Перекрестно-реактивные, естественные IgG, распознающие L. Major, способствуют интернализации паразита дендритными клетками и способствуют защитному иммунитету

Абстрактный

Ключевые сообщения

• Используя различных генетически модифицированных мышей, мы обнаружили, что эти антитела могут быть IgG, а не только IgM.

Ключевые слова

Leishmania major · Дендритные клетки · B-клетки ·Natural IgG

Введение

Инфекции Leishmania spp. представляют собой серьезное бремя в эндемичных странах. Проявления заболевания варьируют от самокупирующегося кожного лейшманиоза до диссеминированного, рецидивирующего, кожно-слизистого и висцерального заболевания. Без лечения висцеральный лейшманиоз представляет серьезную угрозу для жизни хозяина. Вакцины пока не существует. Исцеление и на всю жизньиммунитетпротив этого важного внутриклеточного патогена зависит от развития IFN-продуцирующих клеток Th1/Tc1, тогда как персистенция паразита и прогрессирование заболевания связаны с доминированием клеток Th2, регуляторными Т-клетками и/или ответами Th17. Высвобождение IFN приводит к продукции NO, которая уничтожает паразитов.Защитный иммунитетиндуцируется инфицированными дендритными клетками (ДК). После инокуляции Leishmania major в кожу москитом жизненные формы промастиготного паразита попадают в организм макрофагов, находящихся в коже (MΦ) и нейтрофилов. Внутри MΦ паразиты трансформируются в нежгутиковые формы жизни амастигот и размножаются. Позже выпущенные амастиготы поглощаются другими клетками-хозяевами, такими как DC. Инфицированные DC обрабатывают антигены паразита и мигрируют в дренирующие лимфатические узлы и первичные Т-клетки. Высвобождение IL-12, а также других цитокинов из инфицированных DC, направляет образование Th1/Tc1 паразитоспецифических Т-клеток.

В то время как MΦ использует рецептор комплемента (CR)3 для захвата паразитами, в DC Fc RI/III отвечает запаразитинтернализация. Интересно, что на ранних стадиях связанное с CR 3- поглощение паразитами приводит к подавлению инфицированных MΦ, тогда как при установленных инфекциях опосредованное Fc R поглощение амастигот MΦ индуцирует выработку противовоспалительных IL-10, способствующих развитию Th2/Treg. и устойчивость паразитов. Опосредованное Fc R поглощение паразита DC, напротив, индуцирует активацию клеток, примирование CD4 Т-клеток, а также перекрестную презентацию антигена. Следовательно, опосредованное антителами поглощение паразита DC важно для развития защиты от паразита. Таким образом, продукция IgG против Leishmania является предпосылкой для эффективного (перекрестного) праймирования специфичных для Leishmania клеток Th1/Tc1. Соответственно, в отсутствие В-клеток развитие заболевания было более тяжелым с большими объемами поражения, более высокой паразитарной нагрузкой, отсроченным примированием Т-клеток и сниженной продукцией IFNΓ. Ранее мы показали, что лейшманиоз-специфические IgG присутствовали в сыворотке во время накопления ДК в поражениях.

Остается открытым вопрос, как развивается первоначальный В-клеточный ответ на самого паразита в отсутствие праймирования В-клеток инфицированными ДК. Так называемые естественные антитела, распознающие Leishmania spp. может способствовать раннемуинтернализация паразитапо ДК. Кроме того, поскольку мембраны паразитов содержат фосфатидилсерин, аналогичный апоптотическим тельцам,перекрестно-реактивныйантитела могут играть роль. В настоящем исследовании мы оценили, способствуют ли антитела к фосфолипидам, образующиеся, например, во время чрезмерной гибели клеток, или естественные IgG, распознающие Leishmania, присутствующие у неиммунных животных, в захвате ДК паразитами для стимулирования праймирования В-клеток и Т-клеток. Мы обнаружили, что антифосфолипидные антитела из мышиной или человеческой сыворотки, а также «естественный IgG» в нормальной мышиной сыворотке (NMS) связываются с паразитами Leishmania, чего достаточно для стимулированияпаразитинтернализацияDC и способствует лучшему исходу заболевания in vivo.

Материал и методы

Животные

Мышей C57BL/6 в возрасте от шести до восьми недель приобретали у Janvier. Мыши µMT с дефицитом В-клеток были щедро предоставлены Hansjörg Schild, Институт иммунологии, Университетский медицинский центр Майнца. Мыши IgGi и IgMi (обе на фоне C57BL/6) были описаны ранее. Все животные содержались в специальных свободных от патогенов (SPF) условиях в Центре трансляционных исследований животных (TARC) Университета Йоханнеса Гутенберга, Майнц. Все эксперименты проводились с утвержденной лицензией Комитета по уходу и использованию животных региона Рейнланд-Пфальц.

Согласно исследованиям трав, было показано, что цистанхе — это тип гриба, который веками использовался в традиционной китайской медицине. Его делают из высушенных стеблей и стеблей гриба, произрастающего в тропических и субтропических регионах Азии. Он обычно используется дляповысить иммунитет, снимают усталость и лечат простуду и другие инфекции.

Исследования показали, чтоцистанхеможет увеличить выработку антител, которые могут помочь организму бороться с чужеродными захватчиками, такими как вирусы и бактерии. Было обнаружено, что он увеличивает количество и активность Т-клеток, типа лейкоцитов, которые помогают организму распознавать и бороться с вредными захватчиками.

Кроме того, исследования показали, что цистанхе может уменьшить тяжесть простуды, гриппа и других вирусных инфекций. Было обнаружено, что он сокращает время, необходимое организму для восстановления после вирусных или бактериальных инфекций. Цистанхе также может уменьшить продолжительность лихорадки, вызванной некоторыми вирусами, а также снизить риск развития вторичных инфекций.

Более того,цистанхеИзвестно, что он обладает противовоспалительными свойствами, которые могут уменьшить воспаление, связанное с некоторыми заболеваниями. Исследования также показали, что дендробиум может помочь повысить эффективность некоторых антибиотиков.

Нажмите на органический цистанхе, продаваемый рядом со мной

Для получения дополнительной информации, пожалуйста, свяжитесь с нами по адресу:david.deng@wecistanche.com

В целом, исследования показывают, что цистанхе может быть полезным средством для леченияулучшениеиммунитети бороться с различными инфекциями. Это может помочь улучшить естественную защиту организма, уменьшить тяжесть и продолжительность заболеваний и даже снизить риск развития вторичных инфекций.

Паразиты и инфекции 

Амастиготы или метациклические промастиготы L. major клона VI (MHOM/IL/Friedlin) получали, как описано ранее. Амастиготы выделяли из инфицированных ушей мышей BALB/c или мышей µMT с дефицитом В-клеток, как описано ранее. Выделенных паразитов опсонизировали 5-процентным NMS, IMS или анти-PL в течение 10 минут при 37°С и промывали перед инфекцией in vitro или in vivo.

Сыворотка, обогащение IgG и анализ связывания паразитов

Нормальная мышиная сыворотка (NMS) была получена от наивных мышей C57BL/6, тогда как иммунная сыворотка (IS) была получена от излеченных мышей, которые были инфицированы метациклическими промастиготами 2 × 10E5 L. major для более чем или равного до 6 недель. Сыворотки с антифосфолипидными антителами (PL) получали путем повторной иммунизации апоптозными тимоцитами. Перед сбором сыворотки успех иммунизации подтверждали путем оценки специфического связывания IgG с апоптозными клетками с помощью проточной цитометрии или в специфичном для -гликопротеина ELISA. Группы мышей C57BL/6 иммунизировали рекомбинантным 2-гликопротеином (2G) в присутствии адъюванта Фрейда (FA); сыворотку, содержащую анти- 2G, собирали через 4 недели. IgG против лейшмании Больше или равно 5-6-недельным инфицированным L. major мышам BALB/c, PL- или b2G-специфическим IgG получали из объединенной сыворотки с использованием колонок с белком G (Pierce Chemical Co.) следуя протоколу производителя. Сыворотки хранили при -20° до очистки IgG. Очищенный IgG перед использованием хранили при 4 градусах (0,8 мг/мл) в PBS.

Нормальная человеческая сыворотка (NHS) была получена от здоровых контрольных субъектов, а сыворотка, содержащая антитела против Leishmania, была получена от пациентов с кожным лейшманиозом (LM) из Марокко. Также использовали сыворотку больных с антифосфолипидным синдромом (ФС).

Паразитов (промастиготы или амастиготы) окрашивали на Ig, ассоциированные с поверхностью, с использованием изотип-специфических вторичных антител, реагирующих с Ig мыши: анти-IgM (Серотек), анти-IgG1 (A85-1) и анти-IgG2a/b ( R2-40, все от BD Biosciences). После окрашивания паразитов промывали PBS/2% BSA, фиксировали и анализировали методом проточной цитометрии.

Стимуляция in vitro

ДК костного мозга генерировали в среде RPMI/5% FCS с добавлением IL-4 (10 мкг/мл) и GM-CSF (10 мкг/мл) в течение 6 дней, как описано ранее. Клетки собирали на 6-й день в виде незрелых ДК. 2×105 DC культивировали совместно с опсонизированными амастиготами от инфицированных мышей BALB/c или µMT или культивировали с опсонизированными метациклическими промастиготами (MOI 1:5) в течение 18 часов. После этого клетки собирали и генерировали цитоспины, как описано ранее. Окрашенные DifQuick клетки анализировали на наличие внутриклеточных и внеклеточных паразитов. На образец подсчитывали не менее 200 клеток.

Инфекции in vivo

Объемы поражения измерялись еженедельно в трех измерениях и представлены в виде эллипсоидов [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. Паразитов, присутствующих в поврежденных тканях, подсчитывали, используя анализ предельного разведения, как описано ранее.

Для измерения продукции антиген-специфических цитокинов извлекали дренированные клетки LN инфицированных мышей C57BL/6 и готовили суспензии отдельных клеток. Один миллион клеток LN/200 мкл полного RPMI 1640 (Biochrome) добавляли в 96-луночные планшеты в присутствии 25 мкг/мл SLA. Супернатанты собирали через 48 часов после стимуляции и анализировали с использованием ELISA, специфичного для IFNΓ (R&D Systems), а также IL-4 и IL-10 (BD).

Миелоидные ДК человека, инфицированные опсонизированными паразитами

Миелоидный CD1c человека плюс ДК (hDC) выделяли из периферической крови в соответствии с инструкциями производителя с использованием системы выделения магнитных клеток и набора для выделения ДК человека BDCA-1 (Miltenyi, Германия). 1,5 × 107 клеток высевали в 2,5 мл RPMI 1640/2% аутологичной плазмы. Для повышения чистоты клетки промывали теплым PBS и, наконец, культивировали с X-VIVO 15/плазма (1 процент) с добавлением рекомбинантного человеческого IL-4 (150 ед/мл) и GM-CSF (400 ед/мл). . Незрелые hDC собирали на 6-й день. 2 × 105 hDC совместно культивировали с опсонизированными амастиготами от инфицированных мышей µMT или культивировали с опсонизированными метациклическими промастиготами (MOI 1:5) в течение 18 часов. После этого клетки собирали и генерировали цитоспины, как описано ранее. Окрашенные DifQuick клетки анализировали на наличие внутриклеточных и внеклеточных паразитов. На образец подсчитывали не менее 200 клеток.

статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения StatView и непарного t-критерия Стьюдента.

Полученные результаты

Сыворотка, содержащая антифосфолипидные антитела, связывается с L. major

Поскольку паразиты могут проникать в клетки-хозяева посредством процесса, называемого «апоптотической мимикрией», и поскольку формы жизни L. major экспрессируют фосфолипиды на своей поверхности, мы создали сыворотку, содержащую антифосфолипидные антитела (PL), используя установленные протоколы. С этой целью группы мышей C57BL/6 заражали L. major, иммунизировали апоптозными тимоцитами в присутствии адъюванта Фрейда (FA). Поскольку 2-гликопротеин (2G) является первичным антигеном при антифосфолипидном синдроме (АФС), мы также иммунизировали мышей 2G в присутствии FA для получения сыворотки, содержащей анти- 2G-антитела. В качестве контроля использовали сыворотку нормальных мышей (NMS) от неинфицированных мышей C57BL/6 и иммунную сыворотку (IS) от мышей, инфицированных L. major.

Чтобы проверить, содержат ли эти разные мышиные сыворотки от наивных или иммунизированных мышей антитела, которые связываются с L. major, мы сначала оценили связывание антител с антигеном паразита с помощью ELISA, используя лизат замораживания-оттаивания L. major промастигот (растворимый антиген Leishmania, SLA) в качестве субстрата. (Рис. 1А, черные столбцы). В качестве стандарта использовали IgG, выделенные из сыворотки мышей, инфицированных L. major. Интересно, что сыворотка IS, а также PL содержала сопоставимые уровни связывания антител с лизатом Leishmania, которые были в 3–4 раза выше по сравнению со связыванием, наблюдаемым с NMS или сыворотками мышей, иммунизированных одним адъювантом. Кроме того, сыворотка, содержащая антитела 2G, также связана с SLA. Используя ELISA, специфичный для 2G (белые столбцы), мы определили высокие уровни 2G-IgG в сыворотке, тогда как уровни 2G IgG во всех других сыворотках были ниже предела обнаружения.

инжир. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 недель с 2× 105 L. major (иммунная сыворотка, ИС). Другую группу повторно иммунизировали апоптотическими тимоцитами (антифосфолипидные Ат, а-ФЛ) или рекомбинантным 2-гликопротеином (а- 2G) в присутствии неполного адъюванта Фрейда (ФА), ФА использовали в качестве контроль. Сыворотку тестировали на реактивность в ELISA с использованием лизата L. major в качестве субстрата или 2-гликопротеина. ELISA был разработан с использованием анти-мышиного IgG. Данные выражены как среднее значение (±SEM, n больше или равно 1). B Метациклические промастиготы L. major были получены из культур стационарной фазы (n{{10}}). C Амастиготы получали из поражений мышей µMT с дефицитом В-клеток (n=3). Препараты паразитов В и С опсонизировали различными сыворотками (5%, 1{21}} мин, 37°). Связывание антител оценивали с помощью FACS с антимышиными вторичными антителами. Связывание Ig рассчитывали относительно исходных уровней неопсонизированных паразитов (*p меньше или равно 0,05, **p меньше или равно 0,005 и ***p меньше или равно 0,002).

Затем мы инкубировали метациклические промастиготы L. major на инфекционной стадии с различными концентрациями IgG, обогащенными сыворотками IS, PL или 2G. Мы наблюдали дозозависимое связывание IS- и 2G-производных IgG с максимумом при 100 нг/мл (рис. 1B). Связывание IgG, происходящих из PL, с промастиготами L. major не обнаружено.

Кроме того, мы инкубировали амастиготы L. major, выделенные из поражений мышей µMT с дефицитом В-клеток, с различными сыворотками в течение 10 мин. Затем паразитов тщательно промывали, а затем поверхностно-связанное антитело определяли с помощью проточной цитометрии после мечения PE-конъюгированными анти-IgG1, анти-IgG2a/b или анти-IgM (рис. 1C). Как и ожидалось, ИС содержал специфичные для Leishmania IgM, IgG1 и IgG2a/b. Мы также подтверждаем предыдущую работу, поскольку мы обнаружили специфические для Leishmania IgM в пуле так называемых «естественных антител». Интересно, что мы также обнаружили IgG и IgM в сыворотке PL, которые сильноперекрестно отреагировалс поверхности амастигот L. major. Анти- 2G-содержащие антитела IgG не связывались с Leishmania, но сыворотка 2G содержала IgMперекрестно реагирующийс амастиготными поверхностями.

Перекрестно-реактивные антитела опосредуют интернализацию паразита DC.

Затем мы намеревались оценить, являются ли функционально активными различные антитела IgG, способные связываться с поверхностью амастигот L. major. Таким образом, мы генерировали ДК, используя культуры клеток костного мозга (КМ), дополненные GMCSF и IL-4. BM-DC собирали в виде незрелых клеток на 6-й день и высевали в количестве 2×105 клеток/мл. Амастиготы паразитов, полученные из инфицированных подушечек лап мышей BALB/c дикого типа или мышей µMT с дефицитом В-клеток, опсонизировали различными сыворотками (5 об.%), тщательно промывали, а затем добавляли к DC в соотношении паразит/клетка 5:1. Через 18 ч клетки собирали, промывали и подвергали цитоспинированию.

Паразитинтернализацияопределяли на предметных стеклах, окрашенных DifQuick, при увеличении 100× (рис. 2). Как описано, поглощение паразитов, выделенных из мышей µMT, было значительно нарушено. Предварительная инкубация с NMS немного увеличивала поглощение паразитов, тогда как инкубация с IS приводила к «нормализации» показателей инфицирования DC до уровней, наблюдаемых с амастиготами, происходящими из BALB/c. Следует отметить, что опсонизация паразитов с помощью PL также значительно и явно улучшила уровень заражения DC примерно на 100 процентов. В соответствии с более низкими уровнями опсонизации IgG амастигот с помощью b2G-содержащей сыворотки (ср. рис. 1C), это также повышало уровень инфицирования ДК, но в меньшей степени.

Рис. 2Опсонизация L. major перекрестно-реактивными антителами приводит к усиленному поглощению паразита ДК. Незрелые BMDC C57BL/6 (2×105) культивировали совместно с амастиготами от BALB/c или мышей µMT с дефицитом В-клеток (1:3). Перед совместной инкубацией амастиготы опсонизировали нормальной мышиной сывороткой (NMS), иммунной сывороткой (IS), сывороткой, содержащей антифосфолипидные антитела, полученные повторной иммунизацией апоптотическими тимоцитами (aPL), или сывороткой, содержащей анти- 2 гликопротеин антитела (2G). Через 18 часов определяли уровень заражения на цитоспинах с помощью световой микроскопии (n=3, *p Меньше или равно 0.05,**p Меньше или равно 0,005, и ***p Меньше или равно 0,002 по сравнению с неопсонизированным контролем)

Перекрестно-реактивные антифосфолипидные антитела улучшают исходы кожного лейшманиоза

В последующих экспериментах мы хотели оценить, может ли опсонизация паразитовперекрестно-реактивныйантитела изменяют исходы заболевания in vivo. С этой целью метациклические промастиготы, выделенные и обогащенные из культур паразитов, опсонизировали различными сыворотками, как описано выше. Паразит, опсонизированный NMS, служил отрицательным контролем. После интенсивного промывания паразитов группы из пяти мышей C57BL/6 внутрикожно инфицировали 103 L. major. Развитие поражения наблюдали в течение ~ 4 месяцев. В соответствии с предыдущими выводами, паразиты, опсонизированные ИС, индуцировали меньшие поражения уха в соответствии с повышенной частотой инфицированных ДК кожи в ранние моменты времени (рис. 3). Удивительно, но паразиты, опсонизированные PL или 2G, аналогичным образом способствовали аналогичному улучшению исходов заболевания, что определялось уменьшением объема поражений на 50 процентов между 5 и 8 неделями после заражения.

Перекрестно-реактивные антифосфолипидные антитела улучшают исходы кожного лейшманиоза

В последующих экспериментах мы хотели оценить, может ли опсонизация паразитовперекрестно-реактивныйантитела изменяют исходы заболевания in vivo. С этой целью метациклические промастиготы, выделенные и обогащенные из культур паразитов, опсонизировали различными сыворотками, как описано выше. Паразит, опсонизированный NMS, служил отрицательным контролем. После интенсивного промывания паразитов группы из пяти мышей C57BL/6 внутрикожно инфицировали 103 L. major. Развитие поражения наблюдали в течение ~ 4 месяцев. В соответствии с предыдущими выводами, паразиты, опсонизированные ИС, индуцировали меньшие поражения уха в соответствии с повышенной частотой инфицированных ДК кожи в ранние моменты времени (рис. 3). Удивительно, но паразиты, опсонизированные PL или 2G, аналогичным образом способствовали аналогичному улучшению исходов заболевания, что определялось уменьшением объема поражений на 50 процентов между 5 и 8 неделями после заражения.

Затем мы использовали амастиготы µMT, инкубированные со 100 мкг IgG, обогащенными NMS, IS или PL (рис. 4). Опять же, мы наблюдали, что как IgG от IS, так и от PL приводили к более легкому заболеванию с меньшими поражениями по сравнению с неопсонизированными паразитами (рис. 4A). Соответственно, паразитарная нагрузка пораженной ткани, определенная на 6-й неделе после заражения, выявила (значительно) меньшую паразитарную нагрузку при инфекциях, инициированных в присутствии антител, связывающих паразитов (рис. 4B). Антиген-специфическая повторная стимуляция дренирующих клеток лимфатических узлов с помощью SLA выявила неизмененные уровни IFN, тогда как более низкие уровни IL-4 и IL-10 были обнаружены у мышей, инфицированных IgG-опсонизированными паразитами (рис. 4C). . Это согласуется с уменьшением размеров поражений, поскольку предыдущая работа показала, что элиминация паразитов у мышей зависит от активации инфицированных MΦ повреждающим IFN, которому противодействует IL-4 и, что очень важно, IL-10. . Таким образом, воздействие IL-10 на инфицированный MΦ приводило к персистенции паразита. Таким образом, соотношение между IFN, с одной стороны, и цитокинами, связанными с Th2/Treg, такими как IL-4 и IL-10, по-видимому, наиболее важно для исхода заболевания.

Интересно, однако, что в этих условиях также наблюдались меньшие объемы поражения, когда для опсонизации использовали IgG из NMS, что указывает на присутствиеперекрестно-реактивныйестественные антитела в сыворотке наивных мышей.

Как специфичные для Leishmania, так и перекрестно-реактивные антитела могут заменить генетический недостаток IgG.

Чтобы лучше проанализировать специфический вклад подтипов иммуноглобулина в ответ на Leishmania, мы использовали мышей IgMi и IgG1i, которые мы создали ранее. Мыши IgMi представляют собой мыши, у которых все В-клетки экспрессируют IgM, но не могут переключать класс или секретировать антитела. У мышей IgG1i все В-клетки развиваются с использованием IgG1 в качестве рецептора В-клеток, но эти клетки также не могут переключаться между классами, но способны секретировать антитела IgG1. Мы заразили мышей IgMi и IgG1i на генетическом фоне C57BL/6 103 L. major. Мы обнаружили, что присутствия IgG1 в сыворотке было достаточно для того, чтобы у мышей развился полный ответ на паразита, как и у животных дикого типа (рис. 5А). Напротив, отсутствие секретируемых антител, наблюдаемое у мышей IgMi, было достаточным для задержки выздоровления мышей (фиг. 5А).

Затем мы воссоздали мышей IgMi или контроли дикого типа с помощью NMS или IS, а затем заразили их промастиготами L. major. Как и ожидалось, у обеих линий мышей воссоздание ИС индуцировало значительно меньшие поражения in vivo, подтверждая, что IgG-опосредованное ускоренное поглощение паразита дендритными клетками способствует улучшению антилейшманиозных инфекций.иммунитет(рис. 5Б). Наконец, мы оценили исход заболевания после использования опсонизированных паразитов. Перед заражением мышей IgMi паразиты были опсонизированы IgG, обогащенными из сыворотки NMS, IS или PL (рис. 5C). В соответствии с экспериментом, показанным на рис. 5B, IS-опсонизированные паразиты способствовали усилению защиты от паразитов. Опять же, антифосфолипидные антитела были способны заменить специфичные для Leishmania IgG из ИС, поскольку оба IgG-антитела, связанные с промастиготами L. major до заражения, способствовали лучшему исходу заболевания у мышей IgMi. IS- и PL-опсонизированные паразиты вызывали значительно меньшие объемы поражения и более раннее заживление по сравнению с неопсонизированными паразитами.

Важно отметить, что введение NMS мышам IgMi «нормализовало» их фенотип к исходу заболевания, наблюдаемому у мышей C57BL/6 (фиг. 5B). Эти результаты согласуются с нашими данными, показанными выше, предполагающими, что NMS также содержитперекрестно-реактивныйантитело изотипа IgG, способное связываться с паразитами с последующими функциональными последствиями in vitro и in vivo. Дальнейшее подтверждение получено от мышей IgMi, инфицированных паразитами, покрытыми NMS, которые также были способны лучше контролировать инфекцию (рис. 5C).

инжир. 4Паразиты, опсонизированные антителами, индуцируют эффективный иммунитет у µMT с дефицитом В-клеток. Паразитов опсонизировали нормальной мышиной сывороткой (NMS), иммунной сывороткой (IS), сывороткой, содержащей антифосфолипидные антитела (a-PL), или — только для мышей C57BL/6 — сывороткой, содержащей анти- 2 гликопротеиновые антитела ( 2G) в наличие адъюванта Фрейда (ФА). Группы мышей размером более или равным 5 мкМТ были инфицированы 103 опсонизированными метациклическими промастиготами L. major. Развитие поражения оценивали еженедельно. B На 6-й неделе количество пораженных паразитами зараженных мышей µMT определяли с помощью анализа предельных разведений. Показаны отдельные номера паразитов; бары экспресс средства. C Профили цитокинов дренирующих клеток µMT LN определяли путем повторной стимуляции растворимым антигеном Leishmania (SLA). Высвобождение IFNΓ, IL{{10}} и IL-10 в супернатантах 48-h оценивали с помощью ELISA (среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n=15 мышей/группу из независимых 3 эксперимента, *p Меньше или равно 0,05, **p Меньше или равно 0,005 и ***p Меньше или равно 0,002 по сравнению с мышами, инфицированными неопсонизированными паразитами)

Сыворотка человека содержит функционально активные перекрестно-реактивные антитела к паразитам.

Чтобы проверить актуальность наших результатов для людей, промастиготы или амастиготы, выделенные от мышей µMT с дефицитом В-клеток, опсонизировали нормальной человеческой сывороткой (NHS), сывороткой от пациентов, инфицированных L. major (LM), или сывороткой от пациентов с APS (APS). ). Поверхностно-связанный IgG на паразитах определяли с помощью проточной цитометрии. Интересно, что сыворотка LM слабо связывалась с поверхностью промастигот, но прочно связывалась с амастиготами. Интересно, что сыворотка с АФС содержала аналогичные уровни IgG.перекрестно-реактивныйс паразитными поверхностями (рис. 6А).

Затем IgG обогащали из сыворотки LM с использованием колонок с белком A (фиг. 6B). Эту и другие концентрации внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ), применяемых для лечения различных (иммунных) нарушений у пациентов, затем использовали для опсонизации паразитов перед проточной цитометрией. Leishmania IgG в значительной степени связывается с промастиготами и амастиготами L. major. Интересно, что коммерчески доступный ВВИГ содержал IgG, которыйперекрестно отреагировалкак с промастиготными, так и с амастиготными препаратами от паразитов.

Наконец, CD1c плюс первичные миелоидные DC человека из лейкоцитарных пленок инкубировали с амастиготами µMT L. major, инкубированными с сывороткой LM или сывороткой пациентов с APS или IVIG (MOI 3; рис. 7). Подтверждая наши данные о мышах с использованием клеток человека, мы обнаружили, что присутствие IgG (перекрестно-реактивныйили специфичных для Leishmania) на поверхности Leishmania достаточно для усиленияпаразитинтернализацияпо ДК. Сыворотка APS увеличила процент инфицированных DC почти на 100 процентов, тогда как сыворотка LM и IVIG увеличили поглощение паразитов на 30 процентов по сравнению с неопсонизированными паразитами. Интересно, что сыворотка NMS также содержала паразит-реактивные IgG, стимулирующиепаразитинтернализация.

инжир. 5 Мыши C57BL/6, IgMi и IgGi, реконструированные с использованием различных сывороток или инфицированные различными очищенными опсонизированными IgG L. major, демонстрируют улучшенные результаты заболевания. Группу из 5 или более мышей C57BL/6, C57BL/6 IgMi или IgGi инфицировали физиологическими низкими дозами инокулята L. major (103 метациклических промастигот). B. За неделю до заражения мышам C57BL/6 и B6 IgMi восстанавливали внутрибрюшинно два раза с помощью 100 мкл либо нормальной мышиной сыворотки (NMS), либо иммунной сыворотки (IS). C Перед заражением мышей IgMi паразиты были опсонизированы IgG, обогащенными из сыворотки, путем связывания с колонками с белком А [нормальная мышиная сыворотка (NMS), иммунная сыворотка (IS) или сыворотка, содержащая антифосфолипидные антитела (a-PL)]. A–C Развитие поражения оценивали еженедельно (среднее ± стандартная ошибка среднего, n=10 мышей/группу из 2 независимых экспериментов, *p меньше или равно 0,05, **p меньше или равно 0,005 и *** p Меньше или равно 0,002 по сравнению с C57BL/6 [A], C57BL/6 или IgMi [B] или отсутствием [C])

Инжир. 6Антифосфолипидные антитела в сыворотке человека перекрестно реагируют с поверхностными молекулами L. major. Метациклические промастиготы из культур стационарной фазы или пораженные амастиготы L. major, выделенные от мышей µMT, опсонизировали различными типами человеческой сыворотки (5 процентов) или очищенным IgG. Нормальную человеческую сыворотку (NHS) получали от здоровых контрольных субъектов. Также использовались сыворотки от пациентов с подтвержденным кожным лейшманиозом (LM, приобретенный в Марокко, n=4) и от пациентов с антифосфолипидным синдромом (PL, n=3). B IgG обогащали из сыворотки LM с использованием колонок с белком A (n=3). Использовали различные концентрации внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ, n=2) (мкг/мл). Паразиты A и B анализировали на поверхностное связывание общего Ig человека с использованием проточной цитометрии. Связывание Ig рассчитывали по отношению к исходным уровням неопсонизированных паразитов (среднее ± стандартная ошибка среднего, *p Меньше или равно 0.05, **p Меньше или равно {{10 }}.005 и ***p Меньше или равно 0,002)

Обсуждение

Излечение от кожного лейшманиоза требует эффективного праймирования Т-клеток и высвобождения IFN, оба из которых зависят от инфицированных ДК, представляющих антигены наивным Т-клеткам. В отличие от CR3-зависимого фагоцитоза с помощью MΦ, мы показали, чтопаразитинтернализацияот DC происходит через Fc RI и Fc RIII, которые могут замещать друг друга. Таким образом, у мышей с дефицитом Fc-, Fc RI/Fc RIII и мышей µMT с дефицитом В-клеток (все на фоне C57BL/6) развивались более крупные поражения и замедленное заживление по сравнению с мышами дикого типа из-за нарушения DC- зависимый прайминг Т-клеток. Наше настоящее исследование подтверждает это предварительное наблюдение, но, кроме того, наши данные с использованием мышей IgMi и IgGi также предполагают, что действительно секретируемые антитела, а не простое присутствие В-клеток, имеют решающее значение для установления эффективного ответа на паразита. Таким образом, подобно мышам с дефицитом В-клеток, мыши IgMi с В-клетками, неспособными продуцировать IgG, демонстрировали большие размеры поражений по сравнению с мышами IgGi или мышами дикого типа.

Поскольку как NMS, так и IS-опсонизированные амастиготы поглощались в одинаковой степени, а NMS-опсонизированные промастиготы не подвергались фагоцитозу DCs (с эффективным связыванием IgM с их поверхностью), мы ранее пришли к выводу, что IgM не требуется для захвата паразитом. В настоящем исследовании мы смогли подтвердить эти результаты, используя нормальную сыворотку мыши у мышей, у которых либо полностью отсутствуют В-клетки, либо только секретируются антитела. Кроме того, мы смогли показать, что сыворотки, содержащие IgG1-, способны усиливать проникновение амастигот в ДК человека и мыши.

Оставалось неясным, как развивается первоначальный В-клеточный ответ в отсутствие инфицированных ДК. Одна возможность заключалась в том, что в пуле «естественных» IgG,перекрестно-реактивныйантитела могут быть в состоянии распознавать паразитов и служить заменой для лейшманиоз-специфических антител, которые вырабатываются позже (возрастают между 4 и 6 неделями после заражения). В дополнение к антиген-специфическим антителам так называемые естественные антитела продуцируются В-1-клетками как у мышей, так и у людей после рождения. Некоторые обладают способностью распознавать собственные антигены; долгое время считалось, что они не обладают специфичностью к чужеродным антигенам. Позже были получены данные, свидетельствующие о том, что природные IgM распознают различные микробные антигены и способствуют элиминации патогенов. Однако недавно несколько исследований показали, что естественный IgG играет роль вврожденный иммунитеттакже. Было показано, что он взаимодействует с лектинами, ассоциированными с патогенами (например, MBL), и образует иммунные комплексы для элиминации патогенов. Также ожидается, что природный IgG, связанный с патогеном, будет взаимодействовать с другими PRR, такими как C1q, для активации классического пути комплемента. Было показано, что природный IgG специфически взаимодействует с патоген-ассоциированными лектинами, вызывая эффективное антимикробное действие против условно-патогенной синегнойной палочки и золотистого стафилококка.

Во время апоптотической гибели клеток наблюдается воздействие фосфатидилсерина (PS) на апоптотические тельца. Распознавание хозяином ФС на поверхности умирающих или мертвых клеток с помощью антител является важным шагом в их клиренсе. Известно, что в процессе, называемом «мимикрия апоптоза», паразиты Leishmania также выставляют PS на своей собственной поверхности, что служит сигналом «съешь меня» для фагоцитирующих клеток, подобно тому, что наблюдается апоптозными клетками. Более того, некоторые из промастигот на инфекционной стадии погибают (без участия каспаз) и сами подвергаются воздействию PS. Однако все облигатные внутриклеточные формы жизни амастиготы обнажают PS на своей поверхности, что позволяет им эффективно проникать в клетки-хозяева. Теперь мы оценили, способны ли искусственно индуцированные PL-антитела распознавать паразитов Leishmania и являются ли они функционально активными для облегчения проникновения паразита в соответствующие клетки-хозяева. Мы наблюдали, что мышиные и человеческие антифосфолипидные антитела связывают формы жизни Leishmania. Используя различные подходы, мы определилиперекрестно-реактивныйантитела в сыворотке PL, которые, по-видимому, предпочтительно связываются с поверхностными фосфолипидами L. major. Интересно, что даже несмотря на то, что паразиты-промастиготы также экспрессируют эти фосфолипиды, как показано с использованием растворимого антигена паразита из этой формы жизни паразита в ELISA, поверхностные фосфолипиды, по-видимому, более сильно экспонируются на амастиготах. Кроме того, мы показали, что этой опсонизации IgG было достаточно, чтобы стимулировать поглощение паразита DC. Важно отметить, что in vivo PL-опсонизированные паразиты индуцировали улучшение исхода заболевания с меньшими объемами поражения и более ранним разрешением поражения. Таким образом, в соответствии с предыдущими наблюдениями нашей группы, из-за усиленной ДК-инфекции в присутствии(перекрестно-реактивный)IgG на паразитах индуцировалась предпочтительная индукция клеток Th1/Tc1, связанная с уменьшением количества клеток Th2 и Treg и, таким образом, лучшим исходом заболевания.

Рис. 7Первичные миелоидные ДК из крови человека преимущественно интернализуют паразитов сперекрестно-реактивныйантифосфолипидный IgG, связанный с их поверхностью. CD1a плюс миелоидные ДК человека выделяли из лейкоцитарных пленок с использованием шариков MACS и высевали в количестве 2×1{9}}5 клеток/мл. Амастиготы, выделенные от мышей µMT, инкубировали с 5-процентной сывороткой или 10 мкг/мл ВВИГ перед совместной инкубацией с DC (1:3). Через 18 ч уровень инфицирования определяли на цитоспинах с помощью световой микроскопии (n=3, *p меньше или равно 0,05 и ***p меньше или равно 0,002 по сравнению с неопсонизированным контролем).

Интересно, что мы обнаружили, что паразиты, опсонизированные с помощью NMS, способствуют лучшему исходу заболевания по сравнению с неопсонизированными паразитами, что указывает на присутствие природного IgG в NMS, который способен распознавать Leishmania. Лучше всего это было видно в IgMi (лишенных В-клеток, способных продуцировать какие-либо IgG), замещенных NMS. Здесь явно большие размеры поражений у мышей IgMi были уменьшены до размеров у мышей C57BL/6 дикого типа (рис. 5). Однако присутствие естественных Leishmaniaперекрестно-реактивныйIgG также наблюдался у мышей дикого типа, инфицированных NMS-опсонизированными паразитами, по сравнению с неопсонизированными паразитами. Специфичность этих природных IgG в мышиной и человеческой сыворотке на сегодняшний день неясна. Заманчиво предположить, что это также антитела, распознающие ФС на поверхности паразита, поскольку они предпочтительно связываются с амастиготами с известным более высоким воздействием ФС по сравнению с промастиготами.

Мы обнаружили, что сыворотка здоровых людей из контрольной группы (из региона, где лейшманиоз регистрируется только как болезнь, перенесенная из-за путешествий, и не было ранее инфицированных) также содержала IgG, способный связываться с амастиготами L. major и способствовать усиленному поглощению паразита DC. Важно отметить, что ВВИГ, используемый для нашего исследования, производится в Германии (неэндемичен по лейшманиозу). Интересно, что обогащенный человеческий IgG из ВВИГ от Leishmania-отрицательных индивидуумов, таким образом, содержал IgG, который был способен связывать как промастиготы, так и (вероятно, из-за более высокого воздействия ФС) L. major амастиготы. В свою очередь, сыворотка больных АФС с высоким уровнем антифосфолипидных антител содержала IgG, которые преимущественно связывались с амастиготами, в меньшей степени с промастиготами. Как IgG из сыворотки APS, так и IgG из IVIG способствовали усиленному поглощению паразита первичными ДК человека в степени, сравнимой (или даже лучше в случае с PL-содержащей сывороткой APS) с IgG, полученным из иммунной сыворотки пациентов с лейшманиозом.

Таким образом, наши данные показывают, что нормальная сыворотка мыши, а также человеческая сыворотка, даже взятая у людей, никогда не контактировавших с Leishmania, содержит антитела IgG, которые способны связываться с этим паразитом, облегчая его поглощение ДК и усиливая защитный иммунный ответ лейшманиоза. хозяин. Несмотря на то, что распознанный(е) антиген(ы) Leishmania не совсем ясен, некоторая реактивность может быть направлена ​​против фосфолипидов, более распространенных на поверхности амастиготы, чем на поверхности промастиготы. Наши результаты могут проложить путь к разработке более эффективной терапии для этого паразита и даже могут послужить мерой предосторожности первой линии для людей, которые путешествуют в районы, зараженные Leishmania.

Благодарности

Авторы искренне благодарят Mark C. Udey и Philipp von Landenberg за полезные обсуждения и предоставление образцов пациентов.

Вклад автора 

FD, SLK и ST выполнили эксперименты, описанные в этой рукописи. ST, AW и EvS обеспечили финансирование проекта и руководили работой. AW и EvS написали рукопись.

Финансирование

Финансирование открытого доступа разрешено и организовано Projekt DEAL. Исследование было поддержано фондами DFG (SFB 490 для EvS и AW и SFB 1292 для EvS, AW и ST) и Центра молекулярной медицины (CMMC) в Кельне для EvS.

Наличие данных и материалов 

Непригодный.

Декларации

Этическое одобрение и согласие на участие

Все эксперименты с мышами проводились в соответствии с руководством штата Рейнланд Пфальц.

Согласие на публикацию

Все авторы дают согласие на публикацию.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы укажете подлинного автора. (s) и источник, предоставить ссылку на лицензию Creative Commons и указать, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя.

Рекомендации

1. Burza S, Croft SL, Boelaert M (2018) Leishmaniasis Lancet 392:951–970.

2. von Stebut E, Tenzer S (2018) Кожный лейшманиоз: различные функции дендритных клеток и макрофагов во взаимодействии иммунной системы хозяина с Leishmania major. Int J Med Microbiol 308:206–214.

3. Сакс Д., Нобен-Траут Н. (2002) Иммунология восприимчивости и устойчивости к Leishmania major у мышей. Nat Rev Immunol 2: 845–858.

4. de Freitas ESR, von Stebut E (2021) Раскрытие роли иммунных контрольных точек при лейшманиозе. Фронт Иммунол 12:620144.

5. Schonlau F, Scharfetter-Kochanek K, Grabbe S, Pietz B, Sorg C, Sunderkotter C (2000) При экспериментальном лейшманиозе дефицит CD18 приводит к распространению паразитов, связанному с измененными функциями макрофагов и неполным ответом клеток Th1. Eur J Immunol 30: 2729–2740.

6. Woelbing F, Kostka SL, Moelle K, Belkaid Y, Sunderkoetter C, Verbeek S, Waisman A, Nigg AP, Knop J, Udey MC и др. (2006). Поглощение Leishmania major дендритными клетками опосредовано рецепторами Fcgamma и способствует приобретению защитного иммунитета. J Exp Med 203: 177–188

7. Nagele EP, Han M, Acharya NK, DeMarshall C, Kosciuk MC, Nagele RG (2013) Естественные аутоантитела IgG многочисленны и широко распространены в сыворотке крови человека, и их количество зависит от возраста, пола и заболевания. ПЛОС ОДИН 8:e60726.

8. Lutz HU, Binder CJ, Kaveri S (2009) Встречающиеся в природе аутоантитела в гомеостазе и заболеваниях. Тенденции Иммунол 30:43–51.

9. Wanderley JL, Barcinski MA (2010) Апоптоз и апоптотическая мимикрия: связь с Leishmania. Cell Mol Life Sci 67: 1653–1659.

10. Вайсман А., Кроксфорд А.Л., Демирчик Ф. (2008) Новые инструменты для изучения роли В-клеток в цитомегаловирусных инфекциях. Мед микробиол иммунол 197:145–149

11. Von Stebut E, Ehrchen JM, Belkaid Y, Kostka SL, Molle K, Knop J, Sunderkotter C, Udey MC (2003) Интерлейкин 1альфа способствует дифференцировке Th1 и ингибирует прогрессирование заболевания у мышей BALB/c, восприимчивых к Leishmania major. J Exp Med 198: 191–199

12. Levine JS, Subang R, Nasr SH, Fournier S, Lajoie G, Wither J, Rauch J (2006) Иммунизация апоптозным клеточно-связывающим белком воспроизводит нефрит и последовательное появление аутоантител при системной красной волчанке. Дж. Иммунол 177:6504–6516.

13. Wanderley JLM, DaMatta RA, Barcinski MA (2020)Апоптотическая мимикрия как стратегия установления паразитарных инфекций: фосфатидилсерин, полученный от паразитов и хозяев, в качестве ключевой молекулы. Сигнал сотовой связи 18:10.

14.McDonnell T, Wincup C, Buchholz I, Pericleous C, Giles I, Ripoll V, Cohen H, Delcea M, Rahman A (2020) Роль бета--2-гликопротеина I в здоровье и связанной с болезнью структуре с функцией : больше, чем просто АПС. Кровь Откровение 39:100610.

15. Домингес М., Торано А. (1999) Иммунный опсонофагоцитоз, опосредованный адгезией: механизм заражения Leishmania. J Exp Med 189: 25–35.

16. Belkaid Y, Hofmann KF, Mendez S, Kamhawi S, Udey MC, Wynn TA, Sacks DL (2001) Роль интерлейкина (IL) -10 в сохранении Leishmania major в коже после заживления и терапевтический потенциал антитела к рецептору IL-10 для стерильного излечения. J Exp Med 194: 1497–1506.

17. Вайсман А., Краус М., Сигал Дж., Гош С., Меламед Д., Сонг Дж., Сасаки Й., Классен С., Лутц С., Бромбахер Ф. и др. (2007). В-клетки, выживание которых в меньшей степени зависит от Ig{альфа}/{бета}. J Exp Med 204: 747–758

18. Panda S, Ding JL (2015) Природные антитела связывают врожденный и адаптивный иммунитет. Дж. Иммунол 194:13–20.

19. Puga I, Cerutti A (2013) Защита с помощью природного IgG: сладкое сочетание с растворимыми лектинами делает свое дело! EMBO J 32: 2897–2899.

20. Duncan AR, Winter G (1988) Сайт связывания C1q на IgG. Природа 332: 738–740.

21. Panda S, Zhang J, Tan NS, Ho B, Ding JL (2013) Натуральные антитела IgG обеспечивают врожденную защиту от бактерий, опсонизированных толстой кишкой. EMBO J 32: 2905–2919.

22. Эль-Хани С., Борхес В., Вандерли Дж. Л., Барчински М. (2012) Апоптоз и апоптотическая мимикрия у Leishmania: эволюционная перспектива. Front Cell Infect Microbiol 2:96.

Для получения дополнительной информации, пожалуйста, свяжитесь с нами по телефону: david.deng@wecistanche.com тел: 0013632399501