Сочетание инфузии адоптивных NK-клеток с пептидом, высвобождающим дофамин, снижает количество стареющих клеток у старых мышей

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

ВВЕДЕНИЕ

Старение является одним из основных факторов риска многих заболеваний [1], и разработка методов воздействия на старение позволит значительно снизить риск ряда возрастных заболеваний, таких как сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания [2, 3], рак [4] и болезнь Альцгеймера [5]. Стареющие клетки (СНК) постепенно накапливаются в тканях в процессе старения и считаются основной причиной возрастных заболеваний [6-8]. Было показано, что удаление SNC на моделях мышей предотвращает или отсрочивает дисфункцию тканей и увеличивает продолжительность здоровой жизни [9, 10]. Напротив, трансплантация небольших количеств SNC вызывает физиологическую дисфункцию у молодых мышей [1]. Эти исследования открыли двери для разработки методов, направленных на удаление SNC для облегчения возрастных хронических заболеваний.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Целенаправленное устранение SNC, называемое «сенолитиками», было первой химиотерапией, успешно испытанной в доклинической модели in vivo, и в настоящее время существует несколько сенолитических агентов [12]. Многие из этих препаратов нацелены на усиленные антиапоптотические пути в СНК для избирательной очистки определенных типов СНК и продемонстрировали потенциал для увеличения продолжительности жизни и улучшения функций организма [13, 14].Экстракт цистанхе против радиацииНесмотря на успешное реверсирование возрастной патологии на животных моделях, могут существовать некоторые препятствия для использования сенолитиков у человека из-за гетерогенности СНК и высокого риска токсичности [15]. Поэтому следует изучить альтернативный метод, который может безопасно устранить широкий спектр СНК у людей.

SNP могут быть распознаны и удалены иммунной системой [16]. Предыдущие исследования показали, что SNC активируют клетки-естественные киллеры (NK) за счет активизации основного лиганда, связанного с цепью I класса гистосовместимости, белков A и B [17]. Однако с возрастом эффективность иммунной системы снижается, что может привести к иммунному ускользанию СНК [18]. Методы преодоления ускользания от иммунного ответа, вызванного снижением иммунной функции, изучались в терапии рака [19]. Недавний прогресс был достигнут в адоптивном переносе NK-клеток для устранения опухолей, что показало некоторую эффективность [20]; таким образом, было разумно предположить, что адоптивная инфузия NK-клеток может вызывать цитотоксичность в SNC.

Нервная и иммунная системы являются двумя наиболее важными адаптивными системами организма. Несколько исследований показали, что дофамин (DA) как иммунный регулятор является ключом к нейроиммунной коммуникации [21]. DA выполняет свои биологические функции путем взаимодействия и активации дофаминовых рецепторов (DR), которые делятся на 2 подгруппы: D1-подобные (D1 и D5) и D2-подобные (D2, D3, и D4). С точки зрения их различных функций, участие D1-подобных DR стимулирует продукцию цАМФ, в то время как привлечение D2-подобных DR ингибирует продукцию цАМФ [22]. Предыдущие исследования показали, что D1-подобная стимуляция DR усиливает цитотоксичность NK-клеток как in vitro [23], так и in vivo [24]. Однако уровни DA снижаются по мере увеличения возраста человека [25]. Таким образом, мы предположили, что дофаминергические препараты могут усиливать цитотоксичность адоптивной инфузии NK-клеток.

Цистанхе может омолаживать

Здесь мы предлагаем использовать нонапептид ацеин, который взаимодействует с ангиотензинпревращающим ферментом (ACE I) для индукции секреции DA [26], в сочетании с системной терапией NK-клетками для устранения SNC. Результаты in vitro показали, что NK-клетки удаляли SNC независимо от индукторов старения и типов клеток.цистанхе траваВ модели стареющих мышей терапия NK-клетками в сочетании с ацеином значительно снижала количество связанных со старением -галактозидаза (SA- -gal)-позитивных клеток во многих тканях, снижала экспрессию генов, связанных со старением, в основных органах. и облегчение связанных со старением секреторных фенотипов (SSP). Результаты этого исследования дают представление о возможном восстановлении иммунного надзора за хроническими SNC с помощью терапии NK-клетками в сочетании с Ace.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Адаптивная инфузия NK-клеток снижает старение CD3 плюс Т-клетки в периферической крови.

Для исследования были набраны 26 добровольцев, которым вводили инфузию NK-клеток. Характеристики и свойства NK-клеток добровольцев представлены в таблице 1. Временной интервал для сбора крови после трансфузии NK-клеток составил около 37 (25-57) дней. Доля (фиг.1А) и абсолютное количество (фиг.1Б) NK-клеток в периферической крови были обратно пропорциональны возрасту добровольцев. Удивительно, но чистота продукта NK-клеток, реинфузированного каждому человеку, также обратно коррелировала с возрастом добровольцев (рис. 1C).рост полового членаЭто может быть связано с постепенным уменьшением количества NK-клеток с возрастом. Чтобы отразить омолаживающий эффект введения NK-клеток, до и после инфузии NK-клеток были обнаружены множественные маркеры старения в CD3 плюс Т-клетках периферической крови, которые в значительной степени отражают возрастной фенотип организма [27]. По сравнению с маркерами старения и фактором SASP CD3 плюс Т-клетки в периферической крови до и после инфузии аутологичных NK-клеток доля SA- -гал-позитивных Т-клеток после инфузии значительно уменьшилась (рис. 1D). Уровни мРНК P16, P21 и ингибитора активатора плазминогена 1 (Pai1) были значительно снижены, в то время как изменения уровней мРНК моноцитарного хемоаттрактантного белка -1 (MCP-1) и IL-6 не были значительными (рис. 1E). Достоверной разницы в биохимических показателях (дополнительная таблица 1) в периферической крови не было.

NK-клетки человека снижают маркеры старения жировой ткани и секрецию провоспалительных цитокинов.

Жировая ткань была собрана у трех людей с ожирением, поскольку ожирение имеет тенденцию вызывать накопление SNC [28]. Кроме того, жировую ткань культивировали в кондиционированной среде из SNC, чтобы дополнительно вызвать старение жировой ткани. В качестве контроля рассматривали жировую ткань, культивируемую в кондиционированной среде из не-SNC. Экспрессия перфорина (фиг. 2А) и CD69 (фиг. 2В) в NK-клетках значительно повышалась после совместной инкубации со стареющей жировой тканью по сравнению с совместной инкубацией с контрольной жировой тканью. Экспрессия маркеров старения р16 и р21 в

Стареющая жировая ткань была значительно уменьшена после обработки NK-клетками (рис. 2C, дополнительные рис. 1A, B). Мы также обнаружили, что ключевой компонент SASP в кондиционированной среде после совместной инкубации с NK-клетками в стареющей группе был значительно снижен (рис. 2D). Эти результаты свидетельствуют о том, что NK-клетки могут устранять SNC из жировой ткани и снижать фенотип SASP.

NK-клетки мыши могут быть активированы против SNC и проявлять цитотоксичность.

Сначала мы индуцировали старение клеток-предшественников жировой ткани мыши облучением или адриамицином, как описано ранее [29]. Чтобы определить, были ли NK-клетки специфически активированы SNC, необлученные контрольные клетки или облученные SNC инкубировали совместно с NK-клетками в течение 24 часов. Проточная цитометрия показала, что уровни экспрессии CD69 (фиг. 3A) и IFN-γ (фиг. 3B) в NK-клетках были значительно повышены в клетках-мишенях SNC по сравнению с контрольными клетками-мишенями. Между тем, после совместной инкубации с NK-клетками уровень апоптоза SNC был значительно выше, чем у контрольных клеток (рис. 3C). Затем мы обнаружили экспрессию лигандов, активирующих и ингибирующих NK-клетки, в SNC. Результаты количественной ПЦР показали, что уровень экспрессии активирующих лигандов в NK-клетках был значительно повышен по сравнению с контрольными клетками, а уровень экспрессии некоторых ингибирующих лигандов, таких как бета-2-микроглобулин (2m), был снижен по сравнению с контрольными клетками (рис. .3D). Мы также исследовали способность NK-клеток устранять SNC in vivo.Польза цистанче сальсыDiR-меченые контрольные клетки и DiR-меченые SNC трансплантировали в брюшную полость мышей, а NK-клетки вводили через хвостовую вену. Результаты визуализации in vivo показали, что интенсивность флуоресценции у мышей, которым трансплантировали SNC после обработки NK-клетками, была значительно слабее, чем у мышей, которым трансплантировали контрольные клетки (Fig. 3E). Это указывало на то, что способность NK-клеток убивать СНК была значительно выше, чем у СНК in vivo. Затем мы определили, была ли цитотоксичность NK-клеток против SNC дозозависимой и клеточно-специфичной. В то же время мы также использовали индуцированное доксорубицином старение, чтобы определить, ограничивается ли цитотоксичность NK-клеток против SNC радиационной индукцией. Результаты показали, что NK-клетки обладали значительной цитотоксической активностью в отношении SNC в зависимости от дозы, но незначительной цитотоксичностью в отношении контрольных клеток. Различные методы стимуляции старения не влияли на способность NK-клеток убивать SNC (рис. 3F). Эти результаты свидетельствуют о том, что NK-клетки могут быть специфически активированы SNC и проявлять значительную цитотоксичность против SNC in vitro и in vivo.

DA усиливает цитотоксичность мышиных NK-клеток против SNC через D1-подобные рецепторы.

Принимая во внимание важную нейроиммунную коммуникативную функцию DA [30], мы оценили, может ли DA усиливать цитотоксичность мышиных NK-клеток против SNC. NK-клетки совместно инкубировали с радиационно-индуцированными SNC, и в среду добавляли DA в различных концентрациях. Результаты показали, что DA может усиливать цитотоксичность NK-клеток в отношении SNC (рис. 4A, B). Чтобы охарактеризовать сигнальный путь, с помощью которого DA усиливает убивающий эффект NK-клеток на SNC, оценивали изменения экспрессии DR, содержания цАМФ и фосфорилирования белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB), в NK-клетках. В NK-клетках, совместно инкубированных с SNC вместе с DA, содержание цАМФ (рис. 4C) и уровень фосфорилирования CREB (рис. 4D, дополнительная рис. 2A) были значительно увеличены по сравнению с NK-клетками и коинкубацией SNC. без ДА. Чтобы выяснить, почему DA усиливает киллерную активность NK-клеток против SNC, мы сравнили изменения DR на NK-клетках после совместной инкубации NK-клеток с SNC или контрольными клетками. Результаты показали, что уровень экспрессии DR D1 и D5 значительно повышался после совместной инкубации NK-клеток с SNC по сравнению с контрольными клетками (фиг. 4E). Далее, DA и D1-подобные антагонисты рецепторов или D2-подобные

антагонисты рецепторов добавляли вместе в системе совместной инкубации NK-клеток и SNC. По сравнению с добавлением только DA уровень апоптоза SNC снижался при добавлении DA плюс SCH-23300 (антагонист D1-подобного рецептора) (рис. 4F, G). Между тем, содержание цАМФ (рис. 4H) и уровень фосфорилирования CREB (рис. 4l, дополнительная рис. 2B) в NK-клетках были снижены. Напротив, добавление DA плюс галоперидол (антагонист рецептора D2) существенно не изменило уровень апоптоза SNC, содержание цАМФ и фосфорилирование CREB в NK-клетках по сравнению с добавлением только DA. Эти результаты продемонстрировали, что дофамин увеличивает киллерную активность NK-клеток мыши против SNC через D1-подобные Drs.

Ace в сочетании с мышиными NK-клетками значительно увеличивает клиренс SNC in vivo.

Предыдущее исследование показало, что дофамин снижается с возрастом у людей [22]. Сначала мы измерили периферический уровень дофамина у молодых и старых мышей. Результаты показали, что уровни дофамина в плазме старых мышей были ниже, чем у молодых мышей (фиг. 5А). Затем у старых мышей исследовали периферическое высвобождение дофамина после внутрибрюшинной инъекции ацеина. Мы обнаружили, что уровни дофамина в плазме значительно увеличились после инъекции ацеина 10 мг / кг (рис. 5B, дополнительная рис. 3). В связи с этим мы использовали мышиные NK-клетки в сочетании с ацеином для лечения старых мышей. Мы определили состояние NK-клеток в периферической крови мышей после лечения и обнаружили, что количество NK-клеток в периферической крови при инфузии одних NK-клеток или NK-клеток в сочетании с ацеином было значительно выше, чем в группе, получавшей Ace, и группе PBS, тогда как количество NK-клеток существенно не отличалось между группой, обработанной NK-клетками, и NK-клетками, объединенными с группой, обработанной ацеином (фиг. 5C, D).дозировка цистанхе тубулозы redditДальнейшее определение уровня активации NK-клеток показало, что уровень экспрессии CD69 в NK-клетках периферической крови в группе комбинированного лечения был значительно повышен по сравнению с группой, обработанной NK-клетками (фиг.5E). Затем мы оценили SNC в ткани. Мы обнаружили, что вливание одних NK-клеток снижало экспрессию некоторых маркеров старения по сравнению с группой, получавшей PBS и группой, получавшей ацеин, тогда как вливание NK-клеток в сочетании с ацеином значительно уменьшало количество SA- -gal-положительных клеток (рис. 5F). ), а также уровни экспрессии P16 и P21 (рис. 5G, дополнительные рис. 4A, B) в жировой ткани по сравнению с обработкой только NK-клетками. Количество клеток Ki67BrdU в жировой ткани также было значительно увеличено (рис. 5H), что еще раз доказывает, что содержание SNC в жировой ткани было ниже в группе комбинированного лечения. Окрашивание срезов печени, легких, почек и жира SA- -gal также показало самый низкий уровень SNC в группе комбинированного лечения (дополнительная рис. 5A-D). Эти результаты показали, что NK-клетки в сочетании с терапией ацеином повышали уровень активации NK-клеток у мышей и вызывали значительную элиминацию SNC in vivo.

Ace в сочетании с NK-клетками снижает возрастные фенотипы у старых мышей

Для дальнейшего подтверждения возрастных фенотипов у мышей были собраны ткани печени, легких, почек, жира и глаза для обнаружения различных маркеров старения, включая факторы P16, P21 и SASP. Эти образцы были выбраны потому, что эти ткани с большей вероятностью подвержены старению с возрастом [31]. В каждой ткани после инфузии только NK-клеток уровни мРНК факторов P16, P21 и SASP были значительно ниже, чем в контрольной группе, тогда как уровни маркеров старения в тканях печени, жировой ткани и евен в комбинированных обработанных тканях группа была дополнительно снижена по сравнению с группой, получавшей только инфузию NK-клеток (фиг. 6A). Точно так же мы также обнаружили основной фактор SASP в сыворотке мышей, и результаты согласовывались с результатами в тканях (фиг.6В). Кроме того, мы также исследовали уровни НАД в печени и жировой ткани, которые связаны со старением [32]. Мы обнаружили, что инфузия NK-клеток отдельно или в составе комбинированной терапии достоверно увеличивала содержание НАД в печени и жировой ткани, при этом уровень улучшения был значительно выше в группе комбинированной терапии (рис. 6В). Некоторые биохимические показатели сыворотки, включая АЛТ, АСТ, CREA, UA, CHOL и BUN, связаны с уровнями старения [33]. Мы обнаружили, что только МК была значительно снижена в сыворотке мышей в группе комбинированного лечения, в то время как другие ключевые биохимические показатели не изменились.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Инфузия NK-клеток человека

Инфузия аутологичных NK-клеток была проведена Шанхайской онкологической больницей Мэнчао (Шанхай, Китай), и все протоколы были одобрены их комитетом по этике (№ 05, 2020, Комитет по медицинской этике Шанхайской онкологической больницы Мэнчао). Все добровольцы дали подписанное информированное согласие на получение периферической крови. Вкратце, у каждого человека было извлечено 50 мл периферической крови, после чего мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были выделены и перенесены в колбу T75 со средой ExCellerate Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA), содержащей 1×Cloudz CD2/NKp46. , рекомбинантный человеческий IL-2(27 нг/мл), рекомбинантный человеческий IL-12 (10 нг/мл), рекомбинантный человеческий IL-18 (10 нг/мл и рекомбинантный человеческий L{{ 13}}(10 нг/мл) (R&D Systems, США) в течение 48 ч, а затем заменяют активированной средой (270 нг/мл рекомбинантного IL человека-2, 20 нг/мл рекомбинантного IL человека-12 , 20 нг/мл рекомбинантного ИЛ человека-18 и 20 нг/мл рекомбинантного ИЛ человека-21) для дальнейшего культивирования. Плотность клеток поддерживали на уровне 1×10 градусных клеток/мл. На 28-й день культивирования , небольшое количество аутологичных NK-клеток было собрано для контроля качества и внутривенно повторно введено вместе с аутологичными NK-клетками при плотности 4,15 × 10 градусов (3,76-5,87 × 10) клеток со временем инфузии 30 мин. , Экспериментальный процесс был проведен в соответствии с nce с Надлежащей клинической практикой. Временной интервал для повторного забора крови составил около 37 (25-57) дней.

Выделение Т-клеток и NK-клеток периферической крови человека Свежая кровь была получена от здоровых добровольцев после предоставления информированного согласия, и протокол был одобрен институциональным наблюдательным советом Китайского фармацевтического университета (номер разрешения: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Канада) использовали для выделения РВМС человека. Человеческие CD3 плюс Т-клетки получали из РВМС с использованием магнитных гранул для сортировки CD3 Т-клеток человека (Miltenyi Biotec, Германия) в соответствии с протоколом производителя. NK-клетки выделяли из периферической крови с использованием коктейля для обогащения NK-клеток человека RosetteSep (STEMCELL Technologies) в соответствии с протоколом производителя.

Разделение и размножение мышиных NK-клеток in vitro

NK-клетки селезенки мыши выделяли с использованием набора для выделения NK-клеток (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, получали селезенки мышей, клетки селезенки фильтровали с использованием клеточного фильтра 70 мкм, а лимфоциты селезенки получали центрифугированием в градиенте плотности с использованием набора для разделения лимфоцитов селезенки мышей (Solarbio, Китай). Лимфоциты селезенки собирали для получения NK-клеток высокой чистоты с использованием магнитных шариков для разделения мышиных NK-клеток. Выделенные NK-клетки селезенки культивировали в поддерживающей среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 % L-глутамина, 1 % пенициллина/стрептомицина, 1 % минимальной основной среды (MEM). незаменимая аминокислота, 1 процент пирувата натрия и 50 мкМ меркаптоэтанола (все от Life Technologies, США). Кроме того, к тесту добавляли 200 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина 2 (RL-2) (PeproTech, США) и 10 нг/мл мышиного I-15(мл-15) (PeproTech). средний. Затем собирали 10-градусные NK-клетки и 10-градусно облученные лимфоциты селезенки и 5 мл среды для амплификации (поддерживающая среда с добавлением 1000 МЕ/мл rlL-2, 10 нг/мл мл-15 и 30 нг/мл антигена). -антитело NKp46 (PA5-46986, Invitrogen, USA)) было

Рис.3 SNC активируют NK-клетки и уничтожаются NK-клетками. Проточную цитометрию для определения экспрессии (A) CD69 и (B) IFN-y проводили после 24-часовой совместной инкубации с мышиными NK-клетками и преадипоцитами или индуцированными облучением преадипоцитами. п =3. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Различия оценивали с помощью двустороннего непарного непараметрического t-теста. **П<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Экстракция преадипоцитов и мышечных сателлитных клеток

Преадипоциты экстрагировали, как описано ранее [11]. Вкратце, человеческий или мышиный жир удаляли в стерильных условиях и разрезали на кусочки 1-2 мм, дважды промывали PBS и расщепляли коллагеназой II (Solarbio) при 37 градусах в течение 1 часа. Затем клетки фильтровали с помощью клеточного фильтра 100 мкм, центрифугировали при 300 g в течение 5 мин и собирали. Адгезивные клетки культивировали в a-MEM с добавлением 20% FBS в течение 12 ч и обрабатывали трипсином для сбора адгезивных клеток. Сателлитные клетки мышц выделяли, как описано ранее [34]. Четырехглавую мышцу разрезали на куски 1-2 мм и добавляли 5 мл коллагеназы II для расщепления при 37°С в течение 12 мин. Смесь перемешивали пипеткой и добавляли 5 мл полной среды после дополнительного переваривания в течение 12 мин. Клетки фильтровали с использованием клеточного фильтра 70 мкм и центрифугировали при 300 g в течение 5 мин. Затем клетки были

культивировали с добавлением 5 мл среды ежедневно в течение 4 дней. Прилипшие клетки сдували пипеткой и центрифугировали при 2000×g в течение 5 мин. После расщепления трипсином при 37° в течение 5 минут клетки центрифугировали при 2000×g в течение 5 минут и собирали. Затем добавляли 5 мл среды F-10 Хэма с добавлением 20 процентов FBS и 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов (PeproTech).

Цитотоксичность NK-клеток селезенки мыши по отношению к SNC была обнаружена с помощью анализа лактатдегидрогеназы.

SNC индуцировали 0,2 мкМ адриамицина (MedChemExpress, США) в течение 24 часов или путем непрерывного культивирования в течение 20 дней после рентгеновского облучения 10 Гр. Затем 5000 SNC помещали в планшет и добавляли NK-клетки селезенки (жизнеспособность клеток: 93,5-97,1 процента) в соотношениях эффектор/мишень 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25: 1, 3,125:1 и 1,563:1. Супернатанты собирали после совместного культивирования при 37°С в течение 24 ч, для детекции использовали набор для определения цитотоксичности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Cayman Chemical, США). Цитотоксичность рассчитывали по следующей формуле: цитотоксичность (в процентах) =(экспериментальная смесь клеток-мишеней-спонтанная эффекторная клетка)/(максимум клеток-мишеней-спонтанная клетка-мишень)×100.

Живая визуализация

Двенадцатинедельные мыши C57BL/6 в возрасте 10- были приобретены у Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Цзянсу, Китай). Затем 1×10 градусов 1,1'-октадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин йодид (DiR) (Invitrogen)-меченый контроль

преадипоциты или радиационно-индуцированные стареющие преадипоциты ресуспендировали в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и вводили в брюшную полость мышей с помощью иглы 22 калибра. Через три дня через хвостовую вену инъецировали 5×10 аллогенных NK-клеток (жизнеспособность клеток: 93,6-96,2%) в 100 мкл PBS. На 10-й день мышей анестезировали изофлураном. Флуоресценцию определяли с помощью системы визуализации in vivo серии MS 100 (PerkinElmer, MA, USA).

Проточной цитометрии

Для обнаружения апоптоза SNC, инкубированных совместно с DiR-мечеными NK-клетками селезенки (жизнеспособность клеток: 91,8-93,2 процента), SNC 1×10 градусов расщепляли с точностью при 37 градусах в течение 10 минут, а затем окрашивали. с помощью набора для окрашивания апоптоза аннексином V и йодидом пропидия (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., Китай) в соответствии с протоколом производителя. SNC были закрыты в DiR-отрицательном положении. Чтобы проверить активацию NK-клеток, мышиные NK-клетки собирали и окрашивали mNK1.1-аллофикоцианином (APC)(S17016D) и мышиным кластером дифференцировки 69-R-фикоэритрин-цианином7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, США) при 4 градусах в течение 30 мин. Затем клетки обрабатывали набором CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, США) и окрашивали мышиным интерфероном гамма-бриллиантовый фиолетовый 421 (mlFNy-BV421)(XMG1.2) при 4 градусах в течение 30 мин. Окрашивание перфорином-APC(S16009A) NK-клеток человека проводили с использованием того же протокола, что и для внеклеточного окрашивания (CD56-флуоресцеинизотиоцианат [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) и внутриклеточное окрашивание (перфорин-APC) (Biolegend).

Для обнаружения NK-клеток периферической крови собирали 100 мкл антикоагулянтной крови. Для периферической крови мыши были добавлены CD3-FITC, NK1.1-APC и CD69-PE-Cy7. Для периферической крови человека добавляли CD3-BV421 (OKT3) и CD56-FITC и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.

Затем добавляли 400 мкл 1× лизата эритроцитов (BD Biosciences) и инкубировали в течение 3 мин с последующими тремя промываниями PBS. Для выявления пролиферации клеток в жировой ткани мышам внутрибрюшинно вводили 200 мкл 10 мг/мл бромдезоксиуридина (BrdU) за 24 и 72 часа до эвтаназии. После эвтаназии паховые жировые отложения удаляли и разрезали на фрагменты, расщепляли при 37°С в течение 30 мин коллагеназой II и ДНКазой и фильтровали с использованием клеточного фильтра 100 мкм. Клетки обрабатывали набором Cytofix/Cytoperm Plus и окрашивали BrdU-FITC (3D4) и Ki67-PE (16A8). Проточную цитометрию проводили на проточном цитометре CytoFLEX. Для исключения мертвых клеток во всех экспериментах использовали набор LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Обратная транскрипция-количественная ПЦР

РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol, реверсировали и транскрибировали в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК Hair 1st Strand (Yepsen Biotechnology, Китай). Количественную ПЦР (кПЦР) проводили с использованием реакционной смеси SYBR Green (Yepsen Biotechnology) на системе ПЦР в реальном времени ABC QuantStudio 3 (Applied Biosystems, США), внутренний контроль – GAPDH. Данные анализировали с использованием метода 2-△ACt. Список последовательностей праймеров приведен в дополнительном материале (таблица 2-3).

Окрашивание -галактозидазой, связанное со старением

Для окрашивания клетки однократно промывали PBS, фиксировали в растворе ассоциированной со старением -галактозидазы(SA- -gal) (Cell Signaling Technology, США) при комнатной температуре в течение 15 мин, трижды промывали PBS и инкубировали. ночь в растворе для окрашивания SA- -gal при 37°C. Планшет закрывали парафильмом для предотвращения испарения окрашивающей среды. Клетки

промывали PBS и наблюдали под микроскопом. Для окрашивания замороженных срезов срезы высушивали при 37°С в течение 30мин и фиксировали при комнатной температуре в фиксирующем растворе SA{2}}gal в течение 15 мин. Срезы трижды промывали PBS и инкубировали в течение ночи в растворе для окрашивания SA- -gal при 37°C. Затем окрашивали эозином в течение 1 мин и промывали водой в течение 2 мин. Данные окрашивания SA- -gal были проанализированы с использованием программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0.

Эксплантаты жировой ткани человека

Жировая ткань от трех человек была получена путем липосакции. Один из испытуемых был мужчиной, а два — женщинами. Средний возраст испытуемых составлял 57,0±7,6 лет (среднее значение±стандартное отклонение: диапазон, 50-65). Средний ИМТ составил 40,5 ± 5,1 кг/м² (среднее значение ± стандартное отклонение; диапазон, 36.7-46.2）. Комитет по этике Шанхайской онкологической больницы Мэнчао (№ 05, 2020 г., Комитет по медицинской этике Шанхайской онкологической больницы Мэнчао) одобрил экспериментальную схему. Информированное согласие было получено для всех добровольцев. Жировую ткань разрезали на небольшие кусочки диаметром около 2 мм. Пять кусочков ткани помещали в каждую лунку 96-луночного планшета и по 200 мкл либо преадипоцитов, либо кондиционированной среды из радиационно-индуцированных стареющих преадипоцитов с добавлением 10% сыворотки AB человека, 1% L-глютамина, 1% % пенициллина/стрептомицина, 1 % заменимых аминокислот MEM и 1 % пируватной кислоты натрия добавляли к совместной культуре на 24 часа. Затем среду заменяли свежей средой, содержащей 5×10 аутологичных NK-клеток (жизнеспособность клеток: 92,3-95,7% 6), и культивировали еще в течение 48 ч, после чего NK-клетки собирали для проточной цитометрии. Жировую ткань пять раз промывали PBS и добавляли ту же среду для дальнейшего культивирования на 48 ч; супернатант (100 мкл) использовали для многофакторной детекции. Преадипоциты или радиационно-индуцированные стареющие преадипоциты были получены из жировой ткани того же человека.

Эта статья взята из Cell Death and Disease (2022) 13:305.