CISTANCHE DESERTICOLA POLYSACHARIDES ослабляет диабетическую нефропатию у мышей, влияя на кишечную флору и ингибируя сигнальный путь, похожий на Toll, 4/ядерный фактор-κB

Аннотация: Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать амелиоративный эффект иПотенциальный механизм полисахаридов Cistanche Deserticola (CDP)наДиабетическая нефропатия (DN)у мышей. Модель мыши DN была установлена ​​с помощью питания с высоким содержанием жира (HFD) в сочетании с внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина (STZ). Тридцать шесть мышей C57BL/6N были случайным образом разделены на шесть групп (n=6 каждый). Все группы перорально вводили дистиллированной водой (контроль и модель), дапаглифлозин или CDP в течение 4 недель. Изменения в физиологических показателях, почечной функции,Воспалительные факторыи кишечная микробиота была оценена. Результаты показали, что CDP значительно улучшили общее состояние и ослаблялиПочечные гистопатологические изменения, иснижение уровня глюкозы в крови, мочевой белокиВоспалительные факторыу мышей DN. Кроме того, CDP влияли на баланс кишечной микробиоты, увеличивали численность полезных бактерий и снижение потенциальных патогенных бактерий, что, в свою очередь, улучшала кишечную барьерную функцию. CDP также ингибировали активацию сигнального пути сигнализации Toll-подобного рецептора 4/ядерного фактора-κB (TLR4/NF-κB) и снижали высвобождение липополисахарида (LPS). В заключение, CDP оказывают амелиоративное влияние на DN у мышей, влияя на микробиоту кишечника и ингибируя воспалительные сигнальные пути. Этот вывод предлагает новое представление о лечении DN.

 

Ключевые слова: полисахариды Cistanche Deserticola;Диабетическая нефропатия; кишечный барьер; кишечная флора; Toll-подобный рецептор 4; Ядерный фактор-κB

 

Экстракт Cistanche Deserticola с высококачественным сырью

Нажмите, чтобы получить более подробную информацию

 

 

 

Нефропатия диабета (DN)является основной причиной заболевания почек конечной стадии и серьезно угрожает жизни и здоровью пациентов [1]. Исследования подтвердили, что дисбаланс кишечной флоры играет важную патогенную роль в процессе диабета, развивающегося в DN [2-3]. Теория «Гут-Кидней оси» считает, что изменения в микроокружении кишечника могут влиять на прогрессирование хронической болезни почек, непосредственно регулируя метаболиты кишечной флоры [2-3]. Кишечная флора играет важную роль в регуляции почечной функции в моделях мыши DN [4-5]. Углубленные исследования по «осьму киндеи» помогут прояснить патогенез DN и обнаружить новые цели для профилактики и лечения.
Cistanche Deserticola - это традиционное лекарственное и съедобное растение, также известное как Cistanche Deserticola, Dijing, Jinsun и т. Д., Обычно известный как Dayun, и имеет репутацию «пустынного женьшеня» [6]. Согласно фармакопеей Китайской Народной Республики, Cistanche Deserticola является сушеным мясистым стеблем с чешуйчатыми листьями Cistanche Deserticola yc Ma или C. tubulosa (Schenk) Wight, растением рода Cistanche в семействе Orobanchaceae.
Среди них Cistanche Deserticola имеет долгую историю использования в качестве лекарства и пищи. Cistanche Deserticola сладкая, соленая и теплая по своей природе и входит в почку и меридианы с большой кишкой. Он обладает последствиями тонизирующей почки ян, приносящего пользу сущности и кровью, а также увлажнения кишечника и избавления запоров [7-8]. Полисахариды являются одним из основных активных ингредиентов Cistanche Deserticola. Содержание полисахаридов в водном экстракте Cistanche Deserticola относительно высокое. В основном он состоит из моносахаридов, таких как глюкоза, галактоза, рамноза, арабиноза и фруктоза. Он обладает многими фармакологическими эффектами, такими как регулирование иммунной активности, антивозрастное, улучшение обучения и памяти, защита нервов, противодействие повреждению печени, антивирус и антиопухол [9-12]. Предыдущие исследования исследовательской группы показали, что водный экстракт Cistanche Deserticola оказывает потенциальное терапевтическое влияние на DN [13]. Основываясь на этом, этот эксперимент принял кишечную флору и воспалительную реакцию в качестве отправной точки для изучения влияния полисахаридов Cistanche Deserticola (CDP) на улучшение DN у мышей и восстановление функции почек, чтобы обеспечить научную основу для роли CDP в лечении DN.

1 материалы и методы

1.1 Животные, материалы и реагенты

36 6- Ведущий C57BL/6J Мужчина-мышей были приобретены в Центре экспериментов на животных Синьцзян Медицинский университет, лицензия на животноводство №: scxk (xin) 2023-0006; Решение этики №: IACUC -20210331-04.
Desert CDPS (полисахаридная масса фракция ＞ 80%, партия номера: 2306019) Компания Shaanxi Xintianyu; Дапаглифлозин (DAPA; партия номер: 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; Моча общий белок (общий белок мочи, UTP; Партяный номер: c 035-2-1), азот мочевины (азот крови мочевины, BUN; пакетный номер: c 013-2-1), креатинин (креатинин, cre; batch №: C {5}}), uric wind (uricacid, UA; Нанкинский биоинженерский институт Нанкин Цзяньчэн; Липополисахарид (LPS; партия номер: yx -121619 M), интерлейкин -6 (il -6; партия номера: yx-e20012), IL -1 (количество номера пакета: yx-e20533), трансформирующий фактор роста. YX-E20217), Фактор некроза опухоли- (TNF-; Партный номер: YX-E20220) Kit Shanghai Youxuan Biological Co., Ltd.; Enhanced Chemiluminescene (ECL) Kit Pekijing Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Стрепптозотоцин (STZ; Партия номера: 20230503), диета с высоким содержанием жиров (60% соотношения жира с высоким содержанием жира, очищенный тип диеты, материальный номер: Boaigang12492M) Пекин Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
Основной корм (содержащий 22% кукурузных муки, 12% отрубей, 18% остатков масла, 8% рыбной еды, 12% соевого блюда, 0. 17% соль, 0. 25% витаминов, 0. Синьцзян Медицинский университет.

 

1.2 Инструменты и оборудование

AE240 Analytical Balance, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Швейцария; DHG -9053 Электрическая нагревательная сушка, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 Постоянная температура водяная баня, Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co., Ltd.; 3-18 KS высокоскоростная низкотемпературная центрифуга, Sigmaaldrich, USA; BS -380 Полностью автоматический биохимический анализатор, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 Slicer, HI1220 Slicer, Leitz Optilux Digital Microscope, Leica, Германия; Fluorchem E Хемилюминесцентная система визуализации, белок, США.

1.3 Методы

1.3.1 Эксперимент на животных

36 C57BL/6J мышей -мужчин получали в лаборатории SPF в медицинском университете Синьцзян и свободно питались. Эксперимент проводился после 7 дней адаптивного кормления. Шесть мышей были выбраны случайным образом в качестве нормальной (контрольной) группы и дали базовую диету. Остальные экспериментальные группы получали диету с высоким содержанием жиров и хранились в отдельных клетках. Вес тела проверялась раз в неделю. Мыши могли свободно есть и пить воду. Через 6 недель питания с высоким содержанием жиров экспериментальным группам мышей вводили STZ 4 0 мг/кг внутрибрюшинно в течение 5 последовательных дней в дополнение к бесплатной диете с высоким содержанием жиров каждый день. Глюкоза в крови натощак после моделирования составляла 11,1 ммоль/л, что считалось успешной моделью диабета. Thirty mice with successful modeling were randomly divided into five groups, with six mice in each group, namely the model (distilled water + high-fat diet, Model) group, Dapa (Dapa 4 mg/kg + high-fat diet, Dapa) group, CDPs low-dose (50 mg/kg + high-fat diet, CDPs-L) group, CDPs medium-dose (100 mg/kg + high-fat diet, CDPs-M) group, и CDPS Высокая доза (200 мг/кг + диета с высоким содержанием жиров, CDPS-H) группа. Контрольной группе (дистиллированная вода + нормальная диета) давалось равное количество дистиллированной воды. Каждую мышь была накоплена на 0,1 мл/10 г, один раз в день одновременно, в общей сложности 4 недели. В массе тела и изменения глюкозы в крови были зарегистрированы еженедельно.

1.3.2 Определение индекса

После 4 недель введения желудочного обеспечения образцы мочи (24 часа) и свежие фекалии собирали с помощью метаболических клеток в конце 4 -й недели и хранились в -20 степень и -80 степень соответственно. Мыши были голоданы, но не поливали в течение 12 часов. На следующий день был измерен вес тела натощак у мышей. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 3 мл/кг 10% раствора хлорального гидрата. Кровь собирали с орбит и центрифугировали в центрифуге (4 градуса, 3 500 r/min) в течение 15 минут. Супернатант был аспирирован, упакован и хранился в холодильнике -80 для последующего использования. Сыворотку измеряли для BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- и LPS в соответствии с набором. Мочу измеряли в течение 24 часов UTP в соответствии с набором.

 

1.3.3 Морфологическое и патологическое наблюдение за почками и кишечником

1.3.3.1 Определение коэффициента почек

После сбора крови мышей анестезировали до смерти путем передозировки, а почки и колонны были полностью удалены и сразу же промывали с физиологическим раствором, истощенным на фильтровальной бумаге и взвешивались. Коэффициент почки рассчитывал в соответствии со следующей формулой: коэффициент почек/%= × 100 м1 м, где M1 - влажный вес почки/г; М - вес тела мыши/г.

 

1.3.3.2 Патологическое наблюдение за почками

Mouse kidneys were fixed in 4% paraformaldehyde fixative, dehydrated by ethanol solution gradient, transparentized by xylene, embedded in paraffin, sliced ​​​​(thickness 2 μm), dewaxed by xylene, and hydrated by ethanol solution gradient, and then stained with hematoxylin & eosin (H&E), Masson, and periodic acid-Schiff (PAS), Запечатаны, и изображения были собраны и наблюдались под микроскопом.

 

1.3.3.3 Кишечное патологическое наблюдение

The mouse intestine was fixed with 4% paraformaldehyde fixative, dehydrated with ethanol solution gradient, transparentized with xylene, embedded in paraffin, sliced ​​​​(thickness 2 μm), dewaxed with xylene, and hydrated with ethanol gradient, then stained with H&E and Alcian blue (AB)-PAS for sealing, and images were collected under a microscope for observation.

 

 

1.3.4 Анализ композиции кишечной флоры

Содержание толстой кишки мышей в контрольной группе, модельной группе и группе CDPS-H было обнаружено с помощью высокопроизводительного секвенирования гена 16S рРНК. Экстракция ДНК и конструкция библиотеки и секвенирование микроорганизмов в содержании толстой кишки были завершены Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., и полученные данные были проанализированы на облачной платформе Lianchuan.

 

1.3.5 Обнаружение экспрессии белка, связанного с почками и толстой кишкой,

Белки для почек мыши и ткани толстой кишки были экстрагированы, и белок количественно определяли методом количественного определения белка бицинхониновой кислоты. После денатурации белка белок хранили в холодильнике {0}}. 10% электрофорез натрия додецилсульфат-полиакриламидный гель, перенос поливинилиденди дифторидной мембраны, мембрану помещали в забуференный инкубационный резервуар TRIS и блокируют при комнатной температуре. Обнаружение
Первичные антитела к Toll-подобным рецепторам (TLR) 4, ядерный транскрипционный фактор (NF) -κB P65, P-NF-κBP65 и -Actin в ткани почек (антитело, разбавленное 1: {9}} (V/V) с раствором TBST) и окклюзин и Zonula Occludendens -1}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}} {10}}}} {10}}} {10}. (Zo -1) в ткани толстой кишки (антитело разбавлено 1: 1 000 (V/V) с помощью раствора TBST) инкубировали при 4 градуса в течение ночи. Разбавление TBST, вторичное антитело (антитело
Разбавлено раствором TBST 1∶ 2 000 (V/V)), инкубированным при комнатной температуре в течение 1 часа, промыта TBST 3 раза, а затем обнаружили путем добавления люминесцентного реагента ECL, а визуализация геля использовалась для обнаружения экспрессии белка. -Актин использовали в качестве внутренней ссылки, а значение белка серого было проанализировано с помощью программного обеспечения ImageJ. Экспрессия белка каждой группы была выражена как относительное значение серой значения контрольной группы.

 

1.4 Статистика данных

Все результаты данных были выражены как ± S, и SPSS 21. 0 использовали для статистического анализа. Для непрерывных данных, если они следовали нормальному распределению, для межгруппового сравнения использовался односторонний дисперсионный анализ. Если разница между группами была статистически значимой, метод Турции дополнительно использовался для парного сравнения; Если данные следовали за нормальным распределением, для межгруппового сравнения использовался тест Kruskal-Wallis H. Когда между группами была статистическая разница, метод наименее значимой разницы Дурбина был дополнительно использован для множественных сравнений. P <0. 05 указал, что разница была статистически значимой.

 

 

2 результаты и анализ

2.1 Влияние CDP на глюкозу в крови, вес тела и коэффициент почек C57BL/6J

Как видно из таблиц с 1 до 3, по сравнению с контрольной группой, глюкоза мышей натощак в модельной группе была значительно увеличена (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Таблица 1 Влияние CDP на глюкозу в крови мышей (n=6)

Группа	Время/неделя
	0	1	2	3	4
Контроль	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Модель	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Дапа	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Блок: MMOL/L.

 

Таблица 2 Влияние CDP на индекс почек мышей (n=6)

 

Группа	Контроль	Модель	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Дапа
Почка/вес тела %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Таблица 3 Влияние CDP на массу тела мышей (n=6)

 

Группа	Время/неделя
	0	1	2	3	4
Контроль	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Модель	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Дапа	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Влияние CDP на почечную функцию мышей C57BL/6J

Как показано в таблице 4, по сравнению с контрольной группой, концентрациями BUN, CRE и UA в сыворотке и 24 -часовой массовой концентрации UTP в моче мышей в модельной группе были значительно увеличены (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Таблица 4 Влияние CDP на BUN, CRE, UA и 24 H UTP у мышей DN (n=6)

Группа	Концентрация булочки (ммоль/л)	Концентрация CRE (мкмоль/л)	Концентрация контента UTP 24 ч (мг/мл)	Концентрация UA (μmmol/L)
Контроль	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Модель	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Дапа	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Влияние CDP на воспалительные факторы и массовую концентрацию LPS в сыворотке мышей C57BL/6J

 

Как показано в таблице 5, по сравнению с контрольной группой, уровни сыворотки TNF-, IL -1, IL -6, TGF- и LPS у мышей в модельной группе были значительно увеличены (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
Эффект группы CDPS-H был значимым (p ＜ 0. 0 5 или p ＜ 0. 01), и эффект группы CDPS-H был значительным (P ＜ 0,01).

Таблица 5 Влияние CDP на воспалительные факторы и LPS у мышей (n=6)

 

Группа	Массовая концентрация (PG/мл)
	TNF-	Il -1	Il -6	TGF-	LPS
Контроль	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Модель	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Дапа	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Влияние CDP на почечную патологию мышей C57BL/6J

Как показано на рисунке 1, после окрашивания H & E было обнаружено, что гломерулярная структура и морфология мышей в контрольной группе были нормальными, а ясная, базальная мембрана была гладкой, гломерулярная морфология была регулярной, почечная межстепляция была нормальной, почечные канальцы были деталично расположены, и не было инфляторной инфляционной клеточной инфляции. По сравнению с контрольной группой, гломерулярный объем мышей в модельной группе был увеличен, базарную мембрану утолщали, воспалительные клетки инфильтрировали вокруг нее, а почечные канальцы обнаружили и расширяли; По сравнению с модельной группой, группы введения CDPS имели различные степени улучшения по почках мыши. Клоломерулярный объем мышей в группах CDPS-M и CDPS-H был значительно снижен, толщина базальной мембраны была снижена, лишь небольшое количество воспалительных клеток инфильтрировали, а почечные канальцы значительно восстанавливались и были плотно расположены. После 4 недель вмешательства CDP вышеуказанные патологические условия были восстановлены в различной степени.

Окрашивание Массона показало, что почечные канальцы мышей в контрольной группе обычно располагались нормально, а гломерули были в нормальной форме, пролиферации коллагенового волокна не наблюдалось, а трубчатые базальные мембраны были видны; Большое количество окрашенного коллагена наблюдалось в почечной интерстициальной ткани мышей в модельной группе, а интерстициальная фиброзная ткань была объединена и ретикулярно пролиферирована; Клоломерулярный объем мышей в группе CDPS-M был уменьшен, а симптомы пролиферации фиброзной ткани были облегчены; Почечные канальцы мышей в группе CDPS-H были расположены более регулярно, и наблюдалось небольшое количество пролиферации коллагенового волокна.

Результаты окрашивания PAS показали, что гломерули мышей в контрольной группе были нормальными по объему и не повреждены по структуре; Мыши в модельной группе имели повреждение почек, объем клубочков был больше, чем обычно, а форма была нерегулярной, а мезангиальная матрица была отложена; По сравнению с модельной группой было смягчено повреждение почек мышей в каждой обработанной лекарственной группе, а при увеличении дозы форма и размер клубочкового уровня, как правило, была нормальной, а степень осаждения мезангиального матрикса была уменьшена. Результаты показывают, что CDP могут облегчить повреждение ткани почек у мышей DN.

 

Рис. 1 Влияние CDP на гистопатологические изменения почечных мышей DN, исследованные по окрашиванию H & E, Masson и PAS (× 400)