦистанхе трубчатая.

2.3 Генетическая дистанция и кластерный анализ среди популяций Cistanche Deserticola

Генетическая дистанция двух популяцийЦистанхе пустынная{{0}}.080 0, а генетическая идентичность 0.9231. Генетическая дистанция четырех популяций Cistanche составила 0.012 0-0.031 5, а генетическая идентичность — 0.9690-0.988 1 (таблица 4). . Группирование особей цистанхе пустынной и цистанхе трубчатой ​​показывает, что цистанхе пустынная может быть сгруппирована в две отдельные группы в зависимости от популяции, в то время как разные особи цистанхе трубчатой ​​не могут быть сгруппированы по популяции, что также указывает на то, что генетическая дифференциация среди цистанхе пустынной населения относительно высока. Большая, но генетическая дифференциация среди популяций Cistanche tubulosa невелика.

Таблица 4 Генетическая идентичность (внизу слева) и генетическая дистанция (вверху справа)цистанхе трубчатая.

3. Обсуждение

3.1 Генетическое разнообразие цистанхе

Уровеньгенетическое разнообразиерастений неотделима от их биологических особенностей, среды обитания, происхождения и эволюции. Среди них наибольшее влияние имеют система размножения, ареал распространения, жизненная форма, способы распространения пыльцы и семян [6]. Согласно статистическим результатам аллозимных данных 499 видов растений 165 родов, проведенным Ge Song et al. [7], полиморфизм цистанхе на уровне вида должен составлять около 50 процентов, а полиморфизм на уровне популяции должен составлять около 40 процентов. Около 0,17. Все уровни полиморфизма, полученные в этом эксперименте, ниже этих средних значений. В то же время, по сравнению с уровнями полиморфных локусов, полученными методами RAPD для нескольких распространенных исчезающих растений, таких как 32% вымирающих видов пихты серебристой[18], 22,5% пиона карликового и 27,6% пиона пурпурного. [9] ] Можно видеть, что генетическое разнообразиеЦистанхе пустынная несколько ниже среднего уровня, а генетическое разнообразие цистанхе трубчатой ​​уже крайне низкое.

3.2 Причины низкого генетического разнообразия цистанхе

Цистанхе – специфическое растение-паразит, распространенное в то же время на узких пустынных участках. Таким образом, уникальный образ жизни и относительно узкая жилая площадь могут быть неотъемлемой причиной того, чтогенетическое разнообразиеЦистанхе в целом ниже, чем у обычных растений.

Разница вгенетическое разнообразиемежду Cistanche Deserticola и Cistanche tubulosa может быть связано с разницей в ареале их распространения и синхронностью их распространения с хозяином. Ареал распространения Cistanche tubulosa значительно меньше, чем у Cistanche Deserticola, и его распространение крайне не синхронизировано с растением-хозяином. Исследования показали, что виды Tamarix отличаются большим разнообразием. Например, Чжан Хуан и др. сообщили, что генетическое разнообразие Tamarix sibiricus достигает 98,7% [10], в то время как генетическое разнообразие Cistanche крайне низкое, что указывает на длительную эволюцию. Cistanche tubulosa, возможно, пережила серьезные узкие места в истории, что привело к потере большого количествагенетическое разнообразие.

В то же время, по результатам расследований, было установлено, что ни один изЦистанхе пустыннаяв пределах 20 км от населенных пунктов могли быть раскопаны и нормально цвели. Были выкопаны большие и малые ямы цистанхе, особенно в основных районах выращивания трубчатого цветка цистанхе. Таким образом, это было вызвано большим объемом раскопок. Отсутствие происхождения и разрушение среды обитания могут быть основными антропогенными причинами низкойгенетическое разнообразиеЦистанче.

3.3 Генетическая дифференциация цистанхе

Из-за географического расстояния между Синьцзяном и Внутренней Монголией географическая изоляция вызвала дифференциацию и изоляцию междуЦистанхе пустыннаяпопуляции, причем две популяции сформировали разные генетически разные экотипы за счет адаптации к местным условиям обитания. Из-за узкого ареала распространения и частого обмена генами между популяциями генетическая дифференциация среди популяций меньше, чем у Cistanche Deserticola.

3.4 Рекомендации по защите Цистанхе

Генетическое разнообразиеявляется необходимым условием долгосрочного выживания видов, чтобы избежать вымирания. Сокращениегенетическое разнообразиеснизит способность популяций адаптироваться к изменениям окружающей среды как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе [11]. Поэтому защита генетического разнообразия цистанхе очень важна для защиты этого редкого и драгоценного китайского лекарства. Поскольку цистанхе относится к видам с особым экологическим типом, она должна охраняться в основном in situ, а природная база охраны цистанхе должна создаваться в соответствии с ее генетическим разнообразием. Например, дляЦистанхе трубчатая, поскольку генетическое разнообразие в основном происходит внутри популяции, популяции с большим генетическим разнообразием будут приоритетными объектами защиты [12], такие как Angier Minfeng и Daheyan Yutian, которые могут быть указаны в качестве базы естественной защиты Cistanche. ДляЦистанхе пустынная, популяции Внутренней Монголии и Синьцзяна претерпели значительные изменения, поэтому экспериментальные исследования должны быть дополнительно усилены для определения популяций, приоритетных для защиты. В то же время провести фундаментальные исследования репродуктивной биологии и экологии опыления цистанхе, чтобы получить информацию для ее дальнейшей защиты.

использованная литература

[1] Хэ Яньпин, Инь Чжэжу, Ту Пэнфэй и др. ИдентификацияЦистанхеи исследование коммерческих лекарственных материалов. Китайские медицинские материалы, 1997, 20(3):117.

[2] Лю Минтин. Всестороннее исследование и общее применение растений Тамарикс. Ланьчжоу: Издательство Ланьчжоуского университета, 1995.

[3] Фу Гуоли. Красная книга китайских растений. Пекин: Научная пресса, 1992.

[4] Управление импорта и экспорта исчезающих видов Китайской Народной Республики, Научный комитет по исчезающим видам Китайской Народной Республики. Конвенция о международной торговле видами дикой фауны и растений, находящимися под угрозой исчезновения (СИТЕС), Приложение II. 2003.41.

[5] Цзоу Юпин, Ван Сяоцюань, Лэй Идин и др. Извлечение и идентификация тотальной ДНК нескольких исчезающих растений и их родственников. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Ван Хунсинь, Ху Чжан. Система селекции растений, генетическая структура и защитагенетическое разнообразие. Биоразнообразие, 1996, 4(2): 92.

[7] Чен Цзякуань, Ян Цзи. Эволюционная биология растений. Ухань: издательство Уханьского университета, 1994.

[8] Ван Сяоцюань, Цзоу Юпин, Чжан Дамин и др. RAPD-анализ генетического разнообразия пихты белой. Китайская наука (C), 1997, 40 (2): 145.

[9] Пей Яньлун, Цзоу Юпин, Инь Чжэнь и др. Предварительный отчет о RAPD-анализе пиона карликового и пиона фиолетового. Китайский журнал таксономии растений, 1995, 33(4): 350.

[10] Чжан Цзюань, Инь Линке, Чжан Даоюань. Предварительное исследованиеГенетическое разнообразиеприродных популяций тамарикса ланцетного. Юньнаньские ботанические исследования, 2003, 25(5):557.

[11] Эллстранд Н.К., Элам Д.Р. Популяционно-генетические последствия небольшого размера популяции: последствия для сохранения растений. Ежегодный обзор «Экология и систематика», 1993, 34:217.

[12] Лю Чжаньлинь, Чжао Гуйфан. Принцип популяционной генетики и его применение в охране редких и исчезающих растений. Биоразнообразие, 1999, 7(4): 340.

Из: China Journal of Chinese Materia Medica; Том. 29, выпуск 8 августа 2004 г.