Всестороннее профилирование составов секретома из эмбриональных и перинатальных стволовых клеток амниотической жидкости человека, часть 1

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Ранее мы сообщали, что стволовые клетки, полученные из амниотической жидкости c-KIT плюс гтаман, полученные из образцов, оставшихся после плановой пренатальной диагностики II триместра (fetal hAFS), обладают регенеративным паракринным потенциалом, способствующим выживанию, антифибротическим и пролиферативным эффектам. также могут быть выделены из образцов клинических отходов III триместра во время планового кесарева сечения (перинатальный чАФС), что предлагает более легкодоступную альтернативу по сравнению с фетальным чАФС. Тем не менее, мало что известно о паракринном профиле hAFS в перинатальном периоде. Здесь мы даем подробную характеристику общего секретома hAFS (т.е. совокупности растворимых паракринных факторов, высвобождаемых клетками в кондиционированной среде, hAFS-CM) и внеклеточных везикул ( hAFS-EVs) внутри него, из клеток плода Ⅱтриместра по сравнению с перинатальными клетками III триместра. Фетальные и перинатальные hAFS были охарактеризованы и подвергнуты гипоксическому прекондиционированию для повышения их паракринного потенциала. Составы hAFS-CM и hAFS-EV анализировали на содержание белка и хемокинов/цитокинов, а груз EV дополнительно исследовали с помощью секвенирования РНК. Фенотип фетального и перинатального hAFS, наряду с соответствующими составами секретома, перекрываются; тем не менее, фетальный hAFS показал незрелую активность окислительного фосфорилирования по сравнению с перинатальными. Профилирование их паракринного груза выявило некоторые различия в зависимости от срока гестации и гипоксического прекондиционирования. Оба источника клеток представляли собой составы, обогащенные нейротрофическими, иммуномодулирующими, антифибротическими и эндотелиально-стимулирующими факторами, а секретом незрелого плода hAFS характеризовался более выраженным проваскулогенным, регенеративным, проразрешающим и антивозрастным профилем. Профилирование малых РНК показало обогащение микроРНК как в эмбриональном, так и в перинатальном грузах hAFS-EV со стабильно экспрессируемым про-разрешающим ядром в качестве эталонной молекулярной сигнатуры. Здесь мы подтверждаем, что hAFS представляет собой привлекательный источник регенеративных паракринных факторов; Выбор фетальных или перинатальных составов секретома чАФС для будущей паракринной терапии следует оценивать с учетом конкретного клинического сценария.

Ключевые слова:амниотическая жидкость; стволовые клетки; паракринные эффекты; внеклеточные везикулы; среда с кондиционированием клеток; хемокин; цитокины; протеомика; секвенирование РНК; микроРНК

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

В последнее время регенеративная медицина стала новой областью, обеспечивающей функциональное восстановление поврежденной ткани с помощью нескольких стратегий. Поскольку подходы к тканевой инженерии значительно продвинулись в последние годы, исследования паракринных эффектов стволовых клеток одновременно все активизировались. Было широко показано, что терапевтический потенциал трансплантированных стволовых клеток в основном опосредован секретируемыми ими растворимыми факторами, которые могут управлять прорегенеративной микросредой в ткани хозяина, одновременно запуская активацию эндогенных механизмов функционального восстановления [1,2]. Таким образом, стволовые клетки, секретирующие все высвобождаемые клеткой паракринные трофические молекулы, а также мембраносвязанные внеклеточные везикулы, все чаще предлагались в качестве инновационного лекарственного препарата в многочисленных независимых доклинических исследованиях, направленных на сердечно-сосудистые, неврологические и/или воспалительные заболевания. болезнь. Соответственно, стволовые клетки можно рассматривать как биологические фабрики по использованию их терапевтического секретома, предлагая готовые к использованию и готовые регенеративные методы лечения. Применяя такую ​​клеточную, но бесклеточную стратегию, многие ограничивающие аспекты, связанные с канонической клеточной терапией, могут быть преодолены, при этом обеспечивая положительный эффект.что такое цистанхеС этой точки зрения, мезенхимальные стромальные клетки (МСК) были широко протестированы в качестве предполагаемых кандидатов в клетки. Действительно, MSC и стволовые клетки/клетки-предшественники были сконструированы и/или стимулированы с помощью различных стратегий прекондиционирования для повышения их регенеративной способности и секреторного потенциала [3,4] с явным интересом к биологической значимости их секретируемых внеклеточных везикул (EVs).

ВВ представляют собой наночастицы, ограниченные липидным бислоем и активно секретируемые всеми типами клеток. Электромобили включают в себя очень маленькие (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 нм); они действуют как критические биологические конвейеры межклеточной сигнализации, доставляя свой молекулярный груз от родительской клетки к клетке-респондеру/мишени [5,6]. Учитывая, что их специфический паракринный потенциал в оказании полезных эффектов сравним с их исходными клетками, EV стволовых клеток стали привлекательными терапевтическими вариантами в доклинических моделях заболеваний, таких как ишемия, воспаление или травма, как подробно рассмотрено в [{{3]. }}]. С трансляционной точки зрения, помимо модуляторного потенциала клеток, осуществимость изоляции и повышенное самообновление являются ключевыми аспектами идеального источника терапевтических EV и растворимых факторов. В таком сценарии фетальные и перинатальные МСК могут предложить интересный вариант, учитывая их пролиферативный потенциал и незрелый профиль развития с промежуточными характеристиками между эмбриональными и взрослыми соматическими предшественниками [10,11]. Фетальные МСК могут быть выделены из внеэмбриональных придатков во время беременности в виде остаточных образцов, полученных во время пренатального скрининга (например, ворсин хориона [12-14] и амниотической жидкости [15,16]), или полученных в качестве перинатальных предшественников при рождении. из клинических отходов (например, амниотических и плацентарных оболочек [17-21], компонентов пуповины [22-24] и околоплодных вод [25,26]).

Цистанхе может омолаживать

Примечательно, что стволовые клетки амниотической жидкости человека (hAFS) были отмечены как многообещающие терапевтические стратегии в регенеративной медицине. и было показано, что они широко мультипотентны in vitro и in vivo [16, 27, 28], вносят вклад в гемопоэтическую линию после внутриутробной трансплантации [29] и приживаются в поврежденных органах, оказывая иммуномодулирующее действие [26, 30] и активируя эндогенные репаративные ответы, подробно описанные в [31]. Наша команда и другие исследователи также продемонстрировали, что hAFS высвобождает секретом, сильно обогащенный биоактивными трофическими молекулами, способными воздействовать на различные репаративные механизмы. Сообщалось, что паракринные факторы hAFS обеспечивают стимулы для выживания с тушением воспаления [32], обеспечивают кардиозащиту от длительной ишемии [33,34] и кардиотоксичность [35] и стимулируют локальный ангиогенез с повторным входом в клеточный цикл кардиомиоцитов [35]. 34,36]. Поскольку было показано, что большинство этих эффектов воспроизводятся только при введении чАФС-ЭВ, независимые исследования были сосредоточены на изучении их регенеративного профиля в зависимости от различных патологических фонов, включая повреждения скелетных и сердечных мышц, заболевания почек, остеоартрит, остеопороз, некротизирующий энтероколит и нейродегенеративные заболевания. модели [34,37-44].

Несмотря на то, что доказательства могут поддерживать клинический перевод hAFS-EVs для будущей паракринной терапии, важно учитывать, что в большинстве этих исследований в основном изучался модуляторный потенциал фетального hAFS, полученный во время пренатального скрининга Ⅱ триместра. Действительно, полный профиль секретома от перинатальный аналог (т. е. после кесарева сечения в III триместре) еще подробно не изучен. Перинатальные чАФС в третьем триместре продемонстрировали отличительные иммунорегуляторные свойства по сравнению с таковыми во втором и втором триместре [26], сохраняя при этом соответствующий регенеративный потенциал эндотелия [25].сколько цистанхе приниматьСледует отметить, что недавний отчет о гетерогенной морфологии hAFS плода [45] предоставил новое понимание их стволовости и профиля экспрессии генов.биофлавоноидыЭто в целом пролило новый свет на регенеративную ценность различных клеточных фракций hAFS [46]. Следовательно, всесторонняя характеристика различных субпопуляций hAFS привлекает все большее внимание. Ранее мы сообщали, что 24-часовая гипоксическая и бессывороточная стимуляция представляет собой эффективную стратегию для повышения паракринного потенциала hAFS плода Ⅱ триместра [34,35,37]. Поскольку мало что известно о составе секретома hAFS III триместра, здесь мы приводим всестороннее сравнение hAFS II и III триместра и их фракций секретома (включая hats-EV), чтобы учесть влияние стадии беременности и гипоксических клеток. прекондиционирование характеристик клеток и секретома.

2. Результаты

2.1. Перинатальный hAFS имеет близкое фенотипическое соответствие фенотипу плода.

Не было выявлено статистически значимой разницы в возрасте донора между образцами амниотической жидкости во II триместре плода и в перинатальном III триместре. Фетальный c-KIT* hAFS (f-hAFS из образцов амниотической жидкости II триместра) и перинатальный c-KIT* hAFS (p-hAFS из клинических отходов амниотической жидкости III триместра) подтвердили сходные черты с фибробластоподобной и овально-округлой морфологией (рис. 1А) и мезенхимальный стромальный фенотип (данные не показаны), как сообщалось ранее [16,25]. Как f-hAFS, так и p-hAFS, культивированные in vitro до пассажа 5, показали незначительные уровни старения из-за активации связанной со старением - -галактозидазы (SA- -Gal) примерно в 4 процентах клеток (рис. 1B). . Как f-hAFS, так и p-hAFS демонстрируют высокий уровень коэкспрессии мезенхимальных маркеров CD107a и CD146, которые, как недавно сообщалось, определяют высокосекреторный фенотип [47]. Клетки CD107at CD146* представляли большую часть популяции f-hAFS (приблизительно 64 процента *p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Рисунок 1. Фенотипическая оценка плода и перинатального периода. (A) Репрезентативные изображения hAFS плода (f-hAFS, левая панель) и перинатального hAFS (p-hAFS, правая панель), культивируемых in vitro в стандартных условиях; масштабная линейка: 200 мкм. (B) Анализ маркера старения бета-галактозидазы (SA- -Gal, выделен синим цветом) с помощью цитохимического окрашивания f-hAFS и p-hAFS после 5 пассажей в культуре; репрезентативные изображения представлены на левой панели, линейка масштаба: 200 мкм. Соответствующий процент -Gal-положительных клеток/поле представлен на графике на правой панели (f-hAFS: 4,12 ± 0,58 процента и p-hAFS: 3,88 ± 2,10 процента; p=0.1424,n{ {24}} эксперименты). (C) Иммунофенотип hAFS, экспрессирующий мезенхимальные маркеры CD146 и CD107a. Репрезентативные графики проточной цитометрии f-hAFS и p-hAFS (левая панель) и соответствующие значения относятся к двойным положительным клеткам CD107a плюс CD146 плюс; CD107a плюс CD146* f-hAFS: 63,68 ± 5,82 процента, *p=0,016 по сравнению с остальными g36,32 ± 5,82 процента f-hAFS (другое); CD107 при CD146 плюс p-hAFS: 52,07 ± 6,76 процента с остальными47. 93 ± 56,76 процента p-hAFS (другое); CD107a плюс CD146 плюс f-hAFS по сравнению с CD107a плюс CD146 плюс p-hAFS p=0.2403,n=4 эксперименты. Другое: общее количество оставшихся CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS и CD107at CD146-hAFS. Все значения выражены как среднее значение ± стандартная ошибка независимых экспериментов. SA- -Gal: Ассоциированная со старением- -галактозидаза.

2.2. Фетальный hAFS демонстрирует метаболизм, отличный от перинатального hAFS

Чтобы оценить, может ли стадия беременности влиять на митохондриальный метаболизм, f-hAFS и p-hAFS анализировали в стандартных условиях культивирования in vitro с помощью биохимических анализов. Оценка аэробного метаболизма показала, что скорость потребления кислорода (OCR) и синтез АТФ были ниже у f-hAFS по сравнению с p-hAFS, как при стимуляции пируватом плюс малатом (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Гипоксическое прекондиционирование не влияет на плод и перинатальное, имеет жизнеспособность и поддерживает их секреторную активность.

Чтобы определить рецептуры секретома hAFS, клетки культивировали в бессывороточных условиях, чтобы избежать любого загрязнения FBS. Ранее мы показали, что 24-часовые условия культивирования без сыворотки (SF) и 1% гипоксии O2 существенно не изменяют жизнеспособность hAFS плода Ⅱтриместра (f-hope), в то время как они поддерживают высвобождение регенеративных паракринных факторов в среде, кондиционированной клетками. (hAFS-CM) и во внеклеточных везикулах (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Здесь, в дополнение к профилированию фракций секретома p-hAFS в первый раз, мы оценили, продемонстрировали ли p-подобное поведение в том же режиме предварительного кондиционирования, используя условия нормоксической культуры в качестве контроля. Жизнеспособность f-hAFS и p-hAFS анализировали через 24 ч в следующих условиях: нормоксическое состояние (20 процентов O2) в среде полного контроля (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo и Ctrl p-hAFSnormo), нормоксическое состояние в среде SF. (SF f-hAFSnormo и SF p-hAFSnormo), гипоксическое (1 процент O2) состояние в полной контрольной среде (Ctrlf-имеет гипо и Ctrl p-hAFSnypo) и гипоксическое состояние в среде SF (SF f-имеет гипо и SF p - имеет гипо, рисунок 3А). Мы подтвердили, что жизнеспособность f-has не изменилась как в условиях Ctrl, так и в условиях SF, а также при гипоксической стимуляции, при этом более 80 процентов (почти 88 процентов) от общего числа клеток не пострадали. Ранние и поздние апоптотические клетки варьировались от ок. от 13 до 18 процентов в условиях SF без какой-либо статистически значимой значимости. Точно так же перинатальная жизнеспособность находилась в диапазоне 80-92 процентов, а ранние и поздние апоптотические клетки составляли до 18 процентов в условиях SF. p-hAFS незначительно влиял только в условиях комбинированной гипоксии и SF; действительно, в то время как предварительное кондиционирование не влияло на выживаемость клеток, когда p-hAFS культивировали в полной среде, соответствующие условия SF показали увеличение прибл. 4-кратно (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Рисунок 2. Метаболическая характеристика фетального и перинатального AFS. (A) Скорость потребления кислорода (OCR), синтез АТФ с помощью F1-F.ATP-синтазы и соотношение P/O в f-have и-have в присутствии пирувата плюс малата (P/M) или сукцината (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>цистанчеСравнение процентного ингибирования OCR и синтеза АТФ в f- и hAFS из-за указанных выше ингибиторов представлено на нижней панели B. Для экспериментов OCR: hAFS плюс этомоксир**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Затем мы оценили выход фракций секретома, полученных из f-hAFS, по сравнению с p-hAFS на основе обогащения белком. Общий секретом, как и совокупность секретируемых клеткой паракринных факторов, здесь представлен hAFS-CM. Концентрация белка f-hAFS-CM и p-hAFS-CM в среде SF после предварительного кондиционирования гипоксических клеток по сравнению с контрольным нормоксическим состоянием в качестве исходного уровня (а именно, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo и p -hAFS-CMHypo,) оценивали с помощью анализа BCA и измеряли в пересчете на 10 клеток.цистанхПолученные результаты позволяют предположить, что f-has-CM и p-hAFS-CM продемонстрировали одинаковую положительную тенденцию в обогащении белком после гипоксического праймирования (f-hAFS-CMnypo'166.10±22,13 мкг/л0 градусные клетки; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 мкг/10 градусных клеток） по сравнению с их нормоксическими аналогами (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 мкг/10 градусных клеток; p- hAFS-CMhypoi 91,12 ± 24,39 мкг/10 градусов клеток). ЭВ показали сопоставимый выход при получении из f-hAFS или p-hAFS. Что касается составов hAFS-CM, положительная тенденция в увеличении содержания белка на f-hAFS-EV и p-hAFS. ЭВ была оценена после гипоксической стимуляции в течение соответствующее нормоксическое состояние (f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 мкг/10 градусных клеток и p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 мкг/10 градусных клеток; f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 мкг/10 градусных клеток и p -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 мкг/10 градусных клеток, рис. 3C).

2.4. ЭВ фетального и перинатального высвобождения hAFS с аналогичной морфологией и распределением по размерам

Морфологический анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) повысил пролиферацию высокой секреции EV как f-hAFS, так и p-hAFS (рис. 4). Мы дополнительно исследовали размер и площадь f-hAFS-EV и p-hAFS-EV (рис. 4B) после гипоксического предварительного кондиционирования по сравнению с нормоксическим исходным уровнем. Фетальные и перинатальные высвобождают везикулы гетерогенного размера, в диапазоне 40-250 нм, следовательно, включая как экзосомы/маленькие везикулы, так и микровезикулы/делящиеся везикулы. Средний размер ЭВ/поле в разных группах был сопоставим, фетальные hAFS-EV измерялись 90-100 нм (f-hAFS-EVsnormo:104,00 ±3,00 нм;f -у-ЭВШвпо:97,10±10,10 нм) и перинатальных измеренных 70-114 нм (р-hAFS-EVSнормо:94,60±19,53 нм; p-hAFS-EVShypo:76,43±4,86 нм, рис. 4В, левая панель). Что касается выхода, то hAFS, стимулированные в условиях гипоксии, показали положительную тенденцию увеличения количества малых ЭВ, хотя это увеличение не было статистически значимым. f-hAFS-EVStypo измерял 40-70 нм, что было почти в два раза больше, чем у их нормоксического аналога. Perinatal-has-EVSHypo с измерениями 40-70 нм, 70-100 нм и 100-130 нм почти в три раза превышали количество, полученное в нормоксической культуре (рис. 4B).

Анализ отслеживания наночастиц (NTA) показал повышенное количество частиц как в препаратах f-hAFS-EV, так и в препаратах p-hAFS-EV, и подтвердил увеличение количества EV в гипоксических образцах, что также наблюдалось в предыдущих анализах (f-hAFS-EV). EVsнормо:182±0.10'частиц/10 градусных ячеек f-у-EVшипо: 3,30±0,22×10 градусных частиц/10 градусных ячеек p-hAFS-EVsnormo: 2,43±0,80×10 градусных частиц/10 градусных клеток; p-hAFS-EVshypo: 3,05±0,62×10 градусных частиц/10 градусных клеток, фигура 4C).

Рисунок 4. Морфологическая характеристика фетальных и перинатальных ВВ. (A) Репрезентативные изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) f-hAFS и p-hAFS (верхняя и нижняя левая панель, соответственно, с черными стрелками, указывающими на внутрицитоплазматические мультивезикулярные тельца с небольшими EVs/экзосомами внутри них) и f -hAFS-EV и p-hAFS-EV (верхняя и нижняя правая панель соответственно), высвобождаемые в бессывороточных условиях и при нормоксическом и гипоксическом предварительном кондиционировании (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; и f-hAFS-EVshypo соответственно), масштабные линейки: 200 нм. (B) Левая панель: ПЭМ-анализ распределения размеров hAFS-EV; правая панель: рассмотрено распределение числа f-hAFS-EV и p-hAFS-EV в интервалах размеров поля от 40 нм до 250 нм; значения выражены как среднее ± стандартная ошибка n =3 независимых экспериментов. (C) Анализ отслеживания наночастиц для определения размера и распределения hAFS. Левая панель: репрезентативное изображение графического вывода; правая панель: концентрация hAFS-EVs, измеренная как 10-градусные частицы на 10-градусные секретирующие клетки; нм: нанометр; мл: миллилитр.

2.5. Протеомная характеристика фетальной и перинатальной hAFS подчеркивает различия в составе их секретома в зависимости от гестационного возраста и гипоксического прекондиционирования

Протеомную характеристику составов секретома как f-hAFS, так и p-hAFS проводили с помощью платформы без меток дробовика, основанной на сочетании наножидкостной хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения (nLC-HRMS). Сорок восемь протеомных профилей были получены путем дублирующего анализа трех биологических повторов hAFS-CM и have-EVs из f-hAFS и p-hAFS, подвергшихся предварительному кондиционированию гипоксических клеток по сравнению с нормоксическими условиями в качестве контроля. В общей сложности было идентифицировано 4179 различных белковых групп, по крайней мере, с одним уникальным пептидом и с молекулярной массой от 2 до 3900 кДа и изоэлектрическими точками от 3,6 до 13. Наблюдалась более высокая средняя экспрессия белка в hAFS-EV по сравнению с hAFS-CM. . Выравнивание всех полученных списков белков проводили на основе идентифицированных белков. Для каждого экспериментального условия был создан уникальный список, нормализующий и усредняющий [50] значения соответствия спектра пептидов (PSM), приписываемые белкам, которые представляют собой количество масс-спектров, присвоенных каждому, и косвенно отражают их распространенность в образцах. Полный список белков, идентифицированных в составах hAFS-CM и have-EV, представлен в таблице S1.

Применение линейного дискриминантного анализа (LDA[51]) в этом мастер-списке позволило выделить статистически значимые белки (Fratio больше или равно 4,5 и** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 в составах hAFS-CM и have-EV рассматриваются отдельно. В то время как около 69,5 процента и 69,9 процента белков были общими для условий hAFS-EV и hAFS-CM соответственно, оставшееся содержание оказалось эксклюзивным в разных пропорциях, в диапазоне от 3,7 процента до 13,4 процента, среди составов.

Чтобы количественно изучить протеомные изменения, был проведен дифференциальный анализ без меток с использованием самодельного программного обеспечения MAProMa и применения двух алгоритмов, DAve (дифференциальное среднее) и DCI (индекс дифференциальной достоверности, представляющий соотношение и достоверность дифференциального выражения, соответственно), на PSM каждого отдельного белка между двумя сравниваемыми терминами. Использование строгих фильтров для DAve и DCI для максимальной достоверности идентификации и рассмотрения белков с вариацией, превышающей кратность изменения 1,5, попарное сравнение f-hAFS-CM с p-hAFS-CM и f-hAFS-EVs с p-hAFS-EV были сделаны в соответствии со стадией беременности клеток. В общей сложности 58 и 109 белков были обнаружены дифференциально экспрессированными в вышеуказанных компартментах has-CM и have-EV, соответственно (рис. S1B, C для некоторых деталей и таблицы S2-S3 в расширенной форме). Среди них 30 белков активировались в f-hAFS-CM, а 28 — в p-hAFS-CM (рис. S1B); аналогичным образом, 44 различных белка активировались в f-have-EV, а 65 - в p-hAFS-EV (рис. S1C). Примечательно, что белки, экспрессия которых в f-have привела к положительной регуляции, следует считать подавленной в p-has, и наоборот.

сообщаются значения; см. Таблицу S2 для полного списка и подробных параметров белков, о которых сообщают. (C) Анализ обогащения биологических процессов белками, идентифицированными с частотой не менее 2 в hAFS-CM плода (левая панель) и перинатальном HAFS-CM (правая панель) по данным клеточного гипоксического прекондиционирования. На основе инструмента FunRich термины генной онтологии показаны в гистограммах, показывающих процент генов, обогащенных для каждой категории (розовые столбцы для «имеют-CMnormo», фиолетовые столбцы для f-hAFS-CMhypor, светло-синие столбцы для p-hAFS-CMnormo, и синие шарики для p-hAFS-CMhypo).купить цистанхеТолько термины генной онтологии с Бонферрони, исправленные с помощью * p<0.05 are="">

Эта статья взята из Int. Дж. Мол. науч. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms