Полисахариды Cistanche Deserticola обладают нейропротекторным эффектом

для получения дополнительной информации:Ali.ma@wecistanche.com

Юэ Лю и др.

Абстрактный:

Ишемический инсульт – заболевание с высокой заболеваемостью и смертностью.Цистанхепустыняполисахариды(ЦДП) обладают широким спектром полезных эффектов, включая гепатопротекцию и иммунный гомеостаз. Насколько нам известно, защитный эффект CDP(КистАнчепустыняполисахариды)на нейронах, поврежденных кислородно-глюкозной депривацией/реперфузией (OGD/RP), не исследовалась. В этом исследовании OGD/RP повредил клеточную модель PC12. Коротко о CDP.(КистАнчепустыняполисахариды)({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл) вводили перед реперфузией. Защитный эффект CDP(КистАнчепустыняполисахариды)затем оценивали на основе жизнеспособности клеток, утечки лактатдегидрогеназы (ЛДГ), [Ca2 плюс] I, митохондриального мембранного потенциала (ММП) и клеточного апоптоза, а окислительно-восстановительный статус после реперфузии оценивали путем анализа активных форм кислорода (АФК), каталазы ( CAT), глутатионпероксидазы (GSH-Px) и общей антиоксидантной способности. Основываясь на том факте, что белок DJ-1, ассоциированный с болезнью Паркинсона, участвует в эндогенной антиоксидантной защите и выполняетнейропротекторныйэффекты после ишемического инсульта, мы исследовали взаимодействие CDP(КистАнчепустыняполисахариды)и DJ{{0}}. Экспрессию DJ-1 определяли с помощью ELISA и вестерн-блоттинга, а транслокацию DJ-1 оценивали с помощью иммунофлуоресценции. Результаты показали, что CDP (0.05, 0,5 и 5 мкг/мл) ослаблял гибель клеток PC12, сохраняя ММР и кальциевый гомеостаз; ингибирует окислительный стресс и снижает клеточный апоптоз. Более того, CDP (5 мкг/мл) заметно стимулировал секрецию и экспрессию DJ-1. В целом, результаты показали, что CDP(КистАнчепустыняполисахариды)оказываетнейропротекторныйэффект против повреждения, вызванного OGD/RP, за счет ингибирования окислительного стресса и регуляции пути DJ-1

Ключевые слова:Цистанхе пустыни, Полисахариды, Нейропротекторы, Депривация кислорода/глюкоза/реперфузия, Окислительный стрессDJ-1

Нажмите, чтобы перейти к продуктам Cistanche UK

1. Введение

Ишемический инсульт является второй ведущей причиной смертности и основной причиной длительной нетрудоспособности во всем мире [1]. Ожидается, что смертность от инсульта возрастет до 7,8 млн в 2030 году [2]. В Китае от инсульта ежегодно умирают от 58 до 142 человек на 100 000 человек. Таким образом, необходимо разработать эффективные стратегии, устраняющие ишемически-реперфузионное повреждение. Обширные данные подтверждают, что окислительный стресс является основным фактором, способствующим развитию и прогрессированию инфаркта мозга во время реперфузии [3,4]. Таким образом, выявление эффективныхнейропротекторныйагенты, способные снижать АФК и подавлять окислительный стресс, вызывают значительный интерес в исследованиях. Белок, ассоциированный с болезнью Паркинсона, DJ-1 опосредует нейропротекцию, стимулируя экспрессию антиапоптотических и антиоксидантных генов [4,5]. DJ-1 может транслоцироваться в митохондрии в результате окислительного стресса и стимуляции митогенами и может секретироваться во внеклеточный матрикс при патологических состояниях, таких как рак молочной железы, меланома и повреждение OGD/RP [6]. Более того, DJ-1 полезен для терапевтического воздействия на ишемическую нейродегенерацию благодаря его решающей роли в антиоксидантной защите [4,7]. За последние 10 лет несколько групп подтвердили, что DJ-1нейропротекторныйвоздействие на модели фокальной ишемии головного мозга in vivo и модели OGD/RP in vitro [6–9]. Между тем, некоторые препараты, в том числе циклоспорин А и фенилбутират натрия, останавливают гибель нейронов посредством DJ-1 повышающей регуляции ишемического инсульта [9,10]. ].

Цистанхепустыня, цельное сушеное растениеЦистанхепустыняYCMa и Cistanche tubulosa Wight, производится в основном в пустынных районах северного и северо-западного Китая [11]. C. Deserticola съедобен и был удостоен звания «Женьшень пустыни». В акупунктурных препаратах используется для лечения хронической почечной недостаточности, полового бессилия, женского бесплодия, белей, метроррагии и старческих запоров [12].C. пустынные полисахариды, основной активный компонент, выделенный изЦистанхе пустыня. CDP модулирует иммунную функцию и липидный баланс и обеспечивает защиту от старения, окисления и повреждения печени. Кроме того, CDP(КистАнчепустыняполисахариды)предотвращает ишемически-реперфузионное повреждение сердца и печени [13,14]. Недавние исследования показали, что CDP(КистАнчепустыняполисахариды)нетоксичны [12, 15, 16], а другие фитохимические вещества, извлеченные из C. Deserticola, включая эхинакозид, изоактеозид, актеозид и салидрозид, проявляютнейропротекторныйэффекты [11,12]. Однако до сих пор не сообщалось о потенциальном использовании CDP для улучшения состояния после ишемического инсульта.

В настоящем исследовании мы предполагаем, что CDP(КистАнчепустыняполисахариды)ингибирует окислительный стресс для нейропротекции. Потенциальные защитные эффекты CDP(КистАнчепустыняполисахариды)Повреждения при ишемическом инсульте исследовали с использованием поврежденных OGD/RP клеток PC12. Затем были изучены основные взаимодействия, связанные с DJ-1.

2. Методы

2.1. Культура клеток и модель OGD/RP

Клетки PC12 культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10 процентов FBS, при 37° в нормоксическом инкубаторе, содержащем 5 процентов CO2. Среду заменяли каждые 48 часов. Была подготовлена ​​модель OGD/RP. Клетки PC12 промывали и обрабатывали сбалансированным солевым раствором Эрла. Затем клетки переносили в анаэробную камеру, содержащую 5 процентов CO2 и 95 процентов N2, при 37 градусах на 4 часа, а затем давали им пройти реоксигенацию. На этом этапе к клеткам добавляли такой же объем культуральной среды. После реоксигенации клетки помещали в нормоксический инкубатор на 24 часа.

2.2. Администрация лекарств

CDP(КистАнчепустыняполисахариды)был приобретен у компании Yuanye Biological Technology Co., Шанхай, Китай (C23J7Y18405, чистота > 98%). Нимодипин, препарат первой линии для профилактики ишемического инсульта, использовали в качестве положительного контрольного соединения [17–19]. Инъекция нимодипина производилась компанией Bayer. Клетки были случайным образом разделены на шесть групп, а именно: контроль, носитель (OGD/RP), нимо (5 мкг/мл), CDP.(КистАнчепустыняполисахариды)(0,05 мкг/мл), CDP(КистАнчепустыняполисахариды)(0,5 мкг/мл) и CDP (5 мкг/мл). Нимодипин и CDP(КистАнчепустыняполисахариды)добавляли перед реперфузией. Контрольную группу культивировали в нормальной среде и инкубировали в нормоксических условиях.

2.3. Жизнеспособность клеток: анализы MTT и NRU

Клетки PC12 (6 × 103 на лунку) высевали в культуральный планшет с 96-лунками. Клетки обрабатывали в соответствии с требованиями каждой группы. К клеткам добавляли МТТ (Solarbio, Китай) в концентрации 5 мг/мл и инкубировали 4 ч при 37°С. Формазан является продуктом восстановления сукцинатдегидрогеназы в живых клетках [20]. Для растворения образовавшегося синего формазана добавляли ДМСО. Поглощение при длине волны 490 нм определяли с помощью устройства для считывания микропланшетов (Thermo, США) после встряхивания клеток в течение 10 мин при 25°С. Результаты жизнеспособности клеток выражали в процентах от контрольной группы [21].

Анализ поглощения нейтрального красного (NRU) проводили в соответствии с ранее опубликованным протоколом [22]. По окончании реперфузионных периодов к клеткам добавляли нейтральный красный (Solarbio, Китай) в концентрации 50 мкг/мл. Смесь инкубировали 3 часа. Затем клетки быстро промывали раствором, содержащим 0,5% формальдегида и 1% хлорида кальция. Затем клетки добавляли к смеси, содержащей 1% этиловой кислоты и 50% безводного этанола. Планшеты считывали при поглощении при 540 нм после встряхивания клеток в течение 20 мин при 37°С. Результаты жизнеспособности клеток выражали в процентах от контрольной группы.

Цистанхе пустынная полисахаридыестьНейропротекторный эффект

2.4. Оценка цитотоксичности

ЛДГ представляет собой цитоплазматический фермент, катализирующий окисление лактата топируватом. ЛДГ быстро высвобождается во внеклеточную жидкость при повреждении клеточной мембраны. Поэтому определение ЛДГ обычно проводят для оценки цитотоксичности. [23]. Экспериментальная процедура следовала инструкциям коммерческого набора, поставляемого набором для анализа LDH (Jiancheng, Китай). Поглощение каждого образца определяли при 440 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов. Процент гибели клеток рассчитывали по следующей формуле: Жизнеспособность (в процентах)=(OD обработка - ODT обработка пустой)/(OD Max активность LDH - OD Max активность LDH пустой) × 100 процентов.

2.5. Обнаружение внутриклеточного Ca2 плюс концентрация

Внутриклеточную концентрацию Ca2 plus измеряли с помощью Fluo-3/AM [15]. Клетки PC12 трижды промывали PBS и затем инкубировали с 2 мкМ Fluo-3/AM (Beyotime, Китай) в течение 30 мин при 37° в темноте. Затем клетки трижды промывали PBS для очистки от внеклеточного красителя. Интенсивность флуоресценции Fluo-3/AM определяли на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе (Olympus, Япония). Программный пакет Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer и ImageJиспользовались для расчета значений шкалы серого.

2.6. Измерение ММП

JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'-тетраэтилимидакарбоцианин; Beyotime, Китай) представляет собой удобный чувствительный к напряжению зонд, обычно используемый для окрашивания клеток и оценка ММР [24]. Клетки РС12 дважды промывали холодным PBS, а затем инкубировали со смесью, содержащей 50% среды и 50% рабочей жидкости, в течение 15 мин при 37°С в темноте. Затем смесь удаляли и заменяли свежей средой. Изображения красной и зеленой флуоресценции были получены с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Относительное соотношение красного и зеленого сигналов флуоресценции использовали для измерения ММП [25]. Программный пакет Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer и ImageJ использовались для расчета значений шкалы серого.

2.7. Анализ обнаружения апоптоза, Hoechest33342 и анализ проточной цитометрии

Hoechst33342, ДНК-связывающий краситель, использовали для исследования клеточного апоптоза [26]. После реперфузии клетки РС12 трижды промывали PBS и инкубировали с Hoechst33342 (Beyotime, Китай) в концентрации 5 мкг/мл в течение 15 мин при 37° в темноте. Затем клетки наблюдали под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом. Апоптотические клетки проявляли интенсивную синюю флуоресценцию и конденсацию ядер. Для каждого эксперимента по окрашиванию фиксировали и количественно определяли три случайных поля. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer и ImageJ использовались для расчета значений шкалы серого. Процент апоптотических клеток рассчитывали по следующей формуле: апоптозное количество/общее количество × 100 процентов [27].

2.8. Измерение образования АФК

Флуоресцентный зонд 2',7'-дихлорфлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA; Jiancheng, Китай) может проникать через клеточные мембраны и гидролизоваться до нефлуоресцентного DCFH. DCFH окисляется внутриклеточными АФК до флуоресцентного DCF [29]. После реперфузии клетки дважды промывали PBS, а затем инкубировали с DCFH-DA в конечной концентрации 10 мкМ в течение 45 мин при 37° в темноте. Флуоресценцию наблюдали с помощью флюоресцентного спектрофотометра с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны испускания 535 нм.

Цистанхе пустынная полисахаридыестьНейропротекторный эффект

2.9. Определение показателей окислительного стресса: уровни CAT, GSH-Px и T-AOC.

Клетки соскребали и ресуспендировали в PBS. Полученные клеточные суспензии обрабатывали ультразвуком 45 раз на льду и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты сохраняли и использовали для детекции [24]. Содержание общего белка в супернатанте клеток измеряли с помощью набора реагентов для анализа белка ВСА (KeyGEN, Китай). Активность уровней CAT, GSH-Px и T-AOC измеряли в соответствии с инструкциями производителей (Jiancheng, Китай). Поглощение каждого образца определяли с помощью устройства для считывания микропланшетов.

2.10. Измерение внеклеточной концентрации DJ-1

Клетки PC12 (6 × 103 на лунку) высевали в 96-луночные культуральные планшеты. После реперфузии супернатант клеток собирали и анализировали с помощью набора DJ-1/PARK-7 ELISA (Raybio, США). ) согласно инструкции производителя [9]. Поглощение каждого образца определяли с помощью устройства для считывания микропланшетов при двойной длине волны 450 нм или 540 нм.

2.11. Вестерн-блот анализ

Клеточные белки экстрагировали ледяным буфером для лизиса в соответствии с инструкциями производителей (KeyGEN, Китай). Концентрацию белка определяли с помощью набора реагентов для анализа белка BCA. Равные количества белковых лизатов (20 мкг) из каждой группы разделяли электрофорезом в 12-процентном додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали с PBS, содержащим 5% обезжиренного молока, в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем зондировали антителами против PARK7/DJ-1 (ab76008, Abcam; разведение 1:1000) в течение ночи при 4°С. Затем мембрану трижды промывали PBST и инкубировали со вторичными козьими антителами к IgG кролика (SA00001-2, Proteintech Group, разведение 1:5000) при комнатной температуре в течение 2 часов. В качестве контроля рассматривали антитело к - -тубулину (10759-1-AP, Proteintech Group; разведение 1:1000). Белковые полосы визуализировали с помощью реагентов для реакции усиленной хемилюминесценции (ECL). Плотность полос измеряли с помощью программного обеспечения QuantityOne Analysis v.4.6.9.

2.12. Иммуноцитохимический анализ

Клетки PC12 после реперфузионной обработки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре [9]. После удаления избытка параформальдегида клетки инкубировали в PBS, содержащем 0,3% Triton X-100, в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки трижды промывали PBS, а затем инкубировали с 5% нормальной козьей сывороткой в ​​течение 1 часа. Затем клетки инкубировали с кроличьим мышиным моноклональным антителом против АТФ-синтазы (MABS1304, EMD Millipore, разведение 1:200) для окрашивания митохондрий, а затем инкубировали с антителом против PARK7/DJ-1 (разведение 1: 100) для зондирования белка DJ-1. Клетки промывали и инкубировали с козьим антикроличьим IgG-Alexa 488 (зеленый; A11034, Invitrogen; разведение 1:1000) и козьим антимышиным IgG-Alexa 594 (красный; A11032; Invitrogen; разведение 1:1000) в течение 90 с. мин. Наконец, клетки трижды промывали PBS и помещали на предметные стекла с монтажной средой, содержащей DAPI. Иммунофлуоресцентные изображения визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Цистанхе пустынная полисахаридыестьНейропротекторный эффект

2.13. Данные/статистический анализ

Все значения были показаны как среднее значение ± стандартное отклонение. Значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественного сравнения Даннета. p < .05="" рассматривали="" как="" статистическую="" значимость.="" экспериментальные="" данные="" были="" проанализированы="" с="" использованием="" статистической="" программы="" spss="">

3. Результаты

3.1. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)ингибирует повреждение клеток, вызванное OGD / RP

Клетки PC12, подвергшиеся воздействию OGD/RP, демонстрировали значительное уменьшение количества. Форма клеток была изменена, а клеточная мембрана разрушена. В анализе МТТ жизнеспособность клеток в CDP(КистАнчепустыняполисахариды)группы ({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл) составили 58,91% ± 5,40%, 61,13% ± 3,81% и 68,57% ± 3,24% соответственно, p < 0,05="" (рис.="" 1a).="" ,="" а="" с="" транспортным="" средством="" -="" 51,68%="" ±="" 3,89%.="" эти="" значения="" указывали="" на="" то,="" что="">(КистАнчепустыняполисахариды)защищали клетки от повреждения OGD/RP и уменьшали гибель клеток. Кроме того, жизнеспособность клеток в группе Nimo составила 77,02% ± 5,22%, что почти равно таковому в группе 5 мкг/мл CDP.(КистАнчепустыняполисахариды)обработанная группа.

В анализе NRU жизнеспособность клеток в CDP(КистАнчепустыняполисахариды)группы ({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл) составляли 52,03 процента ± 4,72 процента, 58,49 процента ± 2,50 процента и 69,17 процента ± 3,91 процента соответственно (рис. 1B), и что с транспортным средством было 47,14% ± 2,88%. Значения указывают на зависящий от концентрации защитный эффект ЦДФ.

В отличие от носителя (44,73% ± 3,30%), высвобождение ЛДГ было значительно снижено в ЦДФ.(КистАнчепустыняполисахариды)группы. В CDP(КистАнчепустыняполисахариды)группах ({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл), показатели утечки ЛДГ составили 32,41% ± 3,70%, 27,13 ± 2,79% и 23,13% ± 4,59% соответственно, p < 0,01="" (рис.="" 1с).="" более="" того,="" показатели="" утечки="" лдг="" в="" группе="" нимо="" составили="" 21,99%="" ±="" 4,02%,="" что="" было="" почти="" таким="" же,="" как="" в="" группе,="" получавшей="" 5="" мкг/мл="">

3.2. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)ослабленное OGD/RP-индуцированное увеличение [Ca2 plus ]i

Уровни внутриклеточного Ca2 plus в клетках PC12 были повышены до 4146,60 ± 195,97 после повреждения OGD / RP в отличие от контрольной группы (373,62 ± 75,69). CDP(КистАнчепустыняполисахариды)группы ({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл) могли дозозависимо снижать внутриклеточный уровень Са2 плюс до 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 и 1768,43 ± 426,12 соответственно (рис. 2А и С). ). Кроме того, уровень Ca2 plus в группе, получавшей 5 мкг/мл CDP, снизился до уровня, сравнимого с уровнем в группе Nimo (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)ослабленная OGD/RP-индуцированная диссипация MMP

По сравнению с контрольной группой (1,67 ± 0,89), группа с носителем (0,48 ± 0,10) демонстрировала более выраженную флуоресценцию зеленого FL, чем красного FL. флуоресценция (рис. 2B и D). Отношения между красной и зеленой флуоресценцией FL уменьшились до 1,11 ± 0,26 и 1,18 ± 0,16 в 0,5 и 5 мкг/мл CDP.(КистАнчепустыняполисахариды)обработанные группы соответственно, p < 0,01.="" зеленая="" флуоресценция="" фл="" была="" значительно="">

3.4. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)предотвращает апоптоз клеток, вызванный OGD/RP

Клетки с конденсированным хроматином или фрагментированными ядрами оценивали как апоптотические клетки [30]. Результаты анализа Hoechst33342 выявили появление конденсированных ядер после OGD/RP (рис. 3A и C). Высокая интенсивность флуоресценции FL наблюдалась в ядрах в группе с носителем. Интенсивность флуоресценции ядер ФЛ была ослаблена в 5 мкг/мл CDP.(КистАнчепустыняполисахариды)обработанная группа. Мы проанализировали скорость апоптоза в клетках PC12 с помощью сходной цитометрии с использованием двойного окрашивания FITC-аннексин V/PI (рис. 3B и D). В контрольной группе скорость апоптоза клеток составила 4,16% ± 0,24%, тогда как в группе с носителем она составила 22,98% ± 0,66%. В группе, получавшей 5 мкг/мл ЦДФ, скорость клеточного апоптоза составила 7,86 процентов ± 1,16 процента.

3.5. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)ослабленное OGD/RP-индуцированное внутриклеточное накопление АФК и сохраненный окислительно-восстановительный статус

Эффекты CDP(КистАнчепустыняполисахариды)на окислительный стресс были продемонстрированы на основе образования АФК, активности GSH-Px, CAT и уровней T-AOC. Уровни АФК в клетках PC12, поврежденных OGD/RP, увеличились и стали значительно выше, чем в контрольной группе (p < 0,01).="" между="" тем,="" уровни="" афк="" в="">(КистАнчепустыняполисахариды)группы ({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл) снижались дозозависимым образом (p < 0,01;="" рис.="" 4a).="" кроме="" того,="" cdp="" также="" значительно="" увеличивал="" уровни="" t-aoc="" (p="">< 0,05;="" рис.="" 4b),="" cat="" (p="">< 0,05;="" рис.="" 4c)="" и="" gsh-px="" (p="">< 0,05;="" рис.="" 4d)="" по="" сравнению="" с="" носителем.="" группа.="" активность="" эндогенных="" антиоксидантов="" в="">(КистАнчепустыняполисахариды)группы увеличились.

3.6. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)стимулировал секрецию DJ-1 и усиливал экспрессию DJ-1

Изменения концентрации DJ-1 в супернатанте клеток были обнаружены и выявили возможную связь между DJ-1 и CDP(КистАнчепустыняполисахариды). Высвобождение DJ-1 наблюдали из клеток PC12, поврежденных OGD/RP (рис. 5). DJ-1 значительно активировался в CDP в концентрации 5 мкг/мл.(КистАнчепустыняполисахариды)в группе, получавшей лечение (38,66 ± 8,44 пг/мл), и стало значительно выше, чем в группе, получавшей носитель (18,33 ± 3,80 пг/мл, p < 0,01) и контрольной группе (9,67 ± 3,96 пг/мл, p < 0,01). .

Чтобы исследовать эффекты CDP(КистАнчепустыняполисахариды)на внутриклеточной экспрессии DJ-1 мы измерили уровни белка DJ-1 с помощью вестерн-блоттинга. Уровни экспрессии белка DJ-1 были значительно повышены через 24 часа после реперфузии. В противоположность этому последующая обработка 5 мкг/мл CDP значительно повышала сверхэкспрессию DJ-1 по сравнению с группой, получавшей носитель (p < 0,01,="" фиг.="">

3.7. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)усиленная транслокация DJ-1 в митохондрии

Клетки PC12 окрашивали антителами против PARK7/DJ-1 и против АТФ-синтазы (рис. 7 и 8). Цепь анти-АТФ-синтазы связывается с митохондриальным комплексом I, а связывающий антиген локализуется во внутренней мембране митохондрий. Результаты показали, что DJ-1 перемещается на внутреннюю мембрану митохондрий после инсульта OGD/RP (рис. 8). Между тем, результаты двойного окрашивания DJ-1 и митохондрий показали, что CDP(КистАнчепустыняполисахариды)облегчает митохондриальную транслокацию и совместную локализацию DJ- 1 (рис. 8). Эти результаты указывают на прямое взаимодействие между DJ-1 инейропротекторныйэффект CDP(КистАнчепустыняполисахариды)(рис. 9).

4. Дискуссия

В этом исследовании мы сообщили из первых рук, что CDP(КистАнчепустыняполисахариды)эффективно снижает повреждение клеток PC12, вызванное OGD/RP, за счет усиления активности белка DJ-1. CDP(КистАнчепустыняполисахариды)повышение жизнеспособности клеток, снижение повреждения клеточных мембран, поддержание внутриклеточного Ca2 плюс гомеостаз, предотвращение потери ММР, уменьшение клеточного апоптоза, подавление окислительного стресса, усиление экспрессии DJ-1 и усиление транслокации DJ-1 в митохондрии. DJ-1 недавно был замешан в регулированиинейропротекторныйэффект и целостность митохондрий. Эти результаты убедительно свидетельствовали онейропротекторныйэффекты CDP(КистАнчепустыняполисахариды)против ишемии. Кроме того, взаимодействие между CDP и DJ-1 играет важную роль.нейропротекторныйроль в OGD/RP-индуцированном повреждении клеток PC12. Вышеуказанные результаты могут способствовать нашему пониманию положительного эффекта CDP и могут предоставить полезную информацию для терапии инсульта в будущем.

Ишемический инсульт связывают со сложной серией биохимических и молекулярных механизмов, включая эксайтотоксичность, перегрузку кальцием и окислительный стресс [31]. OGD/RP широко используется в качестве модели ишемии-реперфузии in vitro и используется для исследования неврологических и биохимических изменений. Клеточная линия PC12 чувствительна к повреждению OGD/RP [2]. Он проявляет ряд свойств и характеристик симпатических нейронов [32] и, таким образом, широко используются линии нейрональных клеток для исследований, связанных с механизмами неврологического повреждения вследствие инсульта [33,34]. Многочисленные исследования показали, что окислительный стресс играет жизненно важную роль в повреждении головного мозга при инсульте и ишемии [35–37]. Белок DJ-1, ассоциированный с болезнью Паркинсона, может ингибировать ишемическую нейродегенерацию и поведенческую дисфункцию, уменьшая АФК-опосредованное повреждение нейронов [7]. Поэтому мы использовали клеточную модель OGD/RP-injury PC12 для исследованиянейропротекторныйэффект CDP(КистАнчепустыняполисахариды).

Степень повреждения клеток PC12, индуцированных OGD/RP, оценивали с помощью анализов высвобождения MTT, NRU и LDH. Администрация CDP(КистАнчепустыняполисахариды)({{0}}.05, 0,5 и 5 мкг/мл) улучшали выживаемость клеток и снижали высвобождение ЛДГ. Благоприятные эффекты лечения CDP также включали снижение внутриклеточной перегрузки кальцием и сохранение MMP. Аномалии внутриклеточной концентрации Са2 плюс, особенно митохондриальная перегрузка кальцием, были связаны с апоптозом нейронов и гибелью, вызванной ишемическим инсультом [38]. ММП может отражать эффективность электрон-транспортной цепи и была указана как показатель патологического расстройства этой системы [39]. Как повышение внутриклеточной концентрации Са2 плюс, так и потеря ММП могут привести к дестабилизации структуры нейронов и, в конечном итоге, к повреждению или гибели клеток [21,40]. В этом исследовании результаты показали, что CDP значительно ингибирует внутриклеточную перегрузку Ca2 плюс и повышает уровни MMP в клетках PC12 с повреждением OGD / RP. Апоптоз играет жизненно важную роль в сложной патофизиологии церебральной ишемии-реперфузии. Все больше данных свидетельствуют о том, что апоптоз связан с митохондриальной дисфункцией; диссипация ММР является ранним событием, приводящим к клеточному апоптозу [8,39]. Апоптоз — это процесс энергозависимой запрограммированной гибели клеток с целью избавления от избыточных клеток. Многие нейроны при ишемическом инсульте подвергаются апоптозу [41]. В этом исследовании мы выполнили окрашивание Hoechst33342 и Annexin V-FITC/PI, чтобы изучить влияние CDP на апоптоз [23,28]. Результаты показали, что CDP поддерживает целостность ядра и снижает скорость клеточного апоптоза. Все эти результаты указывают на то, что антиапоптотическая активность CDP способствует благоприятному эффекту при повреждении нейронов в клетках PC12.

Клетки подвергаются ишемическому повреждению, вызванному избыточным накоплением АФК, что может привести к перекисному окислению липидов, повреждению клеточных мембран, перегрузке кальцием и митохондриальной дисфункции, что в конечном итоге приводит к апоптозу и гибели клеток [42]. Потребление эндогенных антиоксидантов, таких как SOD, CAT и GSH-Px, также указывало на возникновение Рис. 9. Возможные механизмы защитного действия CDP(КистАнчепустыняполисахариды)против OGD/RP-индуцированного повреждения клеток PC12. Лечение CDP подавляет окислительный стресс, стабилизирует концентрацию Ca2 plus и MMP, усиливает экспрессию и локализацию DJ-1 в митохондриях. Ю. Лю и соавт. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678 окислительного стресса во время ишемии-реперфузии. В этом исследовании группа OGD/RP показала значительное увеличение ROS и снижение CAT, GSH-Px и T-AOC по сравнению с группой, получавшей 5 мкг/мл CDP. Однако мы наблюдали существенное снижение скорости образования АФК и потребления эндогенных антиоксидантов (CAT, GSH-Px и T-AOC) в группах CDP. Положительный эффект в группе 5 мкг/мл ЦДФ был близок к таковому в группе нимо. Результаты показали, что CDP ингибирует образование АФК и восстанавливает ферментативную антиоксидантную защиту.

DJ-1 является ключевым окислительно-восстановительнымнейропротекторныйбелок, участвующий в регуляции окислительного стресса при инсульте. Положительные эффекты избыточной экспрессии DJ-1 включают выживаемость клеток при ишемии-реперфузии и сохранение митохондриальной функции и морфологии, например, ускорение открытия пор при проницаемости митохондрий [39,43]. Предыдущие исследования показали, что защитный эффект DJ-1 в клетках, подвергшихся воздействию OGD/RP, связан с его антиоксидантными свойствами и транслокацией в митохондрии [43–45]. DJ-1 осуществляет эффективную эндогенную нейропротекцию, смягчая митохондриальные дефекты посредством транслокации [46]. Несколько исследований показали, что транслокация DJ-1 может влиять на движение митохондрий, усиливать межклеточное взаимодействие и способствовать другим процессам выживания клеток.

DJ-1 влияет на несколько процессов, таких как миграция и адгезия клеток, хемотаксис, пролиферация и апоптоз, как в моделях in vitro, так и in vivo [6,9,47,48]. Используя модель инсульта поврежденных клеток PC12 OGD/RP, мы исследовали потенциальную взаимосвязь между CDP(КистАнчепустыняполисахариды)и диджей-1. Сверхэкспрессию DJ- 1 идентифицировали с помощью ELISA и вестерн-блоттинга. Наряду с этой функцией основной вывод в экспериментах продемонстрировал, что значительная сверхэкспрессия DJ-1 происходит, когда CDP(КистАнчепустыняполисахариды)(5 мкг/мл) вводили перед реперфузией. Это предполагало возможнуюнейропротекторныйвлияние на отношения CDP и DJ-1. Более того, мы наблюдали, что DJ-1, локализованный в митохондриях в условиях OGD/RP, и обильная экспрессия DJ-1 снижали чувствительность клеток к АФК и ингибировали окислительный стресс [45]. Результаты показали, что CDP регулирует и усиливает DJ-1, который действует как молекулярная связь между дисфункцией митохондрий и окислительным стрессом и обеспечивает прогрессирование вторичной гибели клеток, присущей инсульту [5,47,49–51]. В тандеме со стабилизацией DJ-1 в митохондриях CDP(КистАнчепустыняполисахариды)лечение повышало выживаемость клеток, стабилизировало гомеостаз Са2+, улучшало диссипацию ММР и предотвращало апоптоз, связанный с митохондриями [43]. В целом, наши результаты показали, что CDP оказывает новоенейропротекторныйМеханизм лечения ишемического инсульта.

5. Вывод

Наши результаты показали, что CDP(КистАнчепустыняполисахариды)защищает клетки PC12 от повреждений, вызванных OGD/RP, благодаря своим антиоксидантным эффектам, которые частично связаны с DJ-1-опосредованным путем. Эти эффекты включают снижение скорости повреждения клеточной мембраны, сохранение гомеостаза [Ca2 плюс] I, улучшение диссипации ММР, ингибирование клеточного апоптоза, ослабление внутриклеточных АФК и модуляцию уровней DJ-1. Результаты также показали, что взаимодействия между CDP и DJ-1 усиливают нейропротекцию и поддерживают целостность митохондрий. Следовательно, уязвимые нейроны могут быть защищены с помощью CDP.(КистАнчепустыняполисахариды)за счет усиления экспрессии DJ-1 во время ишемического инсульта.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (грант 81360649), Национальной ключевой программой науки и технологий (грант 2015BAK45B01) и Программой поддержки науки и технологий Нинся-Хуэйского автономного района (грант 2016BZ07).

Цистанхе пустынная полисахаридыесть Нейропротекторный эффект

использованная литература

[1] HD Tsai, JS Wu, MH Kao, JJ Chen, GY Sun, WY Ong, TN Lin, Clinacanthus nutans защищает нейроны коры от токсичности, вызванной гипоксией, подавляя HDAC1/6, Neuromol. Мед. 18 (2016) 274–282.

[2] Дж. Чжао, Р. Лю, Инсульт 1-2-0: программа быстрого реагирования на инсульт в Китае, Lancet Neurol. 16 (2017) 27–28.

[3] П. М. Джордж, Г. К. Стейнберг, Новая терапия инсульта: раскрытие патофизиологии инсульта и ее влияние на клиническое лечение, Нейрон 87 (2015) 297–309.

[4] Х. Яо, Т. Аго, Т. Китазоно, Т. Набика, Патофизиология, связанная с NADPH-оксидазой, в экспериментальных моделях инсульта, Int. Дж. Мол. науч. (2017) 18.

[5] J. Cao, M. Ying, N. Xie, G. Lin, R. Dong, J. Zhang, H. Yan, X. Yang, Q. He, B. Yang, Степени окисления DJ{{ 1}} определяют судьбу клеток в ответ на окислительный стресс, вызванный 4-hpr: аутофагия или апоптоз? Антиоксидантный окислительно-восстановительный знак. 21 (2014) 1443–1459.

[6] Y. Kaneko, H. Shojo, J. Burns, M. Staples, N. Tajiri, CV Borlongan, DJ -1 улучшает гибель ишемических клеток in vitro, возможно, через митохондриальный путь, Neurobiol, Dis. 62 (2014) 56–61.

[7] Д. Янагисава, Ю. Китамура, М. Индиан, К. Таката, Т. Танигути, С. Морикава, М. Морита, Т. Инубуси, И. Тояма, Т. Тайра и др., DJ{{ 1}} защищает от нейродегенерации, вызванной очаговой церебральной ишемией и реперфузией у крыс, J. Cereb. Кровоток. Встретились. 28 (2008) 563–578.

[8] Y. Kaneko, N. Tajiri, H. Shojo, CV Borlongan, Первичные нервные клетки крыс, лишенные кислорода и глюкозы, демонстрируют транслокацию DJ-1 в здоровые митохондрии: мощная терапевтическая мишень при инсульте, CNS Neurosci. тер. 20 (2014) 275–281.

[9] Н. Тадзири, К.В. Борлонган, Ю. Канеко, Лечение циклоспорином А предотвращает индуцированную ишемией гибель нейронов, сохраняя целостность митохондрий за счет активации белка DJ -1, ассоциированного с болезнью Паркинсона, CNS Neurosci. тер. 22 (2016) 602–610.

[10] RX Yang, J. Lei, BD Wang, DY Feng, L. Huang, YQ Li, T. Li, G. Zhu, C. Li, FF Lu и др. Предварительное лечение фенилбутиратом натрия облегчает церебральную ишемию. реперфузионное повреждение за счет активации белка DJ-1, Front. Нейрол. 8 (2017) 256.

[11] C. Gu, X. Yang, L. Huang, Cistanches Herba. Обзор нейрофармакологии, Front. Фармакол. 7 (2016) 289.

[12] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): один из лучших фармацевтических даров традиционной китайской медицины, Front. Фармакол. 7 (2016) 41.

[13] Q. Liu, J. Li, J. Wang, J. Li, JS Janicki, D. Fan, Эффекты и механизмы китайской травяной медицины в улучшении состояния ишемии-реперфузии миокарда, Evid.-Based Compl. Альт. (2013) (2013) 925625.

[14] HS Wong, KM Ko, Herba Cistanches стимулирует клеточный окислительно-восстановительный цикл глутатиона с помощью активных форм кислорода, образующихся в результате митохондриального дыхания в кардиомиоцитах H9c2, Pharm. биол. 51 (2013) 64–73.

[15] Т. Ван, С. Чжан, В. Се,ЦистанхеDeserticola YC Ma, "Пустынный женьшень": обзор, Am. Дж. Чин. Мед. 40 (2012) 1123–1141.

[16] Л. Гу, В. Т. Сюн, К. Ван, Х. Х. Сун, Г. Ф. Ли, С. Лю,Цистанхепустыняотвар уменьшает токсичность яичек, вызванную гидроксимочевиной у самцов мышей, Asian J. Androl. 15 (2013) 838–840.

[17] Э. Херцфельд, К. Штраус, С. Зиммермахер, К. Борк, Р. Хорсткорте, Ф. Дегани, К. Шеллер, Исследованиенейропротекторныйвлияние нимодипина на клетки Neuro2a с помощью хирургической модели стресса, Int. Дж. Мол. науч. 15 (2014) 18453–18465.

[18] Г. Вахабзаде, Н. Рахбар-Рошандел, С.А. Эбрахими, М. Махмудян,Нейропротекторныйвлияние носкапина на травму головного мозга, вызванную кислородно-глюкозной депривацией, Pharmacol. Отчет 67 (2015) 281–288.

[19] CP Wang, LZ Zhang, GC Li, YW Shi, JL Li, XC Zhang, ZW Wang, F. Ding, XM Liang, Mulberroside A защищает от ишемических нарушений в первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс после кислородно-глюкозной депривации. путем реперфузии, J. Neurosci. рез. 92 (2014) 944–954.

[20] X. Qi, R. Zhou, Y. Liu, J. Wang, WN Zhang, HR Tan, Y. Niu, T. Sun, YX Li, JQ Yu, Трансциннамальдегид защищает клетки PC12 от недостатка кислорода и глюкозы. /реперфузия (OGD/R)-индуцированное повреждение посредством антиапоптозного и антиоксидантного стресса, Mol. Клеточная биохимия. 421 (2016) 67–74.

[21] Р. Чанг, Р. Чжоу, С. Ци, Дж. Ван, Ф. Ву, В. Ян, В. Чжан, Т. Сунь, Ю. Ли, Дж. Ю, Защитное действие алоина на кислород и Повреждение клеток PC12, вызванное депривацией глюкозы, Brain Res. Бык. 121 (2016) 75–83.

[22] М. Агравал, В. Кумар, А.К. Сингх, М.П. Кашьяп, В.К. Ханна, М.А. Сиддики, А.Б. Пант, Транс-ресвератрол защищает ишемизированные клетки PC12, ингибируя факторы транскрипции, связанные с гипоксией, и повышая уровни ферментов антиоксидантной защиты, ACS хим. Неврологи. 4 (2013) 285–294.

[23] KW Zeng, LX Liao, MB Zhao, FJ Song, Q. Yu, Y. Jiang, PF Tu, Protosappanin B защищает клетки PC12 от гибели нейронов, вызванной депривацией кислорода и глюкозы, путем поддержания митохондриального гомеостаза посредством индукции убиквитин-зависимого Деградация белка р53, Eur. Дж. Фармакол. 751 (2015) 13–23.

[24] NT Ma, R. Zhou, RY Chang, YJ Hao, L. Ma, SJ Jin, J. Du, J. Zheng, CJ Zhao, Y. Niu и др., Защитное действие алоперина на неонатальных крысят. культивируемые нейроны гиппокампа, поврежденные кислородно-глюкозной депривацией и реперфузией, J. Nat. Мед. 69 (2015) 575–583.

[25] Y. Wang, W. Ma, A. Jia, Q. Guo, Парекоксиб защищает нейроны коры головного мозга мышей от нейротоксичности, вызванной OGD/R, посредством повышающей регуляции Bcl-2, Neurochem. рез. 40 (2015) 1294–1302.

[26] MP Ponnusamy, P. Seshacharyulu, A. Vaz, P. Dey, SK Batra, MUC4 стабилизирует экспрессию HER2 и поддерживает популяцию раковых стволовых клеток в клетках рака яичников, J. Ovarian Res. 4 (2011) 7.

[27] Р. Ван, Л. Пэн, Дж. Чжао, Л. Чжан, К. Го, В. Чжэн, Х. Чен, А. Гарденамид, Защищает клетки RGC-5 от H(2)O( 2) индуцированные окислительным стрессом повреждения путем активации сигнального пути PI3K/Akt/eNOS, Int. Дж. Мол. науч. 16 (2015) 22350–22367.

[28] LP Sun, X. Xu, HH Hwang, X. Wang, KY Su, YL Chen, Дихлорметановые экстракты прополиса защищают клетку от окислительного стресса, вызванного дефицитом кислорода и глюкозы Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 679путем снижения апоптоза, Food Nutr. рез. 60 (2016) 30081.

[29] Л. Ван, Ю. Чжан, Т. Асакава, В. Ли, С. Хан, К. Ли, Б. Сяо, Х. Намба, К. Лу, К. Донг,НейропротекторныйВлияние нейросерпина на астроциты крыс, подвергнутых депривации кислорода и глюкозы и реоксигенации, in vitro, PLoS One. 10 (2015) e0123932.

[30] Z. Zhiwen, W. Haitao, S. Fu, Z. Lihua, JL Peter, Q. Remi, Z. Wenhua, Ионы лития ослабляют апоптоз, вызванный депривацией сыворотки, в клетках PC12 посредством регуляции передачи сигналов Akt/FoxO1. пути, Психофармакология (Берл) 12 (2015) 625–633.

[31] EJB Дариуш Мозафффарян, С. Алан и др., Краткий обзор статистики сердечных заболеваний и инсультов за 2016 г., обновление. Отчет Американской кардиологической ассоциации, Circulation 133 (2016) 447–454.

[32] JE Jumblatt, TA, Регуляция сайтов связывания мускариновых лигандов с помощью фактора роста нервов в клетках феохромоцитомы PC12, Nature 297 (1982) 152–154.

[33] S. Afrazi, S. Esmaeili-Mahani, V. Sheibani, M. Abbasnejad, Нейростероидный аллопрегнанолон ослабляет высокий глюкозо-индуцированный апоптоз и предотвращает экспериментальную диабетическую невропатическую боль: исследования in vitro и in vivo, J. Steroid Biochem. Мол. биол. 139 (2014) 98–103.

[34] X. Liu, X. Zhu, M. Chen, Q. Ge, Y. Shen, S. Pan, Ресвератрол защищает клетки PC12 от OGD/R-индуцированного апоптоза посредством митохондриально-опосредованного сигнального пути, Acta Biochem Biophys Sin . 48 (2016) 342–353.

[35] PW Kleikers, K. Wingler, JJ Hermans, I. Diebold, S. Altenhofer, KA Radermacher, B. Janssen, A. Gorlach, HH Schmidt, NADPH-оксидазы как источник окислительного стресса и молекулярная мишень при ишемии/реперфузии травмы, J. Mol. Мед. (Берл) 90 (2012) 1391–1406.

[36] FC Liu, HI Tsai, HP Yu, Органопротекторные эффекты экстракта красного вина, ресвератрола при реперфузионном повреждении, опосредованном окислительным стрессом, Oxid. Мед. Сотовый Лонгев. (2015) 568634.

[37] LK Seidlmayer, VV Juettner, S. Kettlewell, EV Pavlov, LA Blatter, EN Dedkova, Различные механизмы активации mPTP при ишемии-реперфузии: вклады Ca2 plus , ROS, pH и неорганического полифосфата, Cardiovasc. рез. 106 (2015) 237–248.

[38] F. Su, AC Guo, WW Li, YL Zhao, ZY Qu, YJ Wang, Q. Wang, YL Zhu, Предварительное кондиционирование этанолом в низких дозах защищает от кислородно-глюкозной депривации / повреждения нейронов, вызванного реоксигенацией, путем активации большой проводимости , Ca2 plus plus - активированный K plus plus Channels In Vitro, Neurosci. Бык. 33 (2017) 28–40.

[39] Y. Li, M. Wang, S. Wang, Влияние ингибирования деления митохондрий на энергетический обмен в нейронах гиппокампа крысы во время ишемии/реперфузии, Neurol. рез. (2016) 1–8.

[40] C. Rui, L. Yuxiang, H. Yinju, Z. Qingluan, W. Yang, Z. Qipeng, W. Hao, M. Lin, L. Juan, Z. Chengjun и др., Защитные эффекты Полисахарид Lycium barbarum на первично культивируемых нейронах гиппокампа новорожденных крыс, поврежденных кислородно-глюкозной депривацией и реперфузией, J. Mol. гистол. 43 (2012) 535–542.

[41] BR Broughton, DC Reutens, CG Sobey, Механизмы апоптоза после церебральной ишемии, Stroke 40 (2009) e331–339.

[42] Джордан М. Уиллкокс, AJS Summerlee, Релаксин защищает астроциты от гипоксии in vitro, PLoS One. 9 (3) (2014) e90864.

[43] X. Zhang, D. Yuan, Q. Sun, L. Xu, E. Lee, AJ Lewis, BS Zuckerbraun, MR Rosengart, Кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа регулирует PINK1/Parkin и DJ{{3} } пути митофагии при сепсисе, FASEB J. 31 (2017) 4382–4395.

[44] S. Vasseur, S. Afzal, J. Tardivel-Lacombe, DS Park, JL Iovanna, TW Mak, DJ-1/ PARK7 является важным медиатором клеточных реакций, вызванных гипоксией, Proc. Натл. акад. науч. США 106 (2009) 1111–1116.

[45] Z. Xianghong, Y. Du, S. Qian, X. Li, L. Emma, ​​J. Anthony, Brian Lewis, S. Zuckerbraun, Matthew R. Rosengart, Кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа регулирует PINK1/ Паркин и DJ-1 пути митофагии при сепсисе, FASEB J. (2017). [

46] MS Choi, T. Nakamura, SJ Cho, X. Han, EA Holland, J. Qu, GA Petsko, JR Yates 3rd, RC Liddington, SA Lipton, Транснитрозилирование от DJ-1 до PTEN ослабляет гибель нейронов в моделях болезни Паркинсона, J. ​​Neurosci. 34 (2014) 15123–15131.

[47] Донгворт Р.К., Мукерджи У.А., Холл А.Р., Астин Р., Онг С.Б., Яо З., Дайсон А., Шабадкай Г., Дэвидсон С.М., Йеллон Д.М., Хаусенлой Д.Дж. -1 защищает от гибели клеток после острой сердечной ишемии-реперфузии, Cell Death Dis. 5 (2014) e1082.

[48] ​​А. Ди Виолончель, М. Ди Санзо, Ф. М. Перроне, Г. Сантамария, Э. Рания, Э. Анготти, Р. Вентурелла, С. Манкузо, Ф. Зулло, Г. Куда, Ф. Костанцо, DJ { {1}} является надежным сывороточным биомаркером для выявления рака эндометрия высокого риска, Tumor Biol. 39 (2017) 1010428317705746.

[49] H. Aleyasin, MW Rousseaux, PC Marcogliese, SJ Hewitt, I. Irrcher, AP Joselin, M. Parsanejad, RH Kim, P. Rizzo, SM Callaghan и др., DJ-1 защищает нигростриарную ось от нейротоксина MPTP путем модуляции пути AKT, Proc. Натл. акад. науч. США 107 (2010) 3186–3191.

[50] RM Canet-Aviles, MA Wilson, DW Miller, R. Ahmad, C. McLendon, S. Bandyopadhyay, MJ Baptista, D. Ringe, GA Petsko, MR Cookson, Белок болезни Паркинсона DJ-1 являетсянейропротекторныйиз-за митохондриальной локализации, управляемой цистеин-сульфиновой кислотой, Proc. Натл. акад. науч. США 101 (2004) 9103–9108.

[51] M. Liu, B. Zhou, ZY Xia, B. Zhao, SQ Lei, QJ Yang, R. Xue, Y. Leng, JJ Xu, Z. Xia, Ингибирование DJ -1, вызванное гипергликемией экспрессия поставила под угрозу эффективность кардиопротекции после ишемического посткондиционирования у крыс, Oxid. Мед. Сотовый Лонгев. (2013) (2013) 564902.