Uplc-q-orbitrap HRM в сочетании с молекулярной стыковкой для изучения материальной основы горького вкуса и ароматических отношений в Cistanchia desertica ⅱ
Dec 18, 2024
2 методы и результаты
2.1 Идентификация веществ Cistanch Deserticola
2.1.1 Условия обнаружения HRMS UPLC-Q-Orbitrap
Феноменекс Kinetex C18 столбца (2,1 мм × 1 0 0 мм, 2,6 мкм); Мобильная фаза A (водная фаза, содержащая 0,1% уксусной кислоты), B (изопропанол-ацетонитрил 1: 1), градиент элюирование (0-1 мин, 1% b; {13}} мин, 1% -99% b; 8-9 мин, 99% b; {18}. 1 мин. 99% -1% b; 9. 1-12 мин, 1% b); Скорость потока 0,2 мл · мин -1; температура столбца 30 градусов; Впрыскивание объема 2 мкл.
Условия масс -спектрометрии: масс -спектрометр Orbitrap Exploris 120 был использован для сбора первичных и вторичных данных масс -спектрометрии под управлением программного обеспечения (Thermo Scientific School Software, версия: 4.4). Напряжение распыления составляло 3,8 кВ (положительное) или -3. 4 кВ (отрицательный), температура источника ионов составляла 320 градусов, скорость потока газа в оболочке составляла 50 ARB, вспомогательный расход газа составлял 15 ARB, а температура переводящей трубки ионной передачи составляла 320 градусов. Режим сканирования был полным вторичным сканированием Scan/Data Scan Scan (полное MS/DD-MS2), первичным разрешением было 60 000, вторичное разрешение составляло 15 000, диапазон ионного сканирования составлял M/Z100 ~ 1 500, а градиент энергосбережения столкновения составлял 20, 30, 40 EV.
Высококачественные материалы из цистахэхинакозид, вербаскозид, тубулозид А, изовербодный гликозид
2.1.2 Подготовка контрольного решения
Точно весить соответствующие количестваэхинакозид, вербаскозид, тубулозид А, изовербодный гликозид, гентоанозид и генипозидные эталонные вещества, добавьте 50% метанол, чтобы сделать смешанный эталонный раствор с массовой концентрацией 500 нг · мл -1, хорошо встряхнуть и получить.
2.1.3 Приготовление испытательного раствора
Взвешивание 1. в течение 10 минут и фильтр для получения спиртового экстракта Cistanche Deserticola.
2.1.4 Идентификация веществ
Сравнивая данные первичной и вторичной информации о масс -спектрометрии каждого образца Cistanche Deserticola и в сочетании с соответствующими литературными и эталонными материалами, было определено, что различные образцы Cistanche Deserticola содержат 69 общих компонентов, см. В таблице 2, а общий ионный проточный диаграмма Cistanche Deserticola показан на рис. 2.
Таблица 2 Составляющие экстрактов Cistanche Deserticola, идентифицированные на основе HRMS UPLC-Q-Orbitrap
| Нет. | Сложный | Молекулярная формула | Измеренное значение (м/z) | Ошибка (× 10⁻⁶) | Ионный режим | Фрагментные ионы | Тип |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | Изоментон | C₁₀H₁₈O | 223.06 | -8.7 | [M + H]⁺ | 223.06, 207.02, 137.02 | Монотерпеноиды |
| 0.57 | Урацил | C₄H₄N₂O₂ | 157.04 | 1.8 | [M + H]⁺ | 157.03, 59.02, 49.01 | Другой |
| 0.67 | Глюкозамин | C₆h₁₃no₅ | 195.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 75.01, 195.05, 59.01 | Углеводы |
| 0.68 | Галактозамин | C₆h₁₃no₅ | 181.07 | 1.1 | [M + H]⁺ | 181.07, 71.01, 89.02 | Углеводы |
| 0.81 | Каприловая кислота | C₈H₁₆O₂ | 144.11 | 1.0 | [M + H]⁺ | 104.11, 103.08, 87.03 | Другой |
| 0.83 | L - аспартациновая кислота | C₄h₇no₄ | 132.03 | 0.7 | [M + H]⁺ | 132.03, 115.00, 71.01 | Аминокислоты |
| 0.97 | Этилацетат | C₄H₈O₂ | 198.19 | 1.4 | [M + H]⁺ | 197.02, 54.02, 153.02 | Другой |
| 0.98 | Яблочная кислота | C₄H₆O₅ | 155.00 | 0.0 | [M + H]⁺ | 111.00, 49.00, 68.99 | Органические кислоты |
| 0.99 | D - Галактоза | C₆H₁₂O₆ | 180.16 | 1.1 | [M + H]⁺ | 179.06, 89.02, 59.01 | Углеводы |
| 1.00 | L - глутаминовая кислота | C₅h₉no₄ | 188.09 | -0.4 | [M + H]⁺ | 118.09, 119.09, 72.08 | Аминокислоты |
| 1.01 | L - изолецин | C₆h₁₃no₂ | 132.10 | -0.9 | [M + H]⁺ | 132.10, 86.03, 115.07 | Аминокислоты |
| 1.05 | Глицин | C₂h₅no₂ | 182.08 | -0.9 | [M + H]⁺ | 182.08, 95.04, 29.03 | Аминокислоты |
| 1.48 | Уридин | C₉H₁₂N₂O₆ | 243.06 | 0.3 | [M + H]⁺ | 243.06, 103.01, 102.10 | Нуклеозиды |
| 1.93 | Метил D - йодид | C₂H₅I | 131.03 | 0.0 | [M + H]⁺ | 131.03, 59.00, 41.01 | Другой |
| 2.29 | Нарингин | C₂₇H₃₂O₁₄ | 345.12 | 3.2 | [M + H]⁺ | 345.12, 327.11, 147.05 | Флавоноиды |
| 3.29 | Протокатехно -кислота | C₇H₆O₄ | 153.02 | 1.1 | [M + H]⁺ | 153.02, 109.02, 41.00 | Фенольные кислоты |
| 3.46 | Триаконтонол | C₃₀H₆₂O | 445.10 | 2.7 | [M + H]⁺ | 445.10, 271.08, 101.00 | Алканолы |
| 3.47 | Kaempferol - 3 - o - глюкозид | C₂₁H₂₀O₁₁ | 373.11 | 2.3 | [M + H]⁺ | 123.01, 149.06, 167.07 | Флавоноиды |
| 3.48 | Кверцетин | C₁₅H₁₀O₇ | 109.03 | 0.6 | [M + H]⁺ | 109.03, 79.05, 77.03 | Флавоноиды |
| 3.66 | Хлорогеновая кислота | C₁₆H₁₈O₉ | 375.09 | -0.7 | [M + H]⁺ | 375.11, 359.07, 309.03 | Фенольные кислоты |
| 3.70 | Коричная кислота | C₉H₈O₂ | 347.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 347.13, 181.09, 113.07 | Фенольные кислоты |
| 3.74 | 8 - epigallocatechin - 3 - gallate | C₂₂H₁₈O₁₁ | 315.37 | 13.6 | [M + H]⁺ | 315.37, 136.05, 103.04 | Флавоноиды |
| 3.76 | Лимонен | C₁₀H₁₆ | 163.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 163.04, 93.07, 62.03 | Монотерпеноиды |
| 3.77 | Гесперидин | C₂₈H₃₄O₁₅ | 299.11 | -1.9 | [M + H]⁺ | 299.11, 181.08, 101.04 | Флавоноиды |
| 3.91 | Ванилин | C₈H₈O₃ | 307.81 | 3.8 | [M + H]⁺ | 307.83, 173.03, 149.02 | Фенольные кислоты |
| 4.11 | Изокерситрин | C₂₁H₂₀O₁₂ | 419.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 419.13, 149.02, 101.00 | Флавоноиды |
| 4.21 | Изопропилметилфенидат | C₁₄h₂₁no₂ | 221.08 | -0.8 | [M + H]⁺ | 221.08, 205.09, 104.00 | Другой |
| 4.22 | Сиринговая кислота | C₉H₁₀O₅ | 785.25 | 1.4 | [M + H]⁺ | 785.25, 663.21, 661.19 | Фенольные кислоты |
| 4.30 | Евгенол | C₁₀H₁₂O₂ | 179.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 179.04, 153.03, 113.03 | Фенольные кислоты |
| 4.40 | Кофеин | C₈H₁₀N₄O₂ | 769.26 | 1.4 | [M + H]⁺ | 769.26, 629.24, 622.14 | Алкалоиды |
| 4.43 | Хризин | C₁₅H₁₀O₄ | 442.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 442.05, 173.03, 113.03 | Флавоноиды |
2.2 Молекулярная стыковка скрининга горьких веществ в Cistanche Deserticola
2.2.1 Конструкция базы данных лигандов
Согласно химическим компонентам Cistanche Deserticola, идентифицированным в 2.1.4, их структуры SDF были загружены из базы данных PubChem для создания библиотеки малых молекул лиганд. Все малые молекулы лиганд были структурно оптимизированы с использованием минимизации программы молекулярной механики.
2.2.2 Выбор горьких рецепторов
Рецептор с горьким вкусом (TAS2R) является членом семейства GPCRS и опосредует процесс восприятия вкуса вкуса клеток вкуса на языке. Есть 25 рецепторных подтипов. Среди них TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 и TAS2R14 могут быть активированы различными горькими веществами и принадлежат к рецепторам горького восприятия широкого спектра [14-15]. Следовательно, это исследование выбрало белки TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 и TAS2R14 горького вкуса для стыковки с химическими компонентами Cistanche Deserticola, а структура кристаллов горького белка была получена из базы данных Alphafold.
2.2.3 Молекулярная стыковка
Химический компонент Cistanche deserticola, идентифицированного HRMS UPLC-Q-Orbitrap, использовали в качестве лиганда, а подтипы рецептора горького вкуса TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8 и TAS2R14 использовали в качестве белковых рецепторов. Молекулярная стыковка была выполнена с использованием программного обеспечения AutoDock Vina. Чем меньше счет стыковки, тем лучше энергия связывания. Рецепторный белок предварительно обработали с использованием инструментов Auto Dock (ADT), включая дегидратацию и гидрирование. Лиганд также обрабатывали с использованием ADT, включая гидрирование, расчет заряда, обнаружение и выбор вращающихся связей. Активный сайт рецептора определялся с использованием ADT, и стыковочная коробка была установлена для обеспечения того, чтобы размер коробки был достаточным для содержания активного сайта. После того, как стыковка была завершена, программное обеспечение для визуализации Pymol использовалось для просмотра и анализа результатов стыковки. Чтобы уменьшить ложные положительные результаты молекулярной стыковки, в этом исследовании использовался оценка стыковки горького положительного лиганда хинина в качестве критерия скрининга и выбранных химических компонентов, которые хорошо связываются как минимум с двумя горькими рецепторами как горькие вещества Cistanch Deserticola. В результате, в общей сложности 20 химических компонентов были потенциальными горькими веществами, включая 6 фенилетаноидных гликозидов, 5 флавоноидов, 3 фенольных кислот, 2 циклопентадиеновых эфирных терпенов, 2 алкалоида и 2 других компонента, что указывает на то, что фенилетаноидные гликозиды и флавоноиды являются основными ими -в -в -в -вузэрты. Оценки стыковки показаны в таблице 3.
Таблица 3 Молекулярные оценки стыковки горьких представленных веществ экстрактов Cistanche Deserticola с горькими вкусовыми рецепторами kcal · mol -1
| Нет. | Горькое вещество | TAS2R1 | TAS2R7 | TAS2R8 | TAS2R14 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Прунасин | -7.6 | -6.6 | -7.8 | -7.1 |
| 2 | Трифолирхизин | -8.8 | -7 | -8.7 | -8.5 |
| 3 | Бензойная кислота | -7.9 | -6.9 | -8.2 | -7.1 |
| 4 | Vitexin | -7.6 | -6.8 | -8.5 | -7.1 |
| 5 | Трифолин | -8.4 | -7.5 | -8.2 | -7.7 |
| 6 | Изокерситрин | -9.2 | -7.5 | -8.1 | -7.8 |
| 7 | Изоментон | -7.3 | -6.7 | -7.4 | -6.9 |
| 8 | Куркумин | -9.2 | -8.1 | -8.3 | -7.4 |
| 9 | Дегидроакусовая кислота | -6.6 | -6 | -7.8 | -7.9 |
| 10 | Гинзозид | -7.3 | -7.9 | -8.8 | -8.3 |
| 11 | Пиперин | -8.8 | -7.9 | -7.9 | -7.9 |
| 12 | Эпикатехин | -9.8 | -6.9 | -9.1 | -8.7 |
| 13 | Изокеритрин (снова) | -8.1 | -8 | -8.2 | -8 |
| 14 | Рейн | -8.7 | -7 | -8.9 | -8.5 |
| 15 | Изосалициловая кислота | -8.7 | -6.5 | -8.3 | -9.3 |
| 16 | Пиноцембрин | -9.1 | -7.6 | -8.1 | -8.6 |
| 17 | Эриоцитрин | -7.9 | -7.6 | -8.2 | -8.4 |
| 18 | Genistin | -8.1 | -8.2 | -9.1 | -8.2 |
| 19 | Кампферол | -8.4 | -8.1 | -9.1 | -8.4 |
| 20 | Изокеритрин (третье упоминание) | -8.2 | -8.4 | -7.9 | -8.7 |
2.3 Электронная оценка языка горечи Cistanche Deserticola
2.3.1 Приобретение сигнала
Обратитесь к методу литературы и оптимизируйте его [16]. Параметры: температура сбора 25 градусов, время сбора данных 120 с, период сбора 1 с, скорость перемешивания 1 r · s -1, используя ультрапирную воду в качестве чистящей жидкости, перед каждым измерением образца очищают датчик в течение 10 секунд.
2.3.2 Определение образца
Взвешивание 1. Поместите подготовленный образец в стандартный стакан прибора на 100 мл и выполните измерение. Повторите измерение три раза для каждого образца.
2.3.3 Результаты оценки горечи с использованием электронного языка
После методологического осмотра относительное стандартное отклонение (RSD) экспериментов с точностью, повторяемостью и {{0}} h стабильности составило 1,7%, 3,6%и 1,4%соответственно, все менее 5,0%, что указывает на то, что этот метод осуществим. Количественные значения горечи различных образцов Cistanche Deserticola варьировались от 8,856 до 27,32, как показано в таблице 4, со значительными различиями.
3 Обсуждение
В этом исследовании 69 химических компонентов были идентифицированы в Cistanche Deserticola с использованием технологии HRMS UPLC-Q-Orbitrap, и 20 горьких веществ, которые стимулируют рецепторы горького вкуса в цистано-десертиколе, были проверены путем комбинирования молекулярных технологий док. Компоненты, включая эхинакозид, вербаскозид, тубулозид А, изовербоскозид, генипозид и т. Д.; 9 партий свежих образцов Cistanche Deserticola из одного и того же происхождения в разные месяцы были собраны и разделены на разные месяцы и разные части. Электронный метод языка использовался для определения количественного значения горечи образцов, и ВЭЖХ использовали для определения 6 потенциальных горьких фармакологических компонентов (эхинакозид, вербаскозид, тубулозид) в образцах. Содержание A, изо-ребаскозид, джиншиканозид, генипозид) и ультрафиолетовая спектрофотометрия использовали для определения общих фенилетаноидных гликозидов, общих полисахаридов, общих алкалоидов, общих флавоноидов и общего содержания фенольной кислоты в образцах. Исходя из этого, в сочетании с хемометрическим анализом, анализ корреляции Пирсона, анализ серых корреляций, OPLS-DA и т. Д. Были использованы для поиска горьких компонентов в Cistanche Deserticola. Результаты корреляционного анализа показали, что содержание общих фенилетаноидных гликозидов и общих флавоноидов в цисташ -десертиколе было положительно коррелировано со значением горького отклика, и общие полисахариды цистах -десертиколы отрицательно коррелировали со значением горького отклика. Среди них содержание фенилетаноидных гликозидных компонентов эхинакозида, вербаскозида и джиншиканозида значительно положительно коррелировали с значением горького отклика, что согласуется с результатами молекулярной стыковки, подтверждая точность результатов молекулярного док. Два метода поддерживали друг друга и предоставили ссылку на последующую дебютирующую и коррекцию аромата Cistanche Deserticola.
Через прогноз сетевой фармакологии было получено 245 мишеней на горьких веществах, и ключевыми мишенями были EGFR, PIK3CB, PTK2, PIK3CD, PIK3R1, PTPN11, IK3CA, SRC, JAK2, PDGFRB и т. Д.; Результаты обогащения функции функции KEGG и функции GO в мишенях горького вещества показали, что резистентность к инсулину, роль сигнального пути PI3K-AKT в диабетических осложнениях и сигнальный путь AGR-RAGE в диабетических осложнениях были ключевыми путями горьких веществ-мишеней Cistanche Deserticola. Всего было получено 267 функций GO для целей горького вещества. Включая 123 биологических процесса, 75 молекулярных функций и 69 клеточных компонентов; by performing Wayne analysis on the bitter substance targets and the disease targets of the bitter effect of Cistanche deserticola, the results showed that 54.69%, 65.30%, 48.16%, 40.40%, 20.40% and 19.59% of the bitter substance targets may have bitter effects of anti-diabetic nephropathy, neuroprotection, immunomodulation, anti-oxidation, anti-aging and антиостеопороз. Это показывает, что горькие вещества в Cistanche Deserticola имеют определенную материальную основу для горьких эффектов.
В этом исследовании в качестве объекта исследования использовался экстракт Cistanche Deserticola, а горькие вещества в Cistanche Deserticola были проверены RMS UPLC-Q-Orbitrap и молекулярной стыковкой; ВЭЖХ использовали для определения содержания основных горьких лекарственных компонентов, и для определения содержания каждой основной категории горьких веществ использовалась спектрофотометрия. Электронный язык использовался для оценки степени горечи, а горькие компоненты были проверены хемометрией. Современные методы технических исследований были полностью использованы для изучения вкусовой информации Cistanche Deserticola и выявления ее горькой материальной основы, которая обеспечит ссылку на последующую дебютирующую и коррекцию вкуса Cistanche Deserticola. Благодаря изучению сетевой фармакологии был предварительно исследован механизм действия горьких веществ в Cistanche Deserticola и его связь с целью горькой эффективности, что предоставит идеи и ссылки для будущего изучения «вкусового» взаимосвязи пяти вкусов китайской медицины. Тем не менее, есть все еще некоторые недостатки: этот эксперимент выбран только растения с хорошим качеством в традиционном сезоне сбора урожая, чтобы измерить содержание горького вещества и горечь разных частей. Существует определенная степень недостаточного размера выборки, и результаты различий в горечи разных частей не имеют определенной надежности. Планируется использовать крупномасштабные образцы для проверки и проведения более систематических исследований в будущем; Обычно считается, что алкалоидные компоненты являются горькими, но корреляционный анализ этого эксперимента показал, что алкалоиды и горечь отрицательно коррелируют, что может быть связано с тем, что алкалоидный компонент в цистанче в основном является бетаинской, а молекулярная доктораринг показывает, что он связывается плохо с горькими рецепторами. Кроме того, горькие результаты, подвергнутые молекулярной стыковке, не имеют конкретной количественной оценки в определенной горечи.
