Экстракт Cistanche Deserticola увеличивает костеобразование в остеобластах--Часть I

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Те-Мао Ли^aи др.

Абстрактный
Цели. Мы исследовали влияниеЦистанхепустыняМа. (CD) накостьформированиекультивируемыми остеобластами. Методы Анализ образования минерализованных узелков был использован для изучения эффектов CD in vitro.(Цистанхепустынная)накостьформирование. Экспрессию мРНК щелочной фосфатазы (ALP), костных морфогенетических белков (BMP)-2 и остеопонтина (OPN) анализировали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Механизм действия ЦД(Цистанхепустынная)Экстракт исследовали методом вестерн-блоттинга. Антиостеопоротический эффект CD in vivo(Цистанхепустынная)Экстракт оценивали на мышах после овариэктомии.
Ключевые результаты

CD(Цистанхепустынная)Экстракт не влиял на пролиферацию, миграцию или заживление ран культивируемых остеобластов, но увеличивал мРНК ALP, BMP-2 и OPN и минерализацию кости. Ингибиторы митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) или ядерного фактора (NF)-kB снижают CD(Цистанхепустынная)экстракт-индуцированныйкостеобразованиеи выражение ALP, BMP-2 и OPN. Тем не менее, компакт-диск(Цистанхепустынная)Экстракт не влияет на остеокластогенез. Кроме того, компакт-диск(Цистанхепустынная)Экстракт предотвращал потерю костной массы, вызванную овариэктомией in vivo.
Выводы

CD(Цистанхепустынная)может быть романкостеобразованиесредство для лечения остеопороза.

Ключевые словакостеобразование; Цистанхепустыня; китайская трава; остеобласты

Цистанхе пустыннаяхорошо длякостеобразование

Введение

Кость представляет собой сложную ткань, состоящую из нескольких типов клеток, которые подвергаются непрерывному процессу обновления и восстановления, называемому «ремоделирование кости». Два основных типа клеток, ответственных за ремоделирование кости, — это остеокласты, которые резорбируют кость, и остеобласты, которые формируют новую кость. Ремоделирование костей регулируется несколькими системными гормонами (например, паратиреоидным гормоном, 1, 25-дигидроксивитамином D3, половыми гормонами и кальцитонином) и местными факторами (например, оксидом азота, простагландинами, факторами роста и цитокинами).[1] Остеопороз возникает, когда резорбция и формирование кости не скоординированы, а избыточное разрушение кости превышает ее наращивание.[2] Текущие методы лечения остеопороза включают бисфосфонаты, кальцитонин и эстроген, которые являются ингибиторами резорбции костей, поддерживающими костную массу за счет ингибирования активности остеокластов.[3] Однако влияние этих препаратов на увеличение или восстановление костной массы относительно невелико, определенно не более чем на 2 процента в год.[3] Следовательно, существует потребность в препаратах для наращивания костной ткани, таких как терипаратид, которые стимулируют рост новых костей.костьформированиеи скорректировать изменение трабекулярной микроархитектоники, характерное для развившегося остеопороза [4,5].костьформированиев первую очередь является функцией остеобластов, агенты, которые действуют либо за счет увеличения пролиферации клеток остеобластной линии, либо за счет индукции дифференцировки остеобластов, могут усиливать образование кости. [5,6]
Хотя механизмы остеопороза остаются неясными, они, вероятно, связаны со сниженной доступностью или действием факторов роста костей, таких как костные морфогенетические белки (BMP) [7]. BMP, которые структурно родственны суперсемейству трансформирующего фактора роста-b, первоначально были идентифицированы по их способности индуцировать эктопию.кость формированиеу грызунов.[8] BMP играют важную роль вкостьформированиеи дифференцировка костных клеток путем стимуляции активности щелочной фосфатазы (ЩФ), а также синтеза протеогликана, коллагена и остеопонтина (ОПН) [9]. Недавнее исследование обнаружило связь между остеопорозом и специфическими полиморфизмами в генах BMP-2, ALP и OPN, предполагая, что они связаны с развитием остеопороза.[10]

ЦистанхепустыняМа. ( Orobanchaceae ; сокращенно CD)(Цистанхепустынная)является местной травой в Китае и широко используется в традиционной медицине в качестве терапевтического средства благодаря своим седативным, обезболивающим и иммуностимулирующим свойствам. Современные фармакологические исследования показали, что CD(Цистанхепустынная)экстракты могут стимулировать иммунитет, [12], очищать от свободных радикалов [13] и повышать активность супероксиддисмутазы. [14] Противовоспалительные и антиоксидантные средства обладают потенциалом для лечения остеопороза за счет увеличениякость формированиеи/или подавление резорбции кости.[15,16] Однако эффект CD(Цистанхепустынная)на функцию костных клеток еще не определено. Здесь мы сообщаем, что компакт-диск(Цистанхепустынная)Экстракт не влиял на пролиферацию, миграцию или активность заживления ран культивируемых остеобластов, но увеличивал экспрессию ALP, BMP-2 и OPN и минерализацию кости. Кроме того, мы показываем, что митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) и сигнальные пути ядерного фактора (NF)-kB могут быть вовлечены в CD-опосредованное увеличение экспрессии генов и минерализацию костей. Напротив, компакт-диск(Цистанхепустынная)экстракт не подавлял остеокластогенез in vitro. Примечательно, что лечение мышей с БК(Цистанхепустынная)Экстракт предотвращал потерю костной массы, вызванную овариэктомией in vivo. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что CD(Цистанхепустынная)можно использовать для стимуляциикостьформированиедля лечения остеопороза.

Цистанхе пустыннаяповысить иммунитет

Материалы и методы

Экстракт и материалы цистанхе пустынной

CD(Цистанхепустынная)экстракт был приобретен у Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Гаосюн, Тайвань). Извлечение и изоляция компакт-диска(Цистанхепустынная)следовали, как описано ранее (на основе спектральных данных они определили химический состав, включающий бета-ситостерол, даукостерол, янтарную кислоту, триаконтанол, актеозид, бетаин и полисахарид) [17]. Поликлональные антитела кролика, специфичные к p-внеклеточным регулируемым сигналом киназам (ERK), ERK, p-p38, p38, N-концевым киназам pc-Jun (JNK), JNK, p-p65 и p65, были приобретены у Santa Cruz Biotechnology ( Санта-Круз, США). Набор ELISA для остеокальцина был приобретен у Biosource Technology (Nivelles, Бельгия). С-концевые телопептиды набора ELISA для коллагена I типа были получены от Cross Laps (Herlev, Дания). Доминантно-негативный мутант р38 был предоставлен доктором Дж. Ханом (Юго-Западный медицинский центр, Даллас, США). Доминантно-негативный мутант JNK был предоставлен доктором М. Карин (Калифорнийский университет, Сан-Диего, США). Доминантно-негативный мутант ERK2 был предоставлен доктором М. Коббом (Юго-Западный медицинский центр). Все остальные реагенты были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США).

Культура клеток

Клеточная линия мышиных остеобластов MC3T3-E1 была приобретена в Американской коллекции типовых культур (ATCC; Роквилл, США). Клетки культивировали в среде 95 % воздуха, 5 % CO2 с a-MEM, к которой добавляли 20 мМ HEPES и 10 % термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мг). /мл).

Измерение образования минерализованных конкреций

Образование минерализованных конкреций оценивали, как описано [18]. Вкратце, остеобласты культивировали в среде, содержащей витамин С (50 мг/мл) и b-глицерофосфат (10 мМ) в течение двух недель, и среду меняли каждые три дня. После инкубации с CD(Цистанхепустынная)экстракта в течение 12 сут, клетки дважды промывали 20 мМ трис-буферным раствором, содержащим 0,15 м NaCl (pH 7,4), фиксировали в ледяном 75-процентном (об./об.) этаноле в течение 30 мин и воздух- высушенный. Отложение кальция определяли с помощью окрашивания ализариновым красным-S. Вкратце, фиксированные этанолом клетки и матрикс окрашивали в течение 1 ч 40 мМ ализариновым красным-S (pH 4,2) и тщательно промывали водой. Связанный краситель элюировали 10-процентным (мас./об.) хлоридом цетилпиридиния и количественно определяли ализарин красный-S в образцах путем измерения поглощения при 550 нм и сравнения со стандартной кривой. Один моль ализаринового красного-S селективно связывает примерно два моля кальция.

Цистанхе пустыннаяхорошо длякостеобразование

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали из остеобластов с использованием набора TRIzol (MDBio Inc., Тайбэй, Тайвань). Обратная транскрипция выполнялась с использованием 2 мг тотальной РНК и олиго(dT) праймера. США). Добавляли тотальную кДНК (100 нг на 25- мл реакции) со специфическими для последовательности праймерами и зондами Taqman®. Все праймеры и зонды для целевых генов были приобретены на коммерческой основе, включая b-актин в качестве внутреннего контроля (Applied Biosystems). Анализы количественной ПЦР проводили в трех повторностях на системе обнаружения последовательности StepOnePlus (Applied Biosystems). Условия циклирования: 10-минутная активация полимеразы при 95 градусах, затем 40 циклов при 95 градусах в течение 15 секунд и при 60 градусах в течение 60 секунд. Порог был установлен выше фонового контроля без матрицы и в пределах линейной фазы амплификации гена-мишени для расчета номера цикла, при котором транскрипт был обнаружен (обозначается СТ).

Вестерн-блот анализ

Клеточные лизаты готовили, как описано ранее [21, 22]. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на поливинилдифторидные мембраны Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Блоты блокировали 4-процентным бычьим сывороточным альбумином в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем зондировали кроличьими античеловеческими антителами против р-65 или р-р65 (1:1000) в течение 1 ч при комнатной температуре. После трех промывок блоты инкубировали с конъюгированными с пероксидазой вторичными антикроличьими антителами (1:1000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Блоты визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции с использованием пленки X-OMAT LS (Eastman Kodak, Рочестер, США).

Овариэктомический остеопороз

Для этого исследования использовали самок мышей ICR в возрасте четырех недель, весом 22~28 г. Мышей подвергали билатеральной овариэктомии под анестезией трихлорацетальдегидом (100 мг/кг), а контрольным мышам ложно оперировали (Sham) для сравнения. Минеральная плотность костей и содержание минералов в костях измерялись после перорального введения CD в различных концентрациях.(Цистанхепустынная)экстракт каждые два дня в течение четырех недель. Общая минеральная плотность костей тела и содержание минералов в костях определялись с помощью двухэнергетического рентгеновского абсорбциометра (DEXA; XR -26; Норланд, Форт-Аткинсон, США) с использованием режима для маленьких субъектов, как описано ранее [18, 23] Все протоколы соответствовали установленным правилам и были одобрены Комитетом по уходу за животными Китайского медицинского университета.

статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, США). Приведенные значения являются средним значением SEM. Статистический анализ двух выборок проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Статистические сравнения более чем двух групп были выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Бонферрони. Во всех случаях значение P < 0,05="" считалось="">

Цистанхе пустыннаяхорошо длякостеобразование

Полученные результаты

Цистанхе пустыняэкстракт увеличивает минерализацию костей остеобластами Добавление CD(Цистанхепустынная)экстракт в течение 24 или 48 ч не влиял на пролиферацию клеток мышиных остеобластов MC3T3-E1 в анализе МТТ (данные не показаны). Поскольку дифференцировка остеобластов представляет собой сложный процесс, включающий пролиферацию и миграцию клеток, мы также проверили миграционную способность клеток MC3T3-E1 после обработки CD.(Цистанхепустынная)извлекать. Используя Transwell и тесты на заживление ран, мы обнаружили, что CD(Цистанхепустынная)экстракт не влиял на миграцию остеобластов (данные не показаны). Образование минерализованных узелков является одним из маркеров созревания остеобластов. Окрашивание ализариновым красным S показало, что минерализованные узелки образовывались при культивировании остеобластов в течение двух недель в среде, содержащей витамин С (50 мкг/мл) и -глицерофосфат (10 мМ), в зависимости от концентрации путем добавления ЦД.(Цистанхепустынная)(Рисунок 1а). Таким образом, компакт-диск(Цистанхепустынная)экстракт индуцировал образование костных узелков культивируемыми остеобластами, но не их пролиферацию или миграцию. Мы также рассмотрели роль CD(Цистанхепустынная)экстракт в RANKL-индуцированном остеокластогенезе, но не обнаружил эффекта (данные не показаны).

Экстракт цистанхе пустынной увеличивает экспрессию щелочной фосфатазы, костного морфогенетического белка-2 и остеопонтина в культивируемых остеобластах.

Дифференцированные остеобласты проявляют повышенную активность ЩФ, что коррелирует с высоким уровнем экспрессии фермента.[18] Мы обнаружили, что лечение CD(Цистанхепустынная)экстракт в течение 72 ч значительно повышал активность ЩФ остеобластов (рис. 1б). Учитывая решающую роль BMP-2, ALP и OPN в дифференцировке остеобластов, мы проверили, является ли CD(Цистанхепустынная)Экстракт оказывает влияние на дифференцировку остеобластов, регулируя экспрессию BMP-2, ALP и OPN. Обработка клеток CD(Цистанхепустынная)экстракты увеличивали экспрессию мРНК ALP, BMP-2 и OPN в зависимости от концентрации (рис. 1c), демонстрируя, что CD(Цистанхепустынная)экстракт индуцировал дифференцировку остеобластов путем усиления экспрессии ALP, BMP-2 и OPN.

Экстракт цистанхе пустынной увеличивает образование костных узелков за счет митоген-активируемой протеинкиназы.

Сообщалось, что МАПК играет важную роль вкостьформирование[24,25], поэтому далее мы исследовали, участвует ли этот сигнальный путь в CD.(Цистанхепустынная)минерализация костей, вызванная экстрактом. Предварительная обработка клеток ингибитором ERK U0126, ингибитором p38 SB203580 или ингибитором JNK SP600125 снижала CD(Цистанхепустынная)экстракт увеличивает минерализацию костей (рис. 2а, 3а и 4а). Кроме того, ингибиторы также блокировали CD(Цистанхепустынная)индуцированная экстрактом экспрессия ALP, BMP-2 и OPN (рис. 2b–4c). Трансфекция клеток ERK2, p38 или мутантным JNK уменьшает CD(Цистанхепустынная)экстракт-увеличение экспрессии мРНК ALP, BMP-2 и OPN (рис. 2c, 3c и 4c). Затем мы непосредственно исследовали активацию ERK, p38 и JNK после CD.(Цистанхепустынная)лечение экстрактом. Инкубация клеток с CD(Цистанхепустынная)экстракт индуцировал фосфорилирование ERK, p38 и JNK (рис. 2d, 3d и 4d). Следовательно, ERK, p38 и JNK опосредуют увеличениекостьформированиеиндуцированный компакт-диском(Цистанхепустынная)лечение остеобластов.

Экстракт цистанхе пустынной увеличивает образование костных узелков за счет ядерного фактора-kB.

Как упоминалось ранее, активация NF-kB необходима длякостьформирование.[26,27] Затем мы обработали остеобласты ингибиторами NF-kB пирролидиндитиокарбаматом (PDTC) и N-тозил-L-фенилаланин хлорметилкетоном (TPCK), которые были приобретены у Calbiochem (Дармштадт, Германия), чтобы определить, является ли активация NF-kB участвует в компакт-диске(Цистанхепустынная)минерализация костей, вызванная экстрактом. На фигуре 5а показано, что предварительная обработка остеобластов PDTC или TPCK ингибировала CD.(Цистанхепустынная)индуцированное экстрактом образование костных узелков, а также снижало увеличение экспрессии ALP, BMP-2 и OPN (рис. 5b и 5c). Фосфорилирование субъединицы p65 NF-kB является индикатором активации NF-kB; [28] в соответствии с этим мы обнаружили, что CD(Цистанхепустынная)экстракт увеличил фосфорилирование p65 в остеобластах (рис. 5d). Эти результаты показали, что активация NF-kB важна для индуцированной экстрактом CD экспрессии ALP, BMP-2 и OPN и образования костных узелков.

Рисунок 4 Участие N-концевых киназ c-Jun (JNK) вЦистанхепустыня(CD) индуцированная экстрактом минерализация кости в остеобластах. (а) Клетки высевали в 24-луночные планшеты и культивировали в среде, содержащей витамин С (50 мг/мл) и b-глицерофосфат (10 мМ) в течение двух недель. Клетки одновременно обрабатывали ЦД.(Цистанхепустынная)экстракт (26 мг/мл) плюс SP600125 (3 мМ). Образование минерализованных узелков оценивали окрашиванием ализариновым красным-S (n=5). (b, c) Клетки предварительно обрабатывали SP600125 в течение 30 мин или трансфицировали мутантом JNK или 24 ч с последующей стимуляцией экстрактом CD, активностью щелочной фосфатазы (ALP) и ALP, костным морфогенетическим белком (BMP)-2 и Экспрессию мРНК остеопонтина (OPN) измеряли с помощью набора ALP и количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. ( d ) Клетки обрабатывали экстрактом CD в течение указанных интервалов времени, и экспрессию p-JNK исследовали с помощью Вестерн-блоттинга. *П< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Цистанхепустынная)группа, обработанная экстрактом.

Ингибирование потери костной массы экстрактом Cistanche Deserticola у мышей после овариэктомии

Чтобы изучить эффект CD(Цистанхепустынная)экстракта на потерю костной массы, остеопороз индуцировали у самок мышей с помощью овариэктомии. Как и ожидалось, у мышей с овариэктомией наблюдалось снижение общей минеральной плотности костей тела и содержания минералов в костях (рис. 6а и 6б). Лечение с помощью CD(Цистанхепустынная)экстракт в течение четырех недель ингибировал потерю минеральной плотности костей и содержания минералов в костях дозозависимым образом (рис. 6а и 6б). Концентрация ЩФ в крови может отражать активность остеобластов.[29] Как показано на рисунке 6c, CD(Цистанхепустынная)Экстракт ингибировал снижение активности ALP в сыворотке, вызванное овариэктомией. Кроме того, компакт-диск(Цистанхепустынная)экстракт также повышал уровень остеокальцина, маркеракостьформированиеи снижал уровень С-концевых телопептидов коллагена I типа, маркера резорбции кости (рис. 6d и 6e). Таким образом, эти данные подтверждают эффективность и действенность CD.(Цистанхепустынная)экстракт в предотвращении потери костной массы in vivo.

Рисунок 6. Ингибирование вызванного овариэктомией снижения минеральной плотности костей и содержания минералов в костях с помощьюЦистанхепустыня(CD) экстракт. Самкам мышей ICR проводили ложную операцию или удаляли яичники. Мышам после овариэктомии вводили ЦД в указанных концентрациях.(Цистанхепустынная)экстракт при пероральном введении. Общая минеральная плотность костей тела (а), содержание минералов в костях (б), активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке (в), остеокальцин в сыворотке (г) и С-концевые телопептиды коллагена I типа в сыворотке (е) определяли четыре раза. недели после операции. Данные представлены в виде средней SE, n=8–10 мышей/группу. *P < 0,05="" по="" сравнению="" с="" симуляцией;="" #p=""><0,05 по="" сравнению="" с="" группой="" с="">

ОБСУЖДЕНИЕ

Нажмите здесь для получения информации о части II (обсуждение и заключение) этой статьи.

Из: 'Цистанхепустыняэкстракт увеличиваетсякостьформированиев остеобластахТе-Мао Ли^aи другие

---© 2012 Авторы. JPP © 2012 Королевское фармацевтическое общество, 2012 г.Журнал фармации и фармакологии, 64, стр. 897–907.