Cistanche Deserticola улучшает повреждение нервных клеток гиппокампа у крыс болезни Паркинсона посредством регуляции пути Keap1/nrf2/ho -1 антиоксидантного пути

Абстрактный:

 

Цель изучить влияниеCistanche Deserticola при повреждении нервных клеток при болезни Паркинсона (PD)Крысы и связанный с ним механизм. Методы Sprague-Dawley (SD) Самские крысы были случайным образом разделены на три группы (1 0 крыс в каждой группе): контрольная группа, модельная группа и группа Cistanche. Крысы в ​​модельной группе и группе лечения были внутрипрановые инъецированы с 6- гидроксидопамином (6- OHDA). Крысам в группе Cistanch дали 0,216 г/ мл раствора Cistanche, крысам в пустой группе и модельной группе давали нормальное ирригацию солевого раствора, количество ирригации составляло 1 мл/ (100G · D) в течение двух недель. Морфология и ультраструктура нервных клеток в гиппокампе наблюдались с помощью иниции и пропускания. Морфология тел Ниши в регионе Хемимани наблюдалась окрашиванием Ниши. Уровни малондиалдегида (MDA) и супероксиддисмутазы (SOD) были обнаружены методом тиобарбитуровой кислоты и методом тетразолия нитробла. Изменения белка 1 (Keap 1), а ядерный фактор E 2- связанный фактор 2 (NRF 2) и гем циклооксигеназа 1 (HO -1) проанализировали с помощью Western Blot. Результаты после лечения лекарств от Cistanche Deserticola была улучшена структура ткани гиппокампа, ядерный пиротоз был снят, содержание антиоксидантного фермента SOD в гиппокампе постепенно увеличивалось, в то время как содержание окислительного стресса продукт MDA выросли в выживании в выживании. Экспрессия белка NRF 2 и HO -1 увеличилась. Выводы Cistanche Deserticola может улучшить повреждение нейронов гиппокампа и снизить уровень реакции окислительного стресса в гиппокампе крыс PD. АЭффект Cistanche DeserticolaвЛечение ПДКрысы тесно связаны с регулированием Keap -1 /NRF 2 /HO -1 пути сигнализации.

 

 

 

Высококачественный Cistanche для лечения PD

 

Ключевые слова: Cistanche Deserticola;Болезнь Паркинсона; Окислительный стресс; гиппокамп; нейроны; Keap1; NRF2; Ho -1

 

Согласно статистике исследования данных о глобальном заболевании, неврологические заболевания стали основной причиной инвалидности во всем мире. В этой области болезнь Паркинсона (PD) стала одним из самых быстрорастущих заболеваний с его значительным возрастным стандартом увеличения распространенности, увеличения случаев инвалидности и роста смертности. один.
С 1990 по 2020 год число пациентов с БП во всем мире увеличилось на 118%, достигнув 6,2 миллиона, а частота все еще увеличивается год за годом [1-2]. Пациенты с БП обычно имеют моторные симптомы, такие как тремор, мышечная жесткость, брадикинезия и сложности баланса на поздней стадии. Тем не менее, немоторные симптомы, такие как снижение когнитивных средств, могут возникнуть на ранней стадии заболевания. По мере развития заболевания когнитивные нарушения будут постепенно ухудшаться и стать более тяжелыми.

Высококачественный Cistanche для лечения PD

Влиять на качество жизни пациентов [3]. Гиппокамп является важной организацией в мозге для пространственного обучения и получения внешней информации. Это основная структура реализации человеческих когнитивных функций. Дисфункция гиппокампа тесно связана с началом когнитивной дисфункции у пациентов с БП. Окислительный стресс участвует в развитии нервных клеток в тканях гиппокампа. Урон [4-5]. Следовательно, если нейроны гиппокампа защищены у пациентов с БП, это может улучшить познание пациента и задержать прогрессирование заболевания.
В последние годы было доказано, что различные китайские травяные лекарства были эффективны при лечении неврологических заболеваний [6]. Cistanche Deserticola - это традиционная китайская медицина, которая может питать почки ян и пополнять сущность и кровь. Он использовался для лечения неврологических заболеваний, таких как ишемический инсульт и нейромиелит [7]. Предыдущие исследования исследовательской группы показали, что Cistanche Deserticola может улучшить поведение модельных крыс PD и уменьшить апоптоз дофаминовых нервных клеток в области сумасшедшей сутки среднего мозга [8-9]. Тем не менее, неясно, может ли Cistanche Deserticola улучшить повреждение ткани гиппокампа у крыс PD. Следовательно, это исследование установило модель крыс PD для наблюдения за влиянием Cistanche Deserticola на повреждение ткани гиппокампа и изучение его механизма, чтобы предоставить новые идеи для лечения PD. Биологическая компания Tian); Реагент окрашивания NISSL (биологическая компания Nanjing Senbeijia); Изофлуран (биологическая компания Шанхай Яджи).

 

1 материалы и методы

1.1 Материалы

1.1.1 Экспериментальные животные

30 6- были использованы недельные мужские крысы для мужчин 210-230 g. Экспериментальный центр животных Фуцзяйского университета традиционной китайской медицины предоставил экспериментальных животных и общих медицинских экспериментальных учреждений животных. Эксперимент был утвержден Комитетом по этике животных в этом учреждении, а регистрационный номер этики - 1N2023019.

1.1.2 Экспериментальные реагенты
Cistanche Deserticola гранулы (третья народная больница Fujian); 6- гидроксидопамин (6- ohda) Reagent (Beijing Biolabor Technology Co., Ltd.); Гематоксилин-эозин (HE) реагент (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Лизат белка животных (Beijing Solebao Biological Company); Ингибиторы белковой фосфатазы (биологическая компания Wuhan Pujian); Ингибиторы протеазы (Biotechnology Company Hunan Yunbang); Келч-подобный ECH-ассоциированный белок -1 (Keap1) моноклональное антитело (Biotechnology Company Wuhan Sanying); Glyceraldehyde 3- моноклональное антитело фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (Wuhan Huamei Biological); Ядерный фактор E2 Связанный фактор 2 (NRF2), гемоксигеназа 1 (гемоксигенасы -1, HO -1) моноклональное антитело (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); комплекты обнаружения супероксиддисмутазы (SOD) и детектирование малонодословского (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Окрашивание NISSL реагент (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isoflurane (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Инструменты

JEA3001 Электронный баланс (Shanghai Puchun Measure Instrument Co., Ltd.); Электронный баланс BSA224S (Сарториус, Германия); STAP S2T низкотемпературный шейкер (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Полностью автоматический парафиновый Slicer (Leica, Германия); Pectramax i3x многофункциональный считыватель микропланшета (молекулярные устройства, США); BX63
флуоресцентный микроскоп (Olympus, Япония); DLAB Handheld Centrifuge D1008/D1008E (Пекин Далонг Синчюанский экспериментальный инструмент Co., Ltd.); Cryocube F740HI Ultra-Low Tempert Demperation Holrigrator (Epend, Германия); Minipro Epbasic Basic Electrophores Intrement Foodse (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); Постоянная температурная сушка (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max без воздуховодов Fume Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Методы

1.2.1. Модельное создание и группировка животных

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 круги, которые считались успешным моделированием. После этого крысы в ​​группе Cistanche Deserticola были задушены 0,216 г/мл раствора Cistanche Deserticola каждый день, а пустая группа и модельная группа были получены нормальным физиологическим раствором. Объем тормоза трех групп крыс составлял 1 мл/(100 г · дня) в течение двух недель [9]. После того, как лечение каждой группы крыс было завершено, крысы эвтанизировали 2% анестезии вдыхания изофлурана, а ткани мозга собирали для последующих экспериментальных исследований.

 

1.2.2 Наблюдение за патологическими изменениями в ткани гиппокампа при окрашивании гематоксилином-эозином

 

Ткани гиппокампа крыс в каждой группе собирали, помещали в раствор формальдегида, дегидратировали градиентным этанолом, запекали в сушильной духовке, растворенное воск, высушенные, обезжиренные, окрашенные HE, прозрачно прозрачным ксилолом, запечатанным с нейтральной жестой и наблюдаемой под микроскопом.

 

1.2.3 Наблюдение за микроскопией электронной микроскопии ультраструктуры нервных клеток гиппокампа

Ткань гиппокампа помещали в фиксацию глутаральдегида, обезвоженную с градиентным этанолом, встроенным (эпоксидной смолой) и были получены ультратонкие срезы. Окрашивание цитратом и уранилацетатом использовали для наблюдения за ультраструктурными изменениями гиппокампальных нервных клеток (при просвечивающей электронной микроскопии).

 

1.2.4.

Вышеупомянутые парафиновые срезы ткани гиппокампа гидратировали в безводном этаноле, 95% и 70% градиентного этанола соответственно. После промывания дистиллированной водой 3 раза, окрашивание окрашиванием NISSL в течение 5 минут, затем промойте обезвоженным градиентным спиртом и дистиллированной водой и очистите ксилолом. Срезы были запечатаны нейтральным клеем и наблюдали и регистрировались под оптическим микроскопом после затвердевания.

 

1.2.5 Химический колориметрический метод для обнаружения содержания MDA и SOD в ткани гиппокампа

После того, как ткани гиппокампа различных экспериментальных групп гомогенизировали, их центрифугировали при 1000 г в течение 20 минут, и собирали супернатант каждой экспериментальной группы. Согласно инструкциям комплекта, наборы для анализа MDA и SOD были использованы для обнаружения содержания MDA и SOD в каждой группе экспериментальных образцов.

 

1.2.6 Иммуноблоттинг белка для обнаружения специфической экспрессии белков Keap1, NRF 2 и HO -1 в ткани гиппокампа

Ткани гиппокампа каждой группы добавляли с лизисным буфером и центрифугировали при 12, 000 r · min -1 в течение 15 мин. Супернатант был собран для резервного использования. Концентрацию белка определяли методом BCA. Согласно результатам количественной оценки белка, был добавлен соответствующий объем общего белка и загружали электрофорезом белкового геля. Образцы денатурировали при 95 градусах в течение 10 минут, переносили на мембрану, разрезали и блокировали в блокирующем растворе в течение 1 часа. Разущенные первичные антитела Keap1, NRF 2, HO -1 и GAPDH (1: 500) добавляли, реагировали в течение ночи при 4 градусах, промывали 1 × TBST, инкубировали со вторичными антителами (1: 4000) и снова промывали 1 × TBST для цветной точки зрения.

 

1.3 Статистический анализ

Данные подсчета были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Данные, которые соответствовали нормальному распределению и однородности дисперсии, были подвергнуты t -критерию, данные, которые соответствовали нормальному распределению и неравной дисперсии, были подвергнуты корректируемому t -критерию; Данные, которые не соответствовали нормальному распределению, были подвергнуты непараметрическому тесту. Односторонний ANOVA использовался для сравнения различий между различными группами, а затем метод LSD использовался для сравнения двух групп. P <0. 05 считался статистически значимым.

 

2 результаты

2.1 Влияние Cistanche Deserticola на морфологическую структуру гиппокампальной области CA1 у модельных крыс PD, которые он окрашивает, показали, что нейроны в области CA1 гиппокампа у крыс Blank Group были аккуратно и тесно, с регулярной морфологией и однородным распределением, и никакого очевидного повреждения нейрональных клеток; Нейрональные клетки в модельной группе располагали более беспорядочными, клеточные ядра были сокращены, ядерное окрашивание углублялось, и повреждение нейрональных клеток было очевидным; Нейрональные клетки в группе Cistanche Deserticola были расположены более регулярно, чем в модельной группе, количество ядерной конденсации было относительно уменьшено, и повреждение нейрональных клеток было облегчено. Результаты показаны на рисунке 1.

 

 

Рисунок 1 Влияние Cistanche Deserticola на патологическую структуру в области CA1 гиппокампа у крыс Паркинсона (HE, × 400) Примечание: A: Контрольная группа; B: модельная группа; C: Cistanche Group. Черные стрелки указывают поврежденные нервные клетки.

 

2.2 Влияние Cistanche Deserticola на ультраструктуру нейронов гиппокампа у крыс PD Model

В пустой группе, наблюдая за нейронами гиппокампа, можно наблюдать, что клеточная структура сохраняет четкую морфологию, ядро ​​имеет регулярную круглую или овальную форму, ядерная мембрана остается гладкой и нетронутой, а хроматин в ядре распределяется равномерно, и нет края агрегации ядра. Напротив, нейроны гиппокампа модельной группы показали очевидные изменения: общая электронная плотность клеток увеличивалась, ядро ​​конденсировалось, хроматин в ядре агрегировался и прикрепленные к дне ядерной мембраны, ядерная мембрана сгущалась, и вакуолы были замечены в цитоплазме. After intervention with Cistanche deserticola, compared with the model group, the hippocampal neurons of the Cistanche deserticola group showed a certain recovery trend: the size of the neuronal cell body was restored, the cell membrane remained intact, the edge aggregation of nuclear chromatin was alleviated to a certain extent, the thickening of the nuclear membrane was also alleviated, and the number of vacuoles in the Цитоплазма снижалась, что указывает на то, что Cistanche Deserticola оказывает определенное защитное или восстановительное влияние на нервные клетки. См. Рисунок 2.

 

Рисунок 2 Влияние Cistanche Deserticola на ультраструктуру нейронов в гиппокампе крыс болезни Паркинсона (× 7000) Примечание: A: Контрольная группа; B: модельная группа; C: Cistanche Group.

 

2.3 Влияние Cistanche Deserticola на тела Nissl в нейронах гиппокампа на крысах PD модели крыс

Результаты окрашивания NISSL показали, что нейроны в пустой группе были тесно расположены с регулярной морфологией, обильными телами NISSL и темным окрашиванием; Нейроны в модельной группе были свободно расположены, опухшие, а большинство тел NISSL были растворены и слегка окрашены; Нейроны в группе Cistanche Deserticola были тесно организованы с регулярной морфологией, а количество и окрашивание тел Nissl были улучшены по сравнению с модельной группой. Результаты показаны на рисунке 3.

 

Рисунок 3 Влияние Cistanche Deserticola на тело Nissl у нервных клеток гиппокампа у крысы болезни Паркинсона (Nissl, × 200) Примечание: A: Контрольная группа; B: модельная группа; C: Cistanche Group.

 

2.4 Влияние Cistanche Deserticola на содержание SOD и MDA в гиппокампе у крыс болезни Паркинсона

 

По сравнению с пустой группой содержание SOD в гиппокампе модельной группы уменьшилось, в то время как содержание MDA увеличилось; По сравнению с модельной группой содержание SOD в гиппокампе группы Cistanche Deserticola увеличилось, в то время как содержание MDA уменьшилось. Смотрите таблицу 1.

 

Вкладка 1 Влияние Cistanche Deserticola на содержание SOD и MDA в гиппокампе у крыс болезни Паркинсона

Группа	СОД (PG/мл)	MDA (PG/мл)
Контроль	12.36±2.75	2.85±0.83
Модель	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Примечание: по сравнению с контрольной группой, *p<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Влияние Cistanche Deserticola на экспрессию белков Keap1, Nrf2 и Ho -1 в гиппокампе у крыс болезни Паркинсона

Результаты экспериментов с вестерн -блоттингом показали, что экспрессия белков Nrf2 и HO -1 в гиппокампе крыс в модельной группе снизилась, в то время как экспрессия белка Keap1 увеличилась; По сравнению с модельной группой экспрессия белков NRF2 и HO -1 в гиппокампе крыс в группе Cistanche Deserticola увеличивалась, в то время как экспрессия белка Keap1 снижалась. См. Рисунок 4 и Таблица 2.

Рисунок 4 Влияние Cistanche Deserticola на экспрессию Keap1, Nrf2 и Ho -1 в гиппокампе крыс болезни Паркинсона

Примечание: A: контрольная группа; B: модельная группа; C: Cistanche Group

 

 

Вкладка 2 Влияние Cistanche Deserticola на экспрессию Keap1, Nrf2, Ho -1 в гиппокампе у крыс болезни Паркинсона

 

Группа	Кипл	NRF2	Ho -1
Пустая группа	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Модельная группа	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Положительная группа	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Примечание. По сравнению с контрольной группой, *p <{{0}}. 05; По сравнению с модельной группой, #P <0,05.