Защитный эффект эхинакозида при диабетической нефропатии

Контактное лицо: Одри Хуaudrey.hu@wecistanche.com

Защитное действие эхинакозида на функцию почек, повреждение почечной ткани и мезангиальных клеток у крыс с диабетической нефропатией

ХЭ Цинь, ЛЮ Фань, ВАН Хунли, ЛИ Цзяньпин, ДУАН Июнь

Абстрактный:

Цель Изучить защитный эффектэхинакозид(ECH) на почечную дисфункцию, гистопатологию и повреждение мезангиальных клеток вдиабетикнефропатия(ДН) крысы и ее механизм. Методы Шестьдесят крыс SD были случайным образом разделены на контрольную группу, модельную группу, ECH (эхинакозид) группа (высокие, средние и низкие дозы ЭХГ (эхинакозид), 100, 50, 20 мг·кг'·д') и группу лозартана калия (лозартан калия, 16 мг·кг'·д'), по 10 крыс в каждой группе. Группа моделей, ЭЧ (эхинакозид) группа и группа лозартана калия получали диету с высоким содержанием жиров и сахара и внутрибрюшинно вводили стрептозотоцин (40 мг·кг") для создания моделей крыс с DN. Через 2 недели лечения вес тела, потребление воды в течение 24 часов Регистрировали содержание глюкозы в крови натощак, креатинина сыворотки, азота мочевины, микропротеина мочи, гиалуроновой кислоты (ГК), ингибитора тканевых металлопротеиназ-1(TIMP-1) и ламинина. (LN). Окрашивание HE и окрашивание TUNEL проводили для наблюдения за патологическими изменениями в ткани почек. ОТ-ПЦР проводили для выявления экспрессии B-клеточной лимфомы (Bcl-2), Bcl2-ассоциированной Белок X (Bax), мРНК каспазы -3. Для определения уровней экспрессии молекулы адгезии сосудистых клеток -1 (VCAM-1), трансформирующего фактора роста (TGF-) был проведен вестер-блоттинг. Актин гладких мышц (-SMA).Результаты По сравнению с контрольной группой масса тела модельной группы была значительно снижена (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">эхинакозид) группа, высокодозированная ЭХГ (эхинакозид) группа и группа лозартана калия (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">эхинакозид) может защитить почечную ткань от повреждения и улучшить функцию почек у крыс с DN за счет ингибирования экспрессии белка TGF- и VCAM-1 и ингибирования почечного интерстициального фиброза и апоптоза почечных клеток.

Ключевые слова:цистанховые травы;Эхинакозид; диабетикнефропатия; почечный интерстициальный фиброз; апоптоз; крысы

Цистанхе эхинакозид лечит диабетическую нефропатию

Введение

диабетик нефропатия(Диабетическая нефропатия, ДН) является частымдиабетикмикрососудистые осложнения, которые могут не только вызывать поражение почек, но и поражать другие органы. Клинико-патологической особенностью почечного тубулоинтерстициального фиброза является сложный патогенездиабетикнефропатия. Предыдущие исследования [P2-5 считают, что заболевание в основном связано с гипергликемией вдиабетикпациентов, что вызывает изменения почечной гемодинамики и аномальный метаболизм. Клиническими проявлениями являются в основном протеинурия и снижение скорости клубочковой фильтрации. В настоящий момент,диабетикнефропатияПациентам все еще не хватает эффективных клинических методов лечения, и поиск новых эффективных препаратов является ключом к лечениюдиабетикнефропатия.

эхинакозид(ECH) является одним из экстрактов Cistanche Tubulosa. Он оказывает укрепляющее действие на почки и укрепляет Ян». Современные фармакологические исследования показали, что эхинакозид обладает антиоксидантными, антиапоптотическими, противовоспалительными свойствами и улучшает кровоток. Микроциркуляция и другие фармакологические эффекты также могут регулировать метаболизм глюкозы в организме и улучшать уровень глюкозы. В последние годы исследования показали, что эхинакозид может ингибировать сигнальный путь трансформационного фактора роста (трансформирующий фактор роста, TGF-) и ингибироватьдиабетикнефропатия. Интерстициальный фиброз почек крыс защищает ткань почек крыс. Однако в литературе имеется мало сообщений о лечениидиабетикнефропатиясэхинакозиди его специфический механизм защитыдиабетикнефропатияу крыс не ясно. Поэтому в этом исследовании дополнительно изучалось влияниеэхинакозидна почечный фиброз и апоптоз почечных клеток вдиабетикнефропатиякрыс и его возможный механизм призван обеспечить теоретическую основу для клинического примененияэхинакозид.

Польза цистанхе: лечение заболеваний почек и улучшение функции почек

1 Материал и методы

1.1 Животные:

60 крыс SD, самцы, степень SPF, возраст 8 недель, масса тела 240–280 г, предоставлено Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на животных: SCXK (Пекин) 2015-0001, качество животных имеет квалификацию Номер сертификата: 11400700106210, выращивается в лаборатории центра животных больницы, поддерживает постоянную температуру в помещении на уровне 25 градусов, имитирует день и ночь, меняет условия освещения каждые 12 часов, и животные могут свободно есть и пить .

1.2 Препараты и реагенты:

Эхинакозид, Китайский институт контроля пищевых продуктов и лекарственных средств, номер партии: 111670-201706; Лозартан калия, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., национальный медицинский стандарт: H20030654; стрептозотоцин, American Sigma Company, номер партии: 040103; Набор для определения содержания белка в моче, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., номер партии: 20170612; набор для обнаружения TUNEL, Amicage Technology Co., Ltd., номер партии: 20180406; набор для выделения РНК, набор для обратной транскрипции, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., номер партии: 20180705, 20180904; Наборы для обнаружения гиалуроновой кислоты (ГК) в сыворотке, ингибитора тканевой металлопротеиназы-1 (TIMP-1) и ламинина (ламинина, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., номера партий 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Аппарат

автоматический биохимический анализатор типа 7600, японская компания HITACHI; портативный глюкометр, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; оптический микроскоп B X60, японская фирма OLYMPUS; Радиоиммуноанализатор SN-695B, компания Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Группировка, тиражирование модели и метод администрирования

После одной недели предварительного кормления 60 крыс были случайным образом разделены на контрольную группу, модельную группу, экспериментальную группу.эхинакозидгруппы с высокими, средними и низкими дозами и группу с лозартаном калия, по 10 крыс в каждой группе. Группа моделей,эхинакозидгруппа и группа лозартана калия получали диету с высоким содержанием жиров и сахара в сочетании с низкими дозами стрептозотоцина, чтобы вызватьдиабетикнефропатияу крыс. Перед повторением модели крысы голодали с водой в течение 12 часов. Крыс контрольной группы кормили обычным кормом, а других групп кормили кормом с высоким содержанием жира и сахара. Через 4 недели непрерывного кормления крысам контрольной группы сделали однократную внутрибрюшинную инъекцию равного объема цитратного буфера, а остальным группам сделали однократную внутрибрюшинную инъекцию стрептозотоцинового бактериоцина (40 мг·кг) для повторения эксперимента. крысиная модельдиабетикнефропатия. Через 72 часа после инъекции крысам стрептозотоцина уровень глюкозы в крови был больше или равен 16,7 ммоль·л, а скорость экскреции белка с мочой через 24 часа после 3 недель была выше, чем у контрольной группы. Количественный белок мочи за 24 часа превышал 50% до репликации модели, что указывает на то, что модель была успешно воспроизведена. Через четыре недели после инъекции стрептозотоцина группы с низкой, средней и высокой дозойэхинакозиддавали 20 мг·кг', 50 мг·кг и 100 мг·кг'эхинакозид(по 5мл·кг на крыс). кг'' тела растворяют в физиологическом растворе с температурой 37°), крысам в группе лозартана калия внутрижелудочно вводили 16 мг лозартана калия на кг', а в экспериментальной группе и контрольной группе внутрижелудочно вводили равные объемы физиологического раствора один раз в день. Гаваж продолжали в течение 2 недель.

1.5 Сбор образцов

После последнего введения крысы голодали без еды и воды. Регистрировали 24-часовое потребление крысами воды и собирали 24-часовую мочу. Ранним утром второго дня крыс взвешивали. После сбора мочи, внутрибрюшинного введения 2-процентного раствора пентобарбитала натрия в количестве 2 мл·кг~ для наркоза, выделения крови из брюшной аорты крысы, центрифугирования ({4}} об·мин²', 15 мин), забирают сыворотку и помещают в холодильник-Временно хранить при температуре 20 градусов; ткань почки крысы отделяют и делят на две части, одну часть фиксируют в 4-процентном параформальдегиде, другую часть готовят в виде 10-процентного гомогената и помещают в -80 градусный холодильник для последующего использования.

1.6 Определение метаболизма глюкозы и липидов у крыс

У каждой группы крыс брали сыворотку крови, измеряли уровень глюкозы в крови натощак с помощью глюкометра, определяли уровни триглицеридов, холестерина и липопротеинов низкой плотности с помощью автоматического биохимического анализатора.

1.7 24 часов белок мочи, функция почек и показатели, связанные с почечным фиброзом

У крыс в каждой группе собирали 24-часовую мочу и определяли содержание микропротеинов в 24-часовой моче с помощью радиоиммуноанализа. Операция проведена в строгом соответствии с инструкцией. Собирали сыворотку каждой группы крыс и использовали автоматический биохимический анализатор для определения уровней креатинина крови и азота мочевины, которые связаны с функцией почек, уровень TIMP-1 в сыворотке определяли с помощью ELISA, а уровни HA и LN определяли радиоиммуноанализом. Операция проведена в строгом соответствии с инструкцией.

1.8 Окрашивание HE для наблюдения за патологическими изменениями в почечной ткани и окрашивание TNUEL для наблюдения за апоптозом клеток почечной ткани

Фиксированные ткани почек каждой группы брали, обычно заливали в парафин и делали срезы. Один срез используется для окрашивания HE для наблюдения за морфологическими изменениями почечных канальцев, клубочков и почечного интерстиция под световым микроскопом; другой раздел используется для окрашивания TUNEL, работая в соответствии с инструкциями набора и наблюдая количество и положительность клеток почечной ткани под микроскопом. Количество клеток рассчитывается как отношение количества положительных клеток к количеству почечной ткани. клеток, что является скоростью апоптоза.

1.9 Метод ОТ-ПЦР для обнаружения экспрессии генов, связанных с апоптозом, в почечных тканях

Возьмите гомогенат ткани почки крысы, извлеките общую РНК методом тризола, определите концентрацию с помощью ультрафиолетового спектрофотометра и синтезируйте кДНК с помощью набора для обратной транскрипции.

1.10 Метод вестерн-блоттинга для определения экспрессии в почечной ткани VCAM-1, белков TGF- и -SMA.

Возьмите около 50 мг гомогената ткани почки крысы, растворите его в лизате клеток, содержащем ингибиторы протеазы, и извлеките общий белок из лизата клеток, используя метод ВСА для количественного определения белка. Образец общего белка, экстрагированный 50 мкмоль·л, переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и герметизировали 5-процентным обезжиренным молоком, после чего добавляли первичное антитело (1∶1000) и -актиновый белок соответственно. Антитело (1: 300), инкубируйте в течение ночи при 4 градусах. Наконец, добавьте вторичное антитело и инкубируйте в течение 2 часов при 37 градусах, контролируя электрохемилюминесценцию. Используйте программное обеспечение для анализа изображений Photoshop, чтобы проанализировать значение серого для белковых полос.

1.11 Методы статистической обработки

Для анализа полученных данных использовалось программное обеспечение SPSS 17.0, а данные измерений, которые удовлетворяют нормальному распределению, выражаются как среднее ± стандартное отклонение ((x±s), а однофакторный дисперсионный анализ используется для сравните различия между группами.Попарное сравнение между группами использует критерий СНК-С q, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 результатов

2.1 Влияние эхинакозида на массу тела, питьевую воду и диурез крыс с диабетической нефропатией показано в таблице 1.

Таблица 1 Влияние ЭХГ на массу тела, потребление воды и объем мочи у крыс DN (x ± s, n=10)

По сравнению с контрольной группой масса тела крыс из экспериментальной группы была значительно снижена, а количество выпитой воды и диуреза в 24-часах значительно увеличилось. Разница была статистически значимой (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">эхинакозидМасса тела крыс в группе лозартана калия значительно увеличилась, а количество питья в 24-часах и диурез значительно уменьшились, и разница была статистически значимой (P<>

2.2 Влияние эхинакозида на метаболизм глюкозы и липидов у крыс с диабетической нефропатией показано в таблице 2.

Таблица 2 Влияние ЭХГ на метаболизм глюкозы и липидов у крыс с DN

Примечание:По сравнению с контрольной группой, 'P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

По сравнению с контрольной группой уровень глюкозы в крови натощак у крыс модельной группы был значительно повышен, и разница была статистически значимой (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). По сравнению с модельной группой уровень глюкозы в крови натощак у крыс в группах со средней и высокой дозойэхинакозиди группа лозартана калия была значительно снижена, и разница была статистически значимой (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Влияние эхинакозида на 24-часовой белок мочи и функцию почек у крыс с диабетической нефропатией показано в таблице 3.

По сравнению с контрольной группой уровни микроальбумина мочи, азота мочевины и креатинина в модельной группе были значительно повышены, и различия были статистически значимыми (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">эхинакозидгруппы Уровни микроальбумина мочи, азота мочевины и креатинина крыс в группе и лозартана калия были значительно снижены, и различия были статистически значимыми (P<>

Таблица 3 Влияние эхинакозида на белок мочи в течение 24 часов и функцию почек у крыс с диабетической нефропатией (x±s, n=10)

2.4 Влияние эхинакозида на почечный фиброз у крыс с диабетической нефропатией показано в таблице 4.

По сравнению с контрольной группой сывороточные уровни HA, TIMP-1 и LN в модельной группе были значительно повышены, и различия были статистически значимыми (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Таблица 4 Влияние ЭХГ на почечный фиброз у крыс с DN

2.5 Окрашивание HE для наблюдения за патологическими изменениями ткани почек у крыс с диабетической нефропатией (см. рисунок 1).

Окрашивание ГЭ крыс контрольной группы показало, что структура клеток почечной ткани была интактной, явных патологических изменений не наблюдалось. Окрашивание крыс ГЭ в модельной группе и в группе с низкими дозамиэхинакозидгруппа показала: клубочки набухли и увеличились в размерах, эпителиальные клетки почечных канальцев набухли или отпали, почечный интерстиций сопровождался воспалительной клеточной инфильтрацией, а также были видны некоторая мезангиальная гиперплазия и интерстициальная пролиферация. Качественный фиброз.Эхинакозидгруппы средних и высоких доз и группы лозартана калия. Окрашивание показало, что патологические изменения ткани почки были значительно уменьшены, сопровождались небольшим количеством воспалительно-клеточной инфильтрации, а степень мезангиальной гиперплазии и интерстициального фиброза также была меньше, чем у модельной группы.

Рисунок 1 Патологические изменения тканей почек крыс каждой группы

2.6 Влияние эхинакозида на апоптоз почечной ткани у крыс с диабетической нефропатией показано на рисунке 2.

Окрашивание TUNEL показало, что по сравнению с контрольной группой скорость апоптоза крыс в модельной группе была значительно увеличена, и разница была статистически значимой (P<0,05); по="" сравнению="" с="" модельной="" группой="" средние="" и="" высокие="">эхинакозиди Corsa. Скорость апоптоза крыс в группе калия была значительно снижена, и разница была статистически значимой (P<>

Рисунок 2. Апоптоз клеток почечной ткани у DN-крыс.

2.7 Влияние эхинакозида на экспрессию генов, связанных с апоптозом, в почечных тканях крыс с диабетической нефропатией показано в таблице 6.

Результаты ОТ-ПЦР показали, что по сравнению с контрольной группой экспрессия мРНК Bax и каспазы-3 в модельной группе была значительно повышена, а экспрессия мРНК Bcl-2 была значительно снижена. , и разница была статистически значимой (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">эхинакозидгруппах и группе лозартана калия, а экспрессия мРНК Bcl-2 была значительно повышена, и различия были статистически значимыми (P<>

Таблица 6 Влияние ЭХГ на экспрессию гена, связанного с апоптозом, в почечной ткани DN-крыс

2.8 Эффектыэхинакозидна экспрессию белков VCAM-1, TGF- и -SMA вдиабетикнефропатиякрысы показаны на рисунке 3 и в таблице 7. По сравнению с контрольной группой экспрессия белка VCAM-1, TGF- и -SMA в модельной группе была значительно повышена, и разница была статистически значимой (P <0.05); экспрессия="" белков="" vcam-1,="" tgf-="" и="" -sma="" у="" крыс="" в="" дозовой="" группе="" и="" группе="" лозартана="" калия="" была="" значительно="" снижена,="" и="" различия="" были="" статистически="" значимыми=""><>

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ЧАСТЬ Ⅱ