Эфирные масла, содержащие цитраль, как потенциальные ингибиторы тирозиназы: биоуправляемый подход к фракционированию

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Абстрактный:

Чрезмерное производство меланина вызывает серьезные дерматологические заболевания, а также незначительные эстетические проблемы (например, веснушки и солнечное лентиго). Понижение уровня тирозиназы является широко распространенным подходом к лечению таких заболеваний, а растительные экстракты часто оказываются ценными источниками энергии.тирозиназаингибиторы. Цитраль (смесь нераля и гераниала) является важным ароматизирующим ингредиентом, обладающим антитирозиназным потенциалом. Он высококонцентрирован в эфирных маслах (ЭМ) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. и Verbenaofficinalis L. Однако только эфирное масло L. cubeba было исследовано на предмет использование в качестве потенциального средства для отбеливания кожи. В этой работе оценивается in vitroтирозиназаингибирующую активность этих ЭО и исследования с использованием фракционирования, ориентированного на биоанализ, на предмет того, влияют ли их различные химические составы на общую ингибирующую активность ЭО посредством возможных синергетических, аддитивных и/или конкурентных взаимодействий между компонентами ЭО. Ингибирующая активность ЭО C. schoenanthus и ЭО M. officinalis с незначительными количествами (плюс)-цитронеллаля соответствовала содержанию в них цитраля. С другой стороны, ЭМ L. cubeba и V. officinalis ингибировалитирозиназав значительно большей степени, поскольку они содержали -мирцен, который способствовал общей активности ЭО. Аналогичные наблюдения были сделаны для ЭО M. officinalis, который имеет высокое содержание (плюс)-цитронеллаля, что увеличивает активность цитраля.

Ключевые слова:тирозиназаингибирование; эфирные масла; цитраль

цистанхе обладает отбеливающей функцией

Введение

Тирозиназаявляется ключевым ферментом в биосинтезе пигментов меланина у некоторых бактерий, грибов, растений, животных и человека. У людей тирозиназа катализирует этапы, ограничивающие скорость биосинтеза меланина. Этот биосинтез характеризуется несколькими ферментативными и химическими реакциями, которые приводят к образованию меланина из аминокислоты L-тирозина, при этом тирозиназа катализирует его гидроксилирование в о-допахинон посредством активности микофенолята и дифенолов. Хотя в меланогенезе участвуют и другие ферменты, только реакции, катализируемые тирозиназой, не могут протекать спонтанно, в то время как остальные стадии могут протекать без ферментативной активности при физиологических значениях pH [1]. производство и использование ингибиторов тирозиназы в качестве агентов для отбеливания кожи продемонстрировали значительную клиническую и косметическую известность [2].

На рынке ЕС,тирозиназаИнгибиторы, которые используются в качестве средств для отбеливания кожи, можно разделить на две основные категории: те, которые запрещены косметическим регламентом ЕС 1223/2009 (т. е. гидрохинон и монобензиловый эфир гидрохинона) из-за их серьезных побочных эффектов, но которые все еще используются для лечения гиперпигментации в медицинских учреждениях. контроль; и ингибиторы тирозиназы, разрешенные для использования в косметических продуктах (например, арбутин, алоэзин, койевая кислота) [2,3]. Эта вторая группа, однако, по-прежнему характеризуется потенциально значительными побочными эффектами; Клинические исследования койевой кислоты действительно выявили случаи эритемы, жжения и контактной экземы после применения. Точно так же Европейский научный комитет по безопасности потребителей выразил обеспокоенность по поводу использования арбутина в качестве косметического ингредиента [2] из-за возможного гидролиза его гликозидной связи, который высвобождает гидрохинон. Следовательно, существует потребность в новых молекулярных матрицах и/или смесях биоактивных соединений для лечения гиперпигментации.

Растения являются ценными источниками средств для отбеливания кожи, и три из пяти наиболее часто используемых средств, как в медицине, так и в косметике, представляют собой специализированные растительные метаболиты (например, гидрохинон, -арбутин, алоэзин). На сегодняшний день фенольные соединения в основном исследованы как потенциальныетирозиназаингибиторы, и к ним относятся флавоноиды (например, кверцетин [4]), стильбены (например, ресвератрол [1]), фенилпропаноиды (например, коричный альдегид [5] и эвгенол [6]) и фенольные кислоты (например, анисовая кислота и бензойная кислота [7]). Интерес к фортерпеноидам был значительно ниже, и они сравнительно недостаточно исследованы в качестве средств против тирозиназы.

Цитраль относится к ограниченному числу изученных производных терпеноидов с антитирозиназными свойствами. Это смесь двух изомеров, цис- и транс-3,7-диметил-2,6-октадиеналя (т. е. нераля и гераниала), которые, как было доказано, блокируют ферментативная активность грибов in vitroтирозиназа[8]. В дополнение к своему важному значению в качестве пахучего ингредиента в напитках, пищевых продуктах и ​​косметике, цитраль продемонстрировал многообещающую биологическую активность in vitro, включая противогрибковые, антибактериальные, антиоксидантные и противовоспалительные эффекты [9-11]. Более того, недавние исследования показали подчеркнули, что цитраль имеет потенциальное терапевтическое значение как релаксант гладких мышц и местный анестетик, поскольку он способствует расслаблению гладких мышц трахеи, матки и аорты и подавляет возбудимость нервов на животных моделях [12-15].

Цитраль получают из эфирных масел (ЭМ) нескольких ботанических видов, в том числе Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. и Verbena officinalis L. Авторы известно, только L. cubeba EO был исследован на предмет еготирозиназаингибирующая активность [16]. Таким образом, это исследование направлено на оценку тирозиназоингибирующей активности эфирных масел C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis и V. officinalis с использованием колориметрического анализа in vitro, чтобы оценить, влияют ли различные химические составы на общую ингибирующую активность эфирного масла посредством любого возможные синергетические, аддитивные и/или конкурентные взаимодействия между их компонентами. В этом исследовании используется метод фракционирования на основе абиоанализа для всесторонней оценки составляющих ЭО и их энантиомеров, когда они хиральны, которые способствуют ингибирующей активности ЭО в отношении грибного источника тирозиназы, что является хорошей модельной системой для предварительного скринингатирозиназаингибиторы [17].

2. Результаты и обсуждение

2.1. Химический состав и содержание цитраля в исследуемом эфирном масле

В нашей попытке всесторонне охарактеризовать все потенциальные компоненты ЭО, которые способствуют рассматриваемой биологической активности, исследованные ЭО были проанализированы с помощью ГХ с обнаружением как ПИД, так и МС. Нормализованное относительное процентное содержание (рассчитанное из абсолютных площадей, нормализованных к внутреннему стандарту C13 с использованием коэффициентов отклика [18,19]) всех обнаруженных соединений было определено и использовано для сравнения составов ЭО. На рисунке 1 представлен профиль ГХ-МС исследованных ЭО, проанализированных с помощью обычной колонки. В таблице 1 для каждого исследованного ЭО перечислены соединения, которые показали нормализованное процентное содержание выше 0.1, а полные химические составы ЭО приведены в дополнительных материалах (таблицы S1-S5).

Все исследованные ЭМ богаты нералем (цис{{0}},7-диметил-2,6-октадиеналь) и гераниалем (транс-3,{ {5}}диметил-2,6-октадиеналь), которые являются наиболее распространенными соединениями. Отношение воздух/герань во всех исследованных ОР было очень сходным и соответствовало 0,74 ± 0,05. ЭМ C. schoenanthus и L. cubeba отличаются наиболее высоким содержанием нералей и геранилей, что составляет в среднем 60 процентов от всего их состава ЭМ, что в 1,5-раз больше, чем в ЭМ V. officinalis и в три ЭО M. officinalis (т. е. образцы 1, 2 и 3). Дополнительные кислородсодержащие соединения, общие для всех эфирных масел, включают 6-метил-5-гептен-1-он, линалоол и цитронеллаль. Последнего значительно больше в ЭО 1 M. officinalis, чем в других исследованных ЭО, включая ЭО 2 и 3 M. officinalis.

Обилие углеводородной фракции существенно различается в разных эфирных маслах.М. officinalis EO 1 содержит только транс- -кариофиллен и -гумулен в качестве сесквитерпеновых углеводородов, которые составляют 2,7% и 0,13% от общего количества ЭО соответственно. ЭМ C.schoenanthus представляет собой немного более богатую углеводородную фракцию, чем ЭО 1 M. officinalis (т.е. 7,0 процентов), содержащую оба монотерпена (т.е. камфен, цис{{1{{20) }}}}оцимен, лимонен, -пинен, транс- -оцимен, -туйен) и сесквитерпены (т.е. транс- -кариофиллен, -кадинен,δ-кадинен, гермакрен D, -элемен) в умеренном суммы. В эфирных маслах L. cubeba и V. officinalis углеводородная фракция составляет 20 процентов от общего количества эфирного масла, а лимонен является наиболее распространенным соединением (т. е. 15,0 и 10,9 процента соответственно), за которым следуют -пинен, пинен , сабинен, транс- -кариофиллен, -мирцен, камфен и -копаен. Наконец, M.officinalis ЭМ 2 и 3 характеризуются наиболее высоким содержанием углеводородной фракции (38,8% и 31,8% от общего ЭМ соответственно). В обоих образцах углеводородная фракция содержит в основном сесквитерпены, а именно транс- -кариофиллен (27,8% и 20,0% соответственно) и -гумулен (3,0% и 2,6%), а также восстановленную монотерпеновую фракцию, характеризующуюся в основном лимоненом ( 4,2% и 3,2% соответственно).

Были исследованы три образца ЭО L. cubeba, V. officinalis и C. schoenanthus, произведенные в разные годы, а также три образца ЭМ M. officinalis разных производителей. Анализы ГХ-МС C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis и V. officinalis не выявили существенных качественных и количественных различий в химическом составе трех образцов разных лет производства. Это может быть связано с оптимальными условиями хранения, т. е. в контейнере из темного стекла при температуре 4 ◦ C в темноте с незначительным свободным пространством над головой. }}кариофиллен в трех исследованных ЭМ M. officinalis. Содержание цитронеллы составляло 19,6%, 0,26% и 0,31% в M. officinalis EO 1, 2 и 3 соответственно. Напротив, как описано ранее, транс- -кариофиллен значительно выше в ЭО 2 и 3 M. officinalis, чем в ЭО 1 M. officinalis. Эти результаты согласуются с данными, полученными Seidler-Lozykawska et al., которые выявили значительные различия в содержании цитраля, цитронеллаля и транс- -кариофиллена в ЭО, полученных из 22 выбранных генотипов M. officinalis, происходящих из европейских ботанических садов [20].

Истинное количественное определение было выполнено с помощью калибровки внешнего стандарта для точной оценки содержания потенциальных биоактивных специализированных соединений (например, нераля, гераниала, лимонена, -мирцена и цитронеллаля). В таблицах 2 и 3 приведены диагностические ионы (m/z), используемые для SIM- МС-количественный анализ исследуемых соединений-маркеров вместе с диапазоном калибровки, уравнением калибровочной кривой, значениями корреляции и стандартной ошибкой регрессии для каждого аналита и результатами количественного анализа соответственно.

2.2. Ингибирующая активность исследуемых эфирных масел in vitro в отношении тирозиназы грибов

Как описано ранее, эфирные масла C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba и V. officinalis содержат высокие уровни цитраля, который характеризуется неконкурентной ингибирующей активностью в отношении грибкового источника тирозиназы [8,16,21]. . Это исследование было направлено на изучение in vitroтирозиназаингибирующей активности этих эфирных масел, чтобы выяснить, можно ли их ингибирующую активность приписать только содержанию цитраля или существуют другие биологически активные соединения, которые влияют на ингибирующие эффекты эфирных масел.

Грибтирозиназабыл принят здесь из-за его высокой гомологии с гумантирозиназой, его относительно низкой стоимости и доступности, что делает его хорошей модельной системой для предварительного скрининга ингибиторов тирозиназы [17]. Точность in vitroтирозиназаТест на ингибирование оценивали с точки зрения повторяемости (путем проведения теста ферментативного ингибирования пять раз в один и тот же день) и промежуточной точности (путем повторения теста ферментативного ингибирования пять раз каждые четыре недели в течение шести месяцев). В таблице 4 представлен коэффициент вариации (CV) для испытаний на ингибирование, проведенных с койевой кислотой, которую использовали в качестве положительного контроля, и с ЭО L. cubeba. Результаты были удовлетворительными, так как коэффициент вариации никогда не превышал 7 % для повторяемости и 10 % для промежуточной точности. В таблице 4 представлен коэффициент вариации для испытаний на ингибирование, проведенных с койевой кислотой, используемой в качестве положительного контроля, и с ЭО L. cubeba. Аналогичные значения прецизионности были получены для всех испытанных ЭО.

Кривую «концентрация цитраля-ответ» изучали путем построения графика наблюдаемой ингибирующей активности в зависимости от его концентрации в реакционной смеси. Все эфирные масла были испытаны при концентрации 166,7 мкг/мл, что обеспечило, независимо от эфирного масла, результирующую концентрацию цитраля в пределах диапазона линейности кривой зависимости концентрации от реакции (y=0,3956x плюс 1,8094, R{{7} },9951, ошибка регрессии: 2,08448, диапазон линейности: 6,7–166,7 мкг/мл) и не вызывали проблем с растворимостью в реакционной смеси.

Коробчатая диаграмма, показанная на рисунке 2, представляет проценттирозиназаингибирование для каждого ЭО. Для эфирных масел L. cubeba, V. officinalis и C. schoenanthus результаты, представленные на рисунке 2, соответствуют ингибирующей активности грибной тирозиназы эфирных масел 2020, поскольку дисперсионный анализ не выявил статистически значимых различий между эфирными маслами разных лет выпуска (p > 0,05). В отношении эфирных масел L. cubeba и C. schoenanthus эти результаты хорошо согласуются с результатами, полученными в результате количественного анализа GCMS, который выявил почти одинаковое количество цитраля в эфирных маслах разных лет производства. Партия 2020 V. officinalis EO содержит несколько большее количество цитраля, чем партии 2019 и 2018. Однако, согласно кривой зависимости концентрации цитраля от реакции, избыток цитраля в партии 2020 недостаточен для определения статистически значимо более высокого процента ферментативного ингибирования с учетом случайного ошибка, связанная с измерениями. Дополнительные сведения см. на рисунке S1 в дополнительном материале. С другой стороны, дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки-Крамера показал, что три протестированных эфирных масла M. officinalis, предоставленные разными производителями, ингибировали рост грибов.тирозиназав разной степени, которые будут подробно описаны в следующих параграфах. Наибольшая ингибирующая активность наблюдалась у ЭМ L.cubeba, M. officinalis 1 и V. officinalis, которые ингибировали 59 ± 6%, 55 ± 7% и 52 ± 6%тирозиназаактивности соответственно при тестировании в концентрации 166,7 мкг/мл. Статистически значимые (p < 0.05)="" более="" низкие="" активности="" наблюдались="" для="" эфирных="" масел="" c.="" schoenanthus="" и="" m.="" officinalis="" 2="" и="" 3,="" ингибирующая="" активность="" ферментов="" которых="" составляла="" 42="" ±="" 5%,="" 40="" ±="" 5%="" и="" 38="" ±="" 6%.="" процентов,="" соответственно.="" в="" таблице="" 5="" представлена="" ​​концентрация="" ингибитора,="" которая="" вдвое="" снижала="" активность="" фермента="" в="" данных="" экспериментальных="" условиях="" (ic50)="" для="" каждого="" исследованного="" ингибитора="" (т.е.="" эфирных="" масел,="" отдельных="" соединений="" и="" койевой="" кислоты).="" все="" эфирные="" масла="" эффективно="" ингибировали="" тирозиназу="" грибов="" и="" проявляли="" ингибирующую="" активность="" в="" среднем="" в="" 100-="" раз="" ниже,="" чем="" у="" койкацида,="" который="" использовался="" в="" качестве="" положительного="">

2.3. Идентификация дополнительных биоактивных компонентов, помимо цитраля, путем фракционирования под контролем биоанализа На гистограмме, представленной на рис. 3, сравнивается процент экспериментально измеренного ферментативного ингибирования со значениями, которые можно было бы ожидать, если бы нераль и гераниал (рассматриваемые как сумма, т. е. цитраль) были только активные соединения в исследуемых эфирных маслах. Эти значения были измерены путем интерполяции кривой зависимости концентрации цитраля от реакции. Как можно отметить, C. schoenanthus, M. officinalis 2 и M. officinalis 3 проявляли ингибирующую активность, которая соответствовала содержанию в них цитраля, в то время как ЭМ L. cubeba, M. officinalis 1 и V. officinalis ингибировали ЭМ грибов. тирозиназы в большей степени, чем ожидалось. Был принят биоуправляемый подход для выявления дополнительных соединений, которые способствуют активности цитраля. Кислородсодержащие и углеводородные фракции эфирных масел L. cubeba, M. officinalis 1 и V. officinalis были выделены с помощью флэш-хроматографии и по отдельности протестированы на грибовидность.тирозиназаингибирующая деятельность. Фракции фитохимически тестировали на их ингибирующую активность в отношении тирозиназы грибов. Фитогемические фракции фракций тестировали при той же концентрации, что и их результирующая концентрация при тестировании 166,7 мкг/мл соответствующего ЭМ (см. раздел «Материалы и методы» в разделе 3.2). В табл. 6 приведены концентрации нераля, гераниала, цитронеллаля, лимонена, и -мирцен в кислородсодержащей и углеводородной фракциях фракционированных ЭМ.

Что касается ЭМ L. cubeba и V. officinalis, то как кислородсодержащие, так и углеводородные фракции ингибировали тирозиназу грибов, хотя и в разной степени. Активность оксигенированных фракций (53 ± 3 % и 44 ± 5 ​​% соответственно) составляет большую часть антимикробных средств ЭО.тирозиназапотенциал и соответствовали соответствующему содержанию цитраля, предполагая, что соединения, которые способствуют активности цитраля, принадлежат к углеводородным фракциям. Углеводородные фракции эфирных масел L. cubeba и V. officinalis имеют весьма схожий химический состав. лимонен (68,4 и 5{7}},3 % соответственно), транс- -кариофиллен (12,0 и 7,8 % соответственно), -пинен (1,7 и 7,5 % соответственно), -пинен (2,5 и 12,9% соответственно), сабинен (2,7 и 3,8% соответственно) и -мирцен (2,0 и 2,4% соответственно) являются наиболее распространенными соединениями в обеих фракциях и присутствуют в довольно близких количествах, за исключением -пинен и -пинен, которые преобладают в углеводородной фракции эфирного масла V. officinalis.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99% в обоих ЭМ), лимонен (97 и 94% в ЭМ L. cubeba и V. officinalis соответственно) и сабинен (87% в обоих ЭМ), в то время как для -пинена ((-)- энантиомер: 38 процентов в ЭО L. cubeba и 73 процента в ЭО V. officinalis) и -пинен ((-)-энантиомер: 67 процентов в ЭО L. cubeba и 88 процентов в ЭО V. officinalis). В обоих эфирных маслах (-)-лимонен составляет более 50 процентов всей фракции. Однако, хотя в предыдущих исследованиях сообщалось об ингибирующей активности в отношении тирозиназы грибов из-за ее высокого содержания [22,23], (-)-лимонен здесь не проявлял ингибирующей активности в отношении тирозиназы. Аналогичные результаты были получены для (плюс)-лимонена, рацемической смеси и соединений (-)-транс- -кариофиллена, (±)- -пинена и (±)- -пинена. . Сабинен не тестировался, так как уже было доказано, что он имеет незначительное количество грибов.тирозиназаингибирующие эффекты [8]. В соответствии с предыдущими выводами [8], мирцен снижает активность тирозиназы грибов. При тестировании в концентрации, наблюдаемой в 166,7 мкг/мл эфирных масел L. cubeba и V. officinalis, активность -мирцена ликвидировала разрыв между ожидаемыми ингибирующими эффектами эфирных масел, если цитраль был единственным активным соединением, и экспериментальными результатами. Вопреки наблюдениям Matsuura et al. [8], -мирцен оказался более мощным ингибитором тирозиназы грибов, чем цитраль, так как его IC50 был почти в 10 раз ниже (13,3 мкг/мл против 121,8 мкг/мл). Эта разница может быть приписана различным используемым субстратам; Мацуура и др. исследовали только активность тирозиназы-дифенолазы грибов, поскольку они использовали L-ДОФА в качестве субстрата, тогда как в этом исследовании использовался L-тирозин. Текущие данные свидетельствуют о том, что -мирцен может быть более эффективным в ингибировании активности монофенолазы тирозиназы грибов, чем активность дифенолазы.

M. officinalis EO 1 содержит небольшую углеводородную фракцию, составляющую менее 3 процентов от общего количества, и не обладает активностью, ингибирующей тирозиназу. Однако оксигенированная фракция M. officinalisEO 1 ингибировала тирозиназу грибов в большей степени, чем можно было бы ожидать, исходя из содержания в ней цитраля (рис. 3). Эта фракция содержит значительные количества цитронеллаля в дополнение к нералю и гераниалю, и хиральный анализ показал высокую энантиомерную чистоту цитронеллаля в пользу (плюс) энантиомера (98,3%). При независимом тестировании в концентрации 166,7 мкг/мл (плюс)-цитронеллаль ингибировал грибную тирозиназу в незначительной степени, хотя его активность значительно повышалась при тестировании в сочетании с цитралем. Эти результаты могут объяснить различия, наблюдаемые в процентном содержании грибов.тирозиназаингибирование в различных эфирных маслах M. officinalis. M.officinalis EO 2 и 3 имеют очень низкое содержание цитронеллала, что может быть причиной того, что их ингибирующая активность значительно ниже, чем у M. officinalis EO 1.

3. Материалы и методы

3.1. Реагенты

Диметилсульфоксид (ДМСО), тирозиназа грибов из Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-тирозин, койевая кислота, цитраль, цитронеллаль, -мирцен, (плюс)-лимонен, (-)-лимонен, (±)-лимонен, ( ±)- и пинен были приобретены у Merck Life Science Srl (Милан, Италия). ЭМ Litsea cubeba, Verbena officinalis и Cymbopogon schoenanthus были предоставлены Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Италия). Для каждой были протестированы три партии разных лет (т.е. 2020, 2019, 2018). Были исследованы три образца эфирных масел Melissa officinalis: один был предоставлен Agronatura (Спиньо-Монферрато, Алессандрия), один – ErboristeriaMagentina Srl, а последний был приобретен в местном магазине у SpecchiasolS.rl (Буссоленго, Италия). В тексте авторы обозначают различные эфирные масла Melissa officinalis как эфирные масла M. officinalis 1, 2 и 3 соответственно. Предоставленные эфирные масла были получены в соответствии с процедурами, описанными в Европейской фармакопее [24]. ЭМ Melissa officinalis и Verbena officinalis получали путем гидродистилляции из листьев и надземных частей растений соответственно; аналогичным образом эфирные масла Litsea cubeba и Cymbopogon schoenanthus были получены паровой дистилляцией свежих плодов и свежих надземных частей соответственно. Каждое эфирное масло подвергали индивидуальному анализу с помощью ГХ-МС, как только оно было приобретено/предоставлено соответствующим производителем, каждый год хранения и непосредственно перед исследованием его ингибирующей активности грибной тирозиназы.

3.2. Анализ ингибиторов тирозиназы in vitro

тирозиназаИнгибиторную активность эфирных масел и выделенных соединений исследовали in vitro с использованием колориметрического ферментативного анализа, оптимизированного Zengh et al. [25], с небольшими изменениями. Тирозиназоингибирующая активность эфирных масел, а также их соответствующих углеводородных и оксигенированных фракций и чистых соединений была исследована в витроанализе с помощью колориметрического анализа ферментов на основе считывания, который был оптимизирован Zengh et al. [25], с небольшими изменениями: анализ проводили при комнатной температуре итирозиназаингибирование измеряли с учетом контроля и поглощения образца через 6 мин инкубации, а не через 20 мин, чтобы работать в условиях линейной части ферментативной реакции, что обеспечивает более точные результаты ингибирования [26,27]. Для этого исследования была выбрана тирозиназа грибов из Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach. L-тирозин использовали в качестве субстрата, что означает, что общая ингибирующая активность тирозиназы была исследована без различия между тирозиназной монофенолазной и дифенолазной активностью. Фотометрические измерения при 475 нм проводились на Thermo Spectronic Genesys6, а койевая кислота использовалась в качестве положительного контрольного ингибитора. Растворы исследуемых потенциальных ингибиторов (ЭМ, выделенные фракции ЭМ, индивидуальные соединения ЭМ и койкацид) готовили в ДМСО. В табл. 7 приведены протестированные концентрации для каждого исследуемого потенциального ингибитора. Грибтирозиназараствор 200 ЕД/мл (27,9 мкг/мл) готовили в натрий-фосфатном буфере (pH 6,8), аликвоты по 9 мл хранили при -18 ◦C и оттаивали непосредственно перед экспериментами. Раствор тирозина 0,1 мг/мл готовили в натрий-фосфатном буфере (pH 6,8) и обновляли ежедневно. Компоненты реакционной смеси помещали во флакон в следующем порядке: 1 мл раствора тирозиназы грибов 200 ЕД/мл; 1 мл буферного раствора фосфата натрия; 10 мкл ЭО/отдельного соединения/раствора койевой кислоты; и, наконец, 1 мл раствора тирозина 0,1 мг/мл. Конечное процентное содержание ДМСО в реакционной смеси составляло 0,3 процента. Анализ проводили в запечатанном флаконе емкостью 4 мл, чтобы избежать потери каких-либо компонентов ЭО в окружающую среду и свести к минимуму их попадание в свободное пространство над реакционной смесью. Реакционную смесь инкубировали на термостатированной водяной бане при 25°С в течение 6 мин. Затем регистрировали поглощение при 475 нм, так как эта длина волны позволяет идентифицировать дофахром. Поглощение, соответствующее 100 процентам активности тирозиназы, измеряли, заменяя раствор ЭО/индивидуальное соединение/койевая кислота 10 мкл чистого ДМСО. Пустые растворы готовили следующим образом: 2 мл буферного раствора фосфата натрия, 10 мкл ЭО/индивидуального соединения. /койевая кислота/раствор ДМСО и 1 мл раствора тирозина 0,1 мг/мл. Процент ингибирования тирозиназы измеряли в соответствии с приведенным ниже уравнением: процент ингибирования=∆A (контроль) − ∆A (образец) / ∆A (контроль) × 100, ∆A (контроль) или (образец) {{ 33}} A475 (контроль) или (образец) − A475 (контрольный бланк) или (проба бланка).

3.3. Колоночная флэш-хроматография

Фракционирование ЭО проводили на колоночной флэш-хроматографической системе PuriFlash450 производства Sepachrom (Rho, Милан, Италия), оснащенной УФ- и ELSD-детекторами. Количество фракционированного ЭО: 900,0 мг. Неподвижная фаза: сферические частицы силикагеля, 50 мкм, 25 мг (стационарный картридж Purezza®-Sphera) производства Sepachrom; подвижная фаза: петролейный эфир (А) и этилацетат (В); скорость потока 25 мл/мин. Линейный градиент элюирования был принят от 100 процентов А до 80 процентов А и 20 процентов В в течение 20 минут.

3.4. Условия анализа

Растворы ЭО и их соответствующих фракций готовили в циклогексане при концентрации 5,0 мг/мл и анализировали с помощью ГХ-МС. Количество цитраля, цитронеллаля, -мирцена и лимонена определяли в каждом ЭО и соответствующих выделенных фракциях с использованием метода калибровки по внешнему стандарту. Подходящие калибровочные уровни готовили в циклогексане и анализировали с помощью ГХ-МС. Тридекан (C13) 1,0 мг/мл использовали в качестве внутреннего стандарта для нормализации сигналов аналита. В таблице 2 приведены рассматриваемые диапазоны концентраций для каждого определяемого количественно соединения.

Анализы ГХ-МС проводились с использованием многоцелевого пробоотборника Gerstel MPS-2 (Мюльхайм-ан-дер-Рур, Германия), установленного на ГХ Agilent 6890 N, соединенного с МСД 5975 и оснащенного ChemStation версии E. 02.02.1431 система обработки данных (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Условия ГХ: температура инжектора: 250 ◦C; режим впрыска: разделенный; соотношение: 1/20; газ-носитель: гелий; постоянная скорость потока: 1 мл/мин; колонки: Mega5 (95% полидиметилсилоксан, 5% фенил) df 0,25 мкм, dc 0,25 мм, длина 25 м, от MEGA (Legnano, Италия). Температурная программа: 50 ◦C//3 ◦C/мин//180 ◦C//10 ◦C/мин//250 ◦C(5 мин). Условия МСД: МС работал в режиме ЭУ (70 эВ); диапазон сканирования: от 35 до 350 а.е.м.; время выдержки 40 мс; температура источника ионов: 230 ◦C; температура квадруполя: 150 ◦C; температура линии передачи: 280 ◦C. Маркеры ЭО были идентифицированы путем сравнения как их индексов линейного удерживания (ИТ), рассчитанных по сравнению со смесью углеводородов C9-C25, так и их масс-спектров либо с таковыми для подлинных образцов, либо с коммерчески доступными библиотеками масс-спектров (Adams, 2007). Хиральные анализы ЭО проводили, применяя те же условия анализа для 2,3-ди-O-метил-6-O-трет-бутилдиметилсилил- -CD (2,3DM6TBDMS-CD) df 0,25 мкм, dc 0,25 мм, длина 25 м от MEGA. Температурные программы: 40 ◦C(1 мин)//2 ◦C/мин//220 ◦C (5 мин).

Анализы ГХ-ПИД проводились на том же приборе. Условия ГХ: температура инжектора: 250 ◦C; режим впрыска: раздельный; соотношение: 1/20; газ-носитель: водород; скорость потока: 1 мл/мин. Температурные программы: 40 ◦C (1 мин)//2 ◦C/мин//220 ◦C (5 мин).

4. Выводы

Цели этого исследования заключались в том, чтобы (1) всесторонне изучить грибы in vitro.тирозиназаингибирующей активности эфирных масел Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis и Verbena officinalis и (2) определить, связана ли их биологическая активность только с содержанием цитраля или имеются дополнительные биоактивные монотерпены, которые вносят вклад в исследуемую биологическую активность, с использованием метод фракционирования, основанный на биоанализе. Это исследование показало, что в эфирных маслах L. cubeba и V. officinalis -мирцен способствует ингибирующей активности эфирных масел, несмотря на его небольшое количество, и было показано, что он обладает большей ингибирующей способностью по отношению к цитралю. Вторым важным открытием было то, что (плюс)-цитронеллаль усиливал действие цитральних грибов.тирозиназаингибирующая способность, потенциально через синергетическое взаимодействие, поскольку он не проявлял активности сам по себе. Последнее открытие объясняет, почему в эфирных маслах M. officinalis, содержащих незначительные количества (плюс)-цитронеллаля, ингибирующая активность соответствовала их содержанию цитраля, в то время как обратное было верно для эфирных масел M. officinalis с относительно высоким содержанием (плюс)-цитронеллаля. хотя все еще необходимы дальнейшие исследования для точного определения типа взаимодействия, которое происходит между -мирценом и цитралем и между цитронеллалем и цитралем, а также для оценки ингибирующей активности этих эфирных масел и отдельных соединений в отношении человека.тирозиназа, результаты этого исследования могут помочь рационально разработать смеси эфирных масел или обогащенных эфирных масел, которые улучшат их биологическую эффективность и увеличат их потенциал в качестве адъювантов при лечении гиперпигментации.

использованная литература

1. Пиллаяр, Т.; Маникам, М .; Namasivayam, V. Агенты для отбеливания кожи: перспективы медицинской химии ингибиторов тирозиназы. J. фермент. Ингиб. Мед. хим. 2017, 32, 403–425. [Перекрестная ссылка]

2. Десмедт, Б.; Курсель, П.; Де Бир, Дж. О.; Роджерс, В.; Гросбер, М.; Деконинк, Э.; Де Паэпе, К. Обзор средств для отбеливания кожи с обзором нелегального косметического рынка в Европе. Дж. Евр. акад. Дерматол. Венереол. 2016, 30, 943–950. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

3. Десмедт, Б.; Ван Хек, Э.; Роджерс, В.; Курсель, П.; Де Бир, Дж. О.; Де Паэпе, К.; Деконинк, Э. Характеристика предполагаемых незаконных косметических средств для отбеливания кожи. Дж. Фарм. Биомед. Анальный. 2014, 90, 85–91. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

4. Кубо, И.; Икуйо, К. Х. Флавонолы цветков шафрана: ингибирующая активность тирозиназы и механизм ингибирования. Дж. Агрик. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [Перекрестная ссылка]

5. Чанг, К.-Т.Т.; Чанг, В.-Л.Л.; Хсу, Дж.-К.С.; Ши, Ю .; Чоу, С.-Т.Т. Химический состав и ингибирующая тирозиназу активность эфирного масла Cinnamomum cassia. Бот. Стад. 2013, 54, 2–8. [Перекрестная ссылка]

6. Гарсия-Молина, МДМ; Муньос-Муньос, JL; Гарсия-Молина, Ф.; Гарсия-Руис, Пенсильвания; Гарсия-Кановас, Ф. Действие тирозиназы на ортозамещенные фенолы: возможное влияние на потемнение и меланогенез. Дж. Агрик. Пищевая хим. 2012, 60, 6447–6453. [Перекрестная ссылка]

7. Кубо, И.; Кинст-Хори, И. Ингибиторы тирозиназы из тмина. Дж. Агрик. Пищевая хим. 1998, 46, 5338–5341. [Перекрестная ссылка]

8. Мацуура Р.; Укеда, Х .; Савамура, М. Тирозиназная ингибирующая активность эфирных масел цитрусовых. Дж. Агрик. Пищевая хим. 2006, 54, 2309–2313. [Перекрестная ссылка]

9. Лерцатиттханакорн, П.; Тавичайсупапонг, С.; Аромди, К.; Khunkitti, W. Биоактивность эфирных масел in vitro, используемых для борьбы с акне. Междунар. Дж. Ароматер. 2006, 16, 43–49. [Перекрестная ссылка]

10. Бузенна, Х.; Хфайед, Н .; Жиру-Метжес, М.-А.; Эльфеки, А .; Талармин, Х. Биологические свойства цитраля и его потенциальное защитное действие против цитотоксичности, вызванной аспирином в клетках IEC-6. Биомед. Фармацевт. 2017, 87, 653–660. [Перекрестная ссылка]

11. Ли, Х.Дж.; Чон, HS; Ким, ди-джей; Нет, ЮХ; Юк, Д.Я.; Хонг, Дж. Т. Ингибирующее действие цитраля на продукцию NO путем подавления экспрессии iNOS и активации NF-κB в клетках RAW264.7. Арк. фарм. рез. 2008, 31, 342–349. [Перекрестная ссылка]

12. Карвалью, ПММ; Маседо, CAF; Рибейро, ТФ; Сильва, А.А.; Да Силва, RER; де Морайс, LP; Кернтопф, М. Р.; Менезес, ИРА; Барбоза, Р. Влияние эфирного масла Lippia alba (Mill.) NE Brown и его основных компонентов, цитраля и лимонена, на гладкие мышцы трахеи крыс. Биотехнолог. 2018, 17, 31–34. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

13. Перейра-де-Морайс, Л.; Сильва, АдА; да Силва, RER; Коста, RHSd; Монтейро, AB; Барбоза, CRdS; Аморим, TdS; деМенезес, ИРА; Кернтопф, М. Р.; Барбоза, Р. Токолитическая активность эфирного масла Lippia alba и его основных компонентов, цитраля и лимонена, на изолированной матке крыс. хим. биол. Взаимодействовать. 2019, 297, 155–159. [Перекрестная ссылка]

14. Да Силва, RER; де Морайс, LP; Сильва, А.А.; Бастос, CMS; Перейра-Гонсалвеш, А.; Кернтопф, М. Р.; Менезес, ИРА; Леал-Кардосо, Дж. Х.; Барбоза, Р. Вазорелаксантное действие эфирного масла Lippia alba и его основного компонента, цитраля, на сократительную способность изолированной аорты крысы. Биомед. Фармацевт. 2018, 108, 792–798. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

15. Соуза, Д. Г.; Соуза, SDG; Сильва, RER; Сильва-Алвес, Канзас; Феррейра-да-Силва, FW; Кернтопф, М. Р.; Менезес, ИРА; Леал-Кардосо, Дж. Х.; Барбоза, Р. Эфирное масло Lippia alba и его основной компонент цитраль блокируют возбудимость седалищных нервов крыс. Браз. J. Med.Biol. рез. 2015, 48, 697–702. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

16. Хуан, X.-W.; Фэн, Ю.-К.; Хуанг, Ю .; Ли, Х.-Л. Потенциальное косметическое применение эфирного масла, полученного из плодов литсеи кубебы из Китая. Дж. Эссент. Масляный Рез. 2013, 25, 112–119. [Перекрестная ссылка]

17. Золгадри, С.; Бахрами, А .; Хасан Хан, MT; Муньос-Муньос, Дж.; Гарсия-Молина, Ф.; Гарсия-Кановас, Ф.; Сабури, А.А. Всесторонний обзор ингибиторов тирозиназы. Дж. Энзим. Ингиб. Мед. хим. 2019, 34, 279–309. [Перекрестная ссылка]

18. Бикки, К.; Либерто, Э .; Маттеодо, М .; Сгорбини, Б.; Монделло, Л.; Целльнер, Бд; Коста, Р.; Рубиоло П. Количественный анализ эфирных масел: сложная задача. Аромат Фрагр. Дж. 2008, 23, 382–391. [Перекрестная ссылка]

19. Рубиоло П.; Сгорбини, Б.; Либерто, Э .; Кордеро, К.; Бикки, К. Эфирные масла и летучие вещества: подготовка и анализ проб. Обзор.Flavour Fragr. Дж. 2010, 25, 282–290. [Перекрестная ссылка]

20. Зайдлер-Лозиковска, К.; Бочановски, Дж.; Кроль Д. Оценка изменчивости морфологических и химических признаков выбранных генотипов мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.). Инд. Культуры Прод. 2013, 49, 515–520. [Перекрестная ссылка]

21. Кубо, И.; Кинст-Хори, И. Ингибирующая тирозиназу активность ароматических соединений оливкового масла. Дж. Агрик. Пищевая хим. 1999, 47, 4574–4578. [CrossRef] [PubMed]

22. Фиокко Д.; Арчиули, М .; Арена, депутат; Бенвенути, С .; Галлоне А. Химический состав и антимеланогенный потенциал различных эфирных масел. Аромат Фрагр. Ж. 2016, 31, 255–261. [Перекрестная ссылка]

23. Ху, Дж.Дж.; Ли, Х .; Лю, XH; Чжан В.П. Ингибирующее действие эфирного масла лимона на активность тирозиназы грибов in vitro. Мод. FoodSci. Технол. 2015, 31, 97–105. [Перекрестная ссылка]

24. Совет Европы. Европейская фармакопея, 10-е изд.; Совет Европы: Страсбург, Франция, 2020 г.; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Чжэн З.П.; Тан, HY; Чен, Дж.; Ван, М. Характеристика ингибиторов тирозиназы в ветвях Cudrania tricuspidata и изучение взаимосвязи между их структурой и активностью. Фитотерапия 2013, 84, 242–247. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

26. Уильямс, КП; Scott, JE Enzyme Assay Design для высокопроизводительного скрининга. В высокопроизводительном скрининге. Методы молекулярной биологии (методы и протоколы); Янзен, В.П., Пол, Б., ред.; Humana Press: Клифтон, Нью-Джерси, США, 2009 г.; Том 565, стр. 107–126.

27. Брукс, Х.Б.; Джиганадж, С .; Каль, SD; Монтроуз, К.; Ситтампалам, С .; Смит, MC; Вейднер, Дж. Р. Основы ферментативного анализа HTS. В Руководстве по проведению анализа; Маркосян С., Ситтампалам С., Гроссман А., ред.; Eli Lilly & Company и Национальный центр развития трансляционных наук: Bethesda, MD, США, 2004 г.