Полисахариды Cistanche Deserticola облегчают снижение когнитивных функций и улучшают память у стареющих мышей

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Юань Гао1,*, Бин Ли1,*, Хун Лю1, Яцзюань Тянь2, Чао Гу1, Сяоли Ду1, Жэнь Бу1, Цзе Гао1, Ян Лю1, Ган Ли1

АННОТАЦИЯ

Недавние данные свидетельствуют о том, что изменения в оси кишечная микробиота-мозг могут вызывать когнитивные нарушения с возрастом. В настоящем исследовании мы наблюдали, что длительное введение D-галактозы мышам вызывало снижение когнитивных функций, микробный дисбиоз кишечника, периферическое воспаление и окислительный стресс. В этой модели возрастного снижения когнитивных функций полисахариды Cistanche Deserticola (CDPS) улучшали когнитивную функцию у мышей, получавших D-галактозу, путем восстановления микробного гомеостаза кишечника, тем самым уменьшая окислительный стресс и периферическое воспаление. Положительные эффекты CDPS у этих мышей с моделью старения были устранены за счет удаления кишечной микробиоты антибиотиками или иммуносупрессии циклофосфамидом. Метаболические профили сыворотки показали, что уровни креатинина, валина, L-метионина, о-толуидина, N-этиланилина, мочевой кислоты и пролина были изменены у стареющих мышей, но восстанавливались с помощью CDPS. Эти результаты показали, что CDPS улучшает когнитивную функцию в модели старения, вызванного D-галактозой, у мышей за счет восстановления гомеостаза оси кишечной микробиоты головного мозга, что облегчало дисбаланс аминокислот, периферическое воспаление и окислительный стресс. Таким образом, CDPS демонстрирует терапевтический потенциал для пациентов с нарушениями памяти и обучения, особенно связанными с кишечным микробным дисбиозом.

Цистанхетрава

ВВЕДЕНИЕ

Длительное введение D-галактозы (D-gal) и солей бериллия индуцирует старение в экспериментальных животных моделях и первичных культурах клеток in vitro и используется для выявления механизмов, лежащих в основе естественного процесса старения [1-4]. Предыдущие исследования показывают, что снижение когнитивных функций у мышей с моделью старения, вызванной D-галактозой, связано со снижением уровня белка фактора роста нервов (NGF) и увеличением количества активных форм кислорода (АФК) в мозге, которые вызывают дегенерацию нейронов гиппокампа и снижают нейрогенез [3, 4]. Недавние исследования также показали, что состав и количество микробиоты кишечника человека значительно меняются в процессе старения [5].

Цистанхе пустынная — это трава, которая растет в основном в северо-западной пустынной области Китая и используется в традиционной китайской медицине. Он широко известен как «женьшень пустыни». Экстракты цистанхе пустынной содержат несколько фармакологически активных соединений, в том числе фенилэтаноидные гликозиды, иридоиды, лигнозу, олигосахариды, полисахариды и аминокислоты; эти соединения связаны с противовоспалительными, антиоксидантными, антистареющими, нейропротекторными и иммуномодулирующими свойствами [6, 7]. Например, полисахариды, извлеченные из цистанхе пустынной, использовались в традиционной китайской медицине для лечения колоректального рака [8]. Широкий спектр слаботоксичных полисахаридов с полезной биоактивностью был выделен из нескольких организмов, таких как полисахарид Chuanqiong, полисахарид Ganoderma lucidum и полисахарид Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 представляет собой галактоглюкан, выделенный из Cistanche Deserticola, который способствует росту нескольких полезных кишечных бактерий, включая несколько видов Bacteroides и Lactobacillus [12].

Механизмы, лежащие в основе нормального процесса старения, также вовлечены в ряд заболеваний человека, таких как нейродегенеративные заболевания, коронарный атеросклероз, диабет 2 типа (СД2) и гипертония [13, 14]. Недавние исследования показали, что изменения кишечной флоры играют существенную роль в старении человека [15]. Несколько исследований показали, что длительное введение D-галактозы экспериментальным мышам и крысам имитирует нормальный процесс старения и является полезной моделью для изучения связанных со старением фенотипов, таких как снижение когнитивных функций [16]. Более того, мыши с моделью старения, вызванной D-галактозой, демонстрируют изменения в составе кишечной микробиоты [17]. Поэтому мы предположили, что изменения в составе микробиоты кишечника могут вызывать снижение когнитивных функций у мышей с моделью старения, вызванной D-галактозой, и исследовали, могут ли полисахариды Cistanche Deserticola (CDPS) облегчать снижение когнитивных функций путем восстановления дисбактериоза микробиоты кишечника.

стебель цистанхе

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Мыши с моделью старения, вызванного D-галактозой, демонстрируют снижение когнитивных функций и микробный дисбактериоз кишечника.

Мы проанализировали поведенческие характеристики мышей дикого типа (WT) и мышей, получавших 150 мг D-gal на кг массы тела в течение 2 месяцев (модель или Mod), используя новые тесты распознавания объектов и водного лабиринта Морриса (MWM). Значения предпочтительного индекса в тесте на распознавание новых объектов были значительно снижены у мышей группы Mod по сравнению с мышами группы WT (рис. 1А, 1В). Результаты теста MWM показали, что время задержки выхода после шестого дня было значительно увеличено в группе Mod по сравнению с группой WT (рис. 1C, 1D). Кроме того, пересечение целевой платформы и время плавания в пределах целевого квадранта были значительно сокращены в группе Mod по сравнению с группой WT (рис. 1E, 1F). Эти результаты продемонстрировали значительное снижение способности к обучению и памяти у мышей с моделью старения, вызванной Legal.

Затем мы проанализировали различия в количестве и составе кишечных микробных типов, родов и видов в образцах фекалий групп мышей Mod и WT, используя данные секвенирования 16S рибосомной РНК (рРНК) из образцов фекалий. Преобладающей кишечной флорой у мышей WT и Mod групп были Firmicutes и Bacteroides. Однако количество Bacteroides было значительно снижено, а количество Firmicutes значительно увеличилось в группе Mod по сравнению с группой WT (рис. 2A). Затем мы провели линейный дискриминантный анализ (LDA) для определения показателей размера эффекта LDA (LEfSe), а затем тесты Крускала-Уоллиса и Уилкоксона для оценки относительной численности различных таксонов у мышей группы WT и Mod. Результаты LDA показаны на рисунке 2B. Кроме того, мы построили кладограммы, показывающие дифференциальное обогащение различных родов и видов, принадлежащих к типам Bacteriodes и Firmicutes, в WT и модельных группах (рис. 2C). В целом, наши результаты продемонстрировали нарушение когнитивных способностей и микробный дисбактериоз кишечника у мышей с моделью старения, вызванной D-галактозой.

Польза для здоровья цистанхе: антиоксидант

Лечение CDPS улучшает когнитивные способности у мышей с моделью старения, вызванного D-gal.

Мы проанализировали, облегчает ли лечение CDPS снижение когнитивных функций у мышей с моделью старения, вызванной D-gal. В течение 2 месяцев введения массу тела измеряли через день. Масса тела мышей модельной группы и группы CDPS была одинаковой (рис. 3А). Проведение поведенческих экспериментов после последней дозы. Распознавание новых объектов и результаты теста водного лабиринта Морриса показали, что кратковременная память была значительно выше в группах мышей CDPS по сравнению с модельной группой мышей; долговременная память в группе мышей CDPS была выше, но статистически незначима по сравнению с модельной группой мышей (рис. 3B, 3C). Это свидетельствует о том, что лечение CDPS отменяет потерю кратковременной памяти распознавания объектов у мышей, получавших D-gal.

Пространственное обучение и память этих мышей были оценены с помощью теста водного лабиринта Морриса, и результаты показали, что латентное время выхода из группы мышей CDPS было сравнимо с группой мышей WT и значительно короче, чем у мышей группы Mod (рис. 3D). . Кроме того, время ожидания ускользания было значительно ниже на шестой день после введения CDPS по сравнению с модельной группой (рис. 3E). Время плавания в пределах целевого квадранта было значительно выше в группах CH и CM по сравнению с модельной группой. Группа CL выше, чем группа модели, но не имеет статистической значимости (рис. 3F). Более того, количество пересечений платформ было значительно выше в группах CM и CL по сравнению с модельной группой. Однако группа CH выше, чем группа модели и не имеет статистической значимости (рис. 3G). Эти результаты показали, что лечение CDPS улучшило пространственное обучение и память у мышей с моделью старения, вызванной D-gal.

Рисунок 1. Длительное введение D-галактозы вызывает ухудшение обучения и памяти у мышей.

Рисунок 2. Длительное введение D-галактозы вызывает микробный дисбиоз кишечника у мышей.

Лечение CDPS восстанавливает гомеостаз состава кишечной микробиоты у мышей с моделью старения D-галактозы

Моносахариды и полисахариды являются основными питательными веществами, необходимыми для роста бактерий [18–21]. Также сообщается, что CDPS регулирует состав кишечной микробиоты [22]. Поэтому мы проанализировали, облегчало ли лечение CDPS микробный дисбактериоз кишечника у мышей модельной группы, оценивая данные секвенирования 16S рРНК образцов фекалий из групп мышей WT, model и CDPS.

Во-первых, мы рассчитали индексы альфа-разнообразия, чтобы оценить общее богатство фекальной микробиоты и структурные различия между этими группами. Мы проанализировали индексы альфа-разнообразия (-разнообразия), такие как наблюдаемые виды, значения индекса Шеннона, Чао 1, ACE и Симпсона, чтобы определить изменения в составе различных видов бактерий в образцах фекалий разных групп мышей. Показатели -разнообразия (наблюдаемые виды, индексы Шеннона, Chao 1, ACE и Симпсона) были выше в группах мышей WT и CDPS по сравнению с модельной группой, но статистическая значимость наблюдалась только для значений индекса Chao 1 между CM группа и группа мод. Это показало, что введение CDPS увеличивает богатство микробиома (рис. 4A–4E). Затем мы проанализировали индексы -разнообразия для выявления различий в видах микробов кишечника между группами мышей WT, model и CDPS с использованием неметрического многомерного масштабирования (NMDS), анализа основных координат (PCoA) и анализа основных компонентов (PCA). . PCA показал изменения в микробном составе кишечника мышей модельной группы в процессе старения, включая уменьшение размеров и сохранение закономерностей и тенденций (рис. 4F). Различия в фекальной микробиоте между группами WT, model и CDPS были выявлены на основе PCoA невзвешенных расстояний UniFrac для генов 16S рРНК (рис. 4G). Кластерный анализ показал значительные различия в NMDS между модельной группой и группами WT и CDPS (рис. 4H).

Мы оценили 10 лучших типов кишечной микробиоты и обнаружили, что численность типов Bacteroides была значительно выше в группах CH, CM и CL по сравнению с модельной группой (рис. 4I). Это свидетельствует о том, что CDPS восстанавливал гомеостаз кишечной микробиоты у мышей, получавших D-gal. Кладограммы показали дифференциальное обогащение различных родов и видов, принадлежащих к типам Bacteriodes и Firmicutes, в группах WT, model и CDPS (рис. 4J). Как показано на тепловых картах, обработка CDPS снизила относительную численность Thermoplasmata, Bacilli, неопознанных Actinobacteria, Fusobacteriia и неопознанной Elusimicrobia и увеличила относительную численность Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, неопознанных_Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae. ,Erysipelotrichia и неидентифицированные_цианобактерии по сравнению с модельной группой (рис. 4K). Эти результаты показали, что лечение CDPS значительно восстанавливало гомеостаз микробиоты кишечника у мышей с моделью старения, вызванного D-gal.

Рисунок 3. Лечение CDPS улучшает обучение и память у мышей с моделью старения D-gal.

Лечение CDPS облегчает нейродегенерацию у мышей с моделью старения, вызванного D-gal, за счет снижения окислительного стресса.

Затем мы проанализировали влияние CDPS на воспаление путем анализа сывороточных уровней провоспалительных цитокинов (IL-2 и TNF-) и противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10. ) в разных группах мышей. Сывороточные уровни IL-2 и TNF- были значительно ниже, а сывороточные уровни IL-4 и IL-10 были значительно выше в группах CH, CM и CL по сравнению с моделью. группа. Показано, что CDPS обладает противовоспалительным действием (рис. 5A–5D).

Окислительный стресс вызван повышенной продукцией активных форм кислорода (АФК) и является одним из основных факторов, способствующих старению [23]. Поэтому мы проанализировали влияние CDPS на окислительный стресс в модели старения у мышей, вызванного D-gal, путем оценки сывороточных уровней антиоксидантного фермента, SOD, и продукта перекисного окисления липидов, малонового диальдегида (MDA). Уровни MDA в сыворотке были значительно выше, а уровни SOD в сыворотке были значительно снижены в группе Mod по сравнению с группой WT, но лечение CDPS обращало эти эффекты вспять (рис. 5E, 5F). Эти результаты показали, что окислительный стресс был повышен у мышей с моделью старения, вызванной D-gal, но был снижен при лечении CDPS.

Кроме того, мы оценили уровни окислительного стресса в тканях головного мозга, проанализировав уровни продвинутого окисленного белкового продукта (AOPP), прямого перекисного окисления липидов (LPO) и MDA, а также активности антиоксидантных ферментов, таких как глутатионпероксидаза (GSH-Px). ) и супероксиддисмутазы (СОД) в гомогенатах ткани головного мозга. Мозг мышей группы Mod показал значительно сниженную активность SOD и GSH-PX и значительно повышенные уровни AOPP, LPO и MDA по сравнению с группой WT, но эти эффекты были обратными в группе CH, CM и CL (рис. 6A-). 6Е).

Кроме того, мы выполнили гистологическое окрашивание срезов головного мозга красителями H&E и Nissl, чтобы оценить защитные эффекты CDPS на мозг мышей с моделью старения, вызванного D-gal. У мышей группы Mod наблюдалось значительное снижение количества и объема нейронов, увеличение промежутка между нейронами, неравномерное расположение нейронов и ядерный пикноз в области CA1 гиппокампа по сравнению с группой дикого типа, но эти патологические изменения были значительно уменьшены при лечении CDPS. Рисунок 6F). Эти результаты показали, что лечение CDPS значительно снижает окислительный стресс и патологию головного мозга у мышей с моделью старения, вызванной D gal.

Рисунок 4. Лечение CDPS восстанавливает микробный состав кишечника у мышей с моделью старения, вызванного D-галактозой.

Лечение CDPS уменьшает периферическое воспаление и окислительный стресс за счет поддержания микробного гомеостаза кишечника у мышей, индуцированных D-gal.

Затем мы проанализировали, были ли изменения в составе микробиоты кишечника связаны с усилением периферического воспаления и окислительного стресса во время старения. Для этого мы использовали коктейль из трех антибиотиков (группа ABX) или циклофосфамид (группа Cy; также см. «Материалы и методы»), чтобы уничтожить микробиоту кишечника или вызвать иммуносупрессию у мышей с моделью старения, получавших CDPS. Лечение антибиотиками аннулировало положительные эффекты лечения CDPS у стареющих мышей. Мы наблюдали нарушение обучения и памяти (рис. 7А), а также изменения в составе микробиоты кишечника (рис. 7В, 7С) у мышей группы ABX по сравнению с группой, получавшей CDPS. Приведенные выше результаты показывают, что даже введение CDPS не может повысить способность к обучению и памяти мышей после изменения кишечной флоры. Кроме того, мы наблюдали повышенные уровни провоспалительных цитокинов в головном мозге и сыворотке мышей группы ABX по сравнению с группой CDPS (рис. 7D–7N). Результаты группы ABX и группы CY показали, что после того, как кишечная флора и иммунная функция были разрушены, даже введение CDPS не могло улучшить способность мышей к обучению и памяти. Эти результаты свидетельствуют о том, что лечение CDPS уменьшало периферическое воспаление, окислительный стресс и снижение когнитивных функций у мышей с моделью старения, вызванных Legal, путем предотвращения дисбактериоза кишечника.

Затем мы использовали иммунодепрессант циклофосфамид [24], чтобы определить роль воспаления в благотворном действии CDPS. Мыши CDPS, получавшие циклофосфамид (группа Cy), показали нарушение способности к обучению и памяти, изменения в составе кишечной микробиоты и аберрантные уровни про- и противовоспалительных цитокинов в мозге и сыворотке по сравнению с мышами дикого типа и группы CDPS. Однако нет никакой значимости по сравнению с моделью и группой ABX. (Рисунок 7A–7N). Эти данные демонстрируют, что изменения в составе кишечной микробиоты усиливают периферическое воспаление у мышей с моделью старения, вызванной D-gal.

Рисунок 5. Лечение CDPS модулирует циркулирующие уровни про- и противовоспалительных цитокинов и факторов, связанных с окислительным стрессом, у мышей с моделью старения, вызванного D-галактозой.

CDPS предотвращает старение, вызванное D-gal, регулируя метаболизм аминокислот.

На иммунную систему хозяина влияют метаболиты, генерируемые микробиотой кишечника [25]. Фекальные метаболиты представляют собой функциональный показатель микробного метаболизма кишечника и микробного состава кишечника [26]. Более того, метаболиты кишечной микробиоты попадают в кровоток и влияют на метаболизм и здоровье хозяина [26, 27]. Всего в образцах сыворотки мышей FWT, Mod и CDPS было идентифицировано 1058 метаболитов. Затем мы проанализировали эти метаболиты с помощью BioCyc, Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) и базы данных метаболомов человека (HMDB) и обнаружили, что 65 метаболитов по-разному экспрессировались в группе Mod по сравнению с группой WT. Кроме того, мы обнаружили, что уровни 8 метаболитов (креатинина, валина, L-(-)-метионина, о-толуидина, N-этиланилина, мочевой кислоты, пролина и фенилаланина) значительно различались среди групп WT, Mod и CDPS. Анализ обогащения этих 8 метаболитов с помощью MetaboAnalyst [28, 29] показал, что эти метаболиты связаны с метаболизмом аргинина, гистидина, аргинина, пролина и пурина (рис. 8А, 8В). 7 различных метаболитов группы MOD и группы CDPS в группе WT.

Затем мы проанализировали, связаны ли изменения в метаболизме аминокислот с изменениями в составе микробиоты кишечника. Мы наблюдали, что 7 различных метаболитов групп WT, Mod и CDPS (креатинин, валин, L-(-)-метионин, о-толуидин, N-этиланилин, мочевая кислота и пролин) были значительно снижены в ABX, Cy, и группы Mod по сравнению с группами WT и CDPS. Более того, нет никакого значения между группами ABX и Cy (рис. 8C). Наконец, для изучения взаимосвязи между дифференциальным обменом веществ и другими заболеваниями, связанными со старением. Мы проанализировали корреляцию между этими семью дифференциально выраженными метаболитами и заболеваниями человека, используя базу данных MetaboAnalyst, и обнаружили, что эти метаболиты связаны с болезнью Альцгеймера (p=0.00173; рис. 8D, 8E). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что CDPS защищает от старения, вызванного D-gal, регулируя метаболизм аминокислот.

Рисунок 6. Лечение CDPS снижает окислительный стресс в мозге мышей с моделью старения, вызванного D-галактозой.

ОБСУЖДЕНИЕ

Прогрессирующее снижение когнитивной функции является характерной чертой старения. Предыдущие исследования показали, что лечение CDPS значительно улучшало обучение и память у стареющих мышей [30–33]. В этом исследовании мы продемонстрировали, что лечение CDPS улучшало когнитивную функцию за счет ингибирования периферического воспаления и окислительного стресса за счет восстановления микробного гомеостаза кишечника у мышей с моделью старения, вызванной D-gal (рис. 9). Крысы Sprague-Dawley, которых кормили полисахаридами Cistanche, показали повышенный рост полезных кишечных бактерий и повышенное микробное разнообразие кишечника [34]. CDA-0.05, нейтральный полисахарид Cistanche, улучшал рост пробиотических Lactobacilli [22]. Эти данные свидетельствуют о том, что полисахариды Cistanche улучшают гомеостаз кишечных бактерий.

В этом исследовании мы продемонстрировали, что CDPS оказывает противовоспалительное действие и улучшает когнитивные способности стареющих мышей, моделируя количество родов кишечных бактерий, таких как Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria. Следовательно, CDP могут быть терапевтически полезными при заболеваниях, связанных со старением, путем изменения состава кишечной микробиоты [35,36]. Более того, предыдущие исследования показали, что уровни воспалительных цитокинов в сыворотке и толстой кишке связаны с относительной численностью бактериальных родов, таких как Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria [37, 38]. Кроме того, микробный состав кишечника регулирует функцию мозга, модулируя циркулирующие уровни нескольких цитокинов [39–43]. Наши результаты показали, что лечение CDPS уменьшило относительное количество Thermoplasmata, Bacilli, неопознанных Actinobacteria, Fusobacteriia и неопознанных Elusimicrobia и увеличило относительное содержание Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, неопознанных _Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae, Erysipelotrichia и неопознанные_цианобактерии.

Метаболиты микробов кишечника попадают в кровоток и регулируют здоровье и метаболизм хозяина [26, 27]. Метаболиты кишечных микробов можно оценить, оценив состав фекальных метаболитов, который меняется при изменении состава кишечных микробов [44]. Недавние исследования показали, что уровни цитруллина, пролина, аргинина, аспарагина, фенилаланина и треонина в плазме связаны с нейродегенеративными расстройствами, включая болезнь Альцгеймера [45, 46]. Наше исследование показало, что сывороточные уровни креатинина, валина, L-метионина, о-толуидина, N-этиланилина, мочевой кислоты и пролина были связаны со старением у мышей, вызванным D-gal.

Экстракт цистанхе: против болезни Альцгеймера

Врожденные и адаптивные ветви иммунной системы играют важную роль в поддержании микробного гомеостаза на поверхности просвета кишечника [47]. Кишечная микробиота также играет важную роль в регуляции центральной нервной системы (ЦНС) и иммунитета, высвобождая цитокины и метаболиты в кровоток [48, 49]. Провоспалительные цитокины играют ключевую роль в ряде нейродегенеративных заболеваний [50–52]. Например, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и глаукома связаны с внеклеточным накоплением амилоида (A) и внутриклеточным отложением гиперфосфорилированного тау (p tau) и железа в ганглиозных клетках сетчатки (RGC) [44]. Более того, воспаление играет значительную роль в патогенезе глаукомы [53]. Нарушение зрения является ранним симптомом болезни Альцгеймера (БА) и проявляется до начала снижения когнитивных функций [54]. Наше исследование показало, что CDPS защищает от снижения когнитивных функций и периферического воспаления, поддерживая гомеостаз микробиоты кишечника.

Есть несколько ограничений данного исследования. Во-первых, связь между метаболизмом аминокислот и составом кишечной микробиоты недостаточно известна. Во-вторых, состав и молекулярная структура CDPS неизвестны. Таким образом, необходимы будущие исследования для дальнейшего изучения регуляторной роли CDPS в облегчении БА через ось передачи сигналов кишечной микробиоты-мозга.

В заключение, наше исследование продемонстрировало, что CDPS улучшал когнитивные способности у мышей с моделью старения, вызванного D-gal, путем восстановления гомеостаза кишечной микробиоты, тем самым восстанавливая аминокислотный дисбаланс, периферическое воспаление и окислительный стресс. Эти данные свидетельствуют о том, что CDPS является потенциальным терапевтическим средством для пациентов с нарушениями обучения и памяти, особенно связанными с дисбиозом кишечника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовка CDPS

Около 1,0 кг очищенной цистанхе пустынной сушили на воздухе в духовке при 40°С и измельчали ​​в неочищенный порошок. Порошок экстрагировали горячим этанолом в течение 3 часов. Остаток фильтровали через марлю для удаления фильтрата, затем разбавляли водой (8Х) и кипятили с обратным холодильником последовательно в течение 2 ч, 1,5 ч и 1 ч при 90°С. В каждый момент времени раствор центрифугировали для отделения надосадочной жидкости и в сочетании с коричнево-красным фильтратом. Затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении, охлаждали до комнатной температуры, медленно добавляли к 95-процентному этанолу (3Х) и выдерживали при 4°С в течение 24 часов. Затем раствор центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Осадок собирали после трехкратного повторения водной экстракции и спиртового осаждения. Осадок восстанавливали в воде, депротеинизировали, подвергали диализу и лиофилизации с получением неочищенного полисахарида Cistanche Deserticola (CDP). Содержание полисахаридов составляло более 90% по данным ультрафиолетовой спектрофотометрии.

экстракт цистанхе

Группировка животных и лечение

Восьминедельных самцов мышей Kunming (лицензия SCXK № 2019-0010) приобретали у SPF Biotechnology Co. Ltd (Пекин, Китай), помещали в светлое помещение с контролируемой температурой и кормили пищей и водой. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского университета Внутренней Монголии. Эксперименты проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных.

После 1-недельной адаптации к новым условиям 120 мышей были разделены на следующие 7 групп: (1) контроль дикого типа (WT); модельная группа (150 мг/кг/день D-gal; Mod); (3) CH: D-gal плюс 100 мг/кг CDPS; (4) CM: D-gal плюс 50 мг/кг CDPS; (5) CL: D-gal плюс 25 мг/кг CDPS; (6) группа ABX: антибиотики плюс D-gal плюс 50 мг/кг CDPS; (7) Cy группа: циклофосфамид плюс D-gal плюс 50 мг/кг CDPS.

Мыши из модельной группы, групп ABX, Cy и CDPS получали подкожно растворенные в физиологическом растворе 15{9}} мг/кг D-gal каждый день в течение 2 месяцев. Группе WT подкожно вводили равный объем физиологического раствора в течение 2 месяцев. Мышам группы CDPS также ежедневно вводили внутрижелудочные инъекции, содержащие 100 мг/кг, 50 мг/кг или 25 мг/кг CDPS в течение 2 месяцев. Мыши группы ABX получали питьевую воду с 0,1 мг/мл ампициллина и 0,5 мг/мл стрептомицина в течение 2 месяцев в дополнение к инъекциям D-gal и CDPS. Перед введением D-gal мышам вводили инъекции, содержащие 0,1 мг/мл ампициллина, 0,5 мг/мл стрептомицина и 0,1 мг/мл колистина в течение 7 дней в группе АВХ. Мыши группы Cy получали внутрибрюшинные инъекции 20 мг/кг циклофосфамида через день (qod) в течение 2 месяцев в дополнение к ежедневным инъекциям D-gal и CDPS.

Новый тест на распознавание объектов

Проведение поведенческих экспериментов после последней дозы. Тест на распознавание объектов включал этапы ознакомления, обучения и тестирования. На этапе ознакомления мышей приучали к пустой тестовой камере в течение 10 минут в течение двух дней. Затем на третий день (день обучения) два предмета одинакового размера, формы и цвета (А1 и А2) помещали на противоположных концах камеры. Затем каждой мыши давали 10 минут на изучение двух похожих объектов. Через 1-часа (на третий день) и 24-часа (на четвертый день) интервалов между обучением и тестированием один из аналогичных объектов (A1 или A2) был заменен на B или C. объект, отличающийся по размеру, цвету и форме в день тестирования. На этапе тестирования каждую мышь тестировали в течение 5 минут, и для определения памяти о распознавании нового объекта (B или C) рассчитывали предпочтительный индекс по следующей формуле: Предпочтительный индекс=Время на объекте B или C/ (Время на объекте B или C плюс время на объекте A) × 100 процентов.

Тест водного лабиринта Морриса

Тест водного лабиринта Морриса проводили в круглом бассейне глубиной 45 см и диаметром 90 см. Протокол, описанный Ruediger S, et al. (2011) [55] и Вуд Р.А. и соавт. (2018) [56]. Глубина воды в бассейне составляла 30 см, а температура воды была 20±1 градус С. Платформа имела диаметр 6 см и 1 см под водой. Время обучения и тестирования составляло по 60 с каждое. Для обучения мы проводили четыре испытания по 60 с каждое со скрытой платформой каждый день в течение пяти непрерывных дней. Если платформа не была обнаружена мышами в течение 60 с, их подводили к платформе и помещали на нее на 5 с. На этапе тестирования регистрировались и анализировались задержка достижения скрытой платформы в тренировочных и тестовых сеансах, количество пересечений местоположения удаленной платформы и время, проведенное в целевом (платформенном) квадранте.

анализы ИФА

Сывороточные уровни провоспалительных цитокинов, таких как IL-2(), IL-4, IL-10 и TNF-, анализировали для каждой группы мышей с использованием наборов ELISA, приобретенных в Shanghai Yi Li. Biological Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) и уровень продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида (МДА) в сыворотке каждой группы мышей анализировали с помощью наборов для анализа, приобретенных в Нанкинском институте биоинженерии Цзяньчэн (Нанкин, Китай). . Уровни белковых продуктов расширенного окисления (AOPP) в образцах гиппокампа мышей оценивали с использованием набора ELISA от Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Шанхай, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

Оценка окислительного стресса в мозге мышей

Мы гомогенизировали 100 мг ткани гиппокампа с 0,9 мл охлажденного на льду физиологического раствора, и гомогенат центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 минут при 4°C. Содержание белка в супернатанте анализировали с использованием набора для анализа белка BCA ( Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Уровни перекисного окисления липидов (ПОЛ) и малонового диальдегида (МДА), а также активность GSH-Px и СОД в образцах гиппокампа анализировали колориметрическим методом с использованием наборов Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

Добавка цистанхе: улучшает память

Состав микробиоты кишечника

Образцы фекалий собирали у всех мышей и немедленно хранили при -80°C. Область V3 плюс V4 гена 16S рРНК секвенировали с использованием Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Пекин, Китай) и анализировали с помощью QIIME. открытая платформа для определения профилей кишечной микробиоты.

ЖХ/МС анализ метаболитов сыворотки

Образцы сыворотки инкубировали в течение 10 минут с предварительно охлажденным метанолом в соотношении 1:3 для осаждения белков. Образцы центрифугировали при 12{14}}00 об/мин в течение 15 минут при 4°C. Супернатанты анализировали с помощью жидкостной хроматографии с быстрым разрешением Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 и масс-спектра QExactive. Условия хроматографии представлены в таблице 1. Аналиты разделяли на хроматографической колонке XBridge BEH Amide (2,1×100 мм; Waters Co., Милфорд, Массачусетс, США) с использованием 0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрила в качестве подвижных фаз А и В. , соответственно. Скорость потока устанавливали на 0,4 мл/мин, объем впрыска составлял 5 мкл, а температуру колонки устанавливали на 25°С (таблица 1). Сигналы масс-спектра были получены с использованием режимов сканирования положительных и отрицательных ионов. Напряжение ионного распыления и другие конкретные параметры МС показаны в таблице 2.

статистический анализ

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 и р< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">