Конъюгат дендример-тесаглитазар вызывает фенотипический сдвиг микроглии и усиливает -амилоидный фагоцитоз† Часть 2

Биологические анализы in vitro

Клеточная культура. Линия мышиных микроглиальных клеток BV2 была получена из Центра клеточных культур Детской больницы Мичигана.

В последние годы ученые обнаружили, что культура клеток тесно связана с человеческой памятью. Исследования показали, что посредством изучения клеточной культуры можно обнаружить молекулярные механизмы памяти и процесса обучения, тем самым улучшая когнитивные способности и память человека.

Культура клеток — это процесс помещения биологических клеток в культуральную среду, содержащую необходимые питательные вещества, для роста и размножения в условиях in vitro. Клетки являются основными единицами жизни, и клеточная культура предоставляет ученым платформу для изучения поведения клеток и их жизнедеятельности. Изучая клетки, ученые обнаружили много информации о росте нейронов и синаптических связях. Эти результаты могут не только помочь людям лучше понять, как работает мозг, но также помочь разработать новые методы лечения и лекарства.

Исследования последних лет показали, что культура клеток также тесно связана с человеческой памятью. Ученые обнаружили, что формирование и поддержание человеческой памяти требует большого количества молекулярной регуляции и доставки сигналов. Эти механизмы доставки и регуляции сигналов имеют много общего с механизмами в клеточной культуре. Изучая механизмы доставки и регуляции сигналов в культуре клеток, ученые смогут лучше понять механизмы человеческой памяти и обучения.

Кроме того, некоторые исследования также показали, что клеточная культура может определенным образом улучшить человеческую память и способность к обучению. Например, с помощью метода под названием «электрическая стимуляция» можно стимулировать активность клеток и связи между нейронами, тем самым улучшая когнитивные способности человека и эффекты обучения. Хотя этот метод все еще находится на стадии лабораторных исследований, ожидается, что в будущем он станет новым методом когнитивного обучения.

Таким образом, существует тесная связь между клеточной культурой и человеческой памятью. Изучая клетки, мы сможем лучше понять когнитивный механизм человека и механизм памяти, а также помочь разработать новые методы лечения и методы когнитивной тренировки. Давайте с нетерпением ждем вклада технологий культивирования клеток в человечество в будущем! Видно, что нам необходимо улучшить память, а Цистанхе может значительно улучшить память, поскольку Цистанхе обладает антиоксидантным, противовоспалительным и омолаживающим действием, что может помочь уменьшить окислительные и воспалительные реакции в мозге, тем самым защищая здоровье организма. нервная система. Кроме того, Цистанхе также может способствовать росту и восстановлению нервных клеток, тем самым улучшая связь и функцию нейронных сетей. Эти эффекты могут помочь улучшить память, способность к обучению и скорость мышления, а также предотвратить возникновение когнитивной дисфункции и нейродегенеративных заболеваний.

Нажмите «Знайте добавки для улучшения памяти»

Клетки BV2 культивировали в среде EaglesMedium, модифицированной Дульбекко (DMEM), с 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (HI FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином (P/S) при 37 градусах и 5% CO2.

Как только клетки достигали слияния в культуральной колбе, клетки переносили в новую колбу, используя 0,05% трипсин-этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Для экспериментов клетки BV2 высевали в DMEM с 5% HIFBS и 1% P/S. Через 24–48 часов клетки стимулировали 100 нг/мл (300 ЕС/мл) ЛПС в течение 3 часов, чтобы позволить клеткам перейти в провоспалительный (М1) фенотип для имитации нейровоспалительной среды, присутствующей при многих неврологических заболеваниях.

Затем клетки обрабатывали совместно LPS и свободным Tesa или D-Tesa в различных концентрациях в течение 48 часов, после чего супернатант и клетки собирали для обработки. Клетки, никогда не обрабатывавшиеся ЛПС (без ЛПС), и клетки, постоянно обработанные только ЛПС (только ЛПС), служили контрольными группами. Свободные исходные растворы Tesa и D-Tesa стерилизовали с использованием фильтров из поли(эфирсульфонов) 0,2 мкм.

D-Tesa растворялась в клеточной среде. Tesa растворяли с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) при конечной концентрации менее 0,1% (об./об.). Цитотоксичность, анализ оксида азота и TNF-ELISA. Для анализа цитотоксичности клетки обрабатывали, как описано выше, в луночном планшете, а затем цитотоксичность свободных Tesa и D-Tesa оценивали с помощью МТТ-анализа, следуя инструкциям производителя.

Для анализа оксида азота клетки обрабатывали, как описано выше, в планшетах с лунками 12-, а затем собирали супернатанты от обработанных клеток и немедленно определяли уровни оксида азота, следуя протоколу производителя для реагента Грисса.

Для TNF-ELISA клетки обрабатывали, как описано выше, в планшетах с лунками 12-, а затем супернатанты обработанных клеток собирали и хранили при -80 градусах до готовности к дальнейшей обработке.

Затем образцы оттаивали на льду и проводили TNF-ELISA в соответствии с протоколом производителя. Для этих исследований как D-Tesa, так и свободный Tesa обрабатывали ультразвуком и перемешивали на встряхивании до тех пор, пока они оба не стали полностью растворимыми. Чтобы солюбилизировать свободный Tesa, его сначала растворяли в ДМСО, а затем разбавляли, при этом конечная концентрация ДМСО составляла менее 0,1% (об./об.) для всех свободных образцов Tesa.

Поскольку D-Tesa растворялась в средах для культивирования клеток, ДМСО к этим образцам не добавлялся. Для всех исследований in vitro эквивалентное количество свободного или конъюгированного лекарственного средства наносили на клетки как в группах свободного Tesa, так и в группах D-Tesa.

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Клетки обрабатывали, как описано выше, в 12-луночных планшетах, и после сбора супернатанта клетки собирали в реагент Invitrogen™ TRIzol™ (от Fisher Scientific) и экстрагировали РНК, следуя протоколу производителя. Концентрацию и чистоту полученной РНК анализировали с помощью Nanodrop.

Эквивалентные количества РНК из каждого образца были преобразованы в кДНК в соответствии с протоколом производителя для набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости (от Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific).

Полученную кДНК использовали для анализа qRT-PCR с использованием зеленого реагента FAST-SYBR и в соответствии с протоколом производителя. Значения Ct рассчитывали с помощью машины, и данные анализировали с использованием метода 2-ΔΔCt.

Для каждого отдельного маркера значение ΔΔCt рассчитывали путем вычитания ΔCt для группы без ЛПС из ΔCt для каждого образца. Значение ΔCt представляло собой значение Ct для интересующего гена минус Ct для GAPDH для каждого данного образца.

После расчета 2-ΔΔCt для всех групп все они были нормализованы по группе без ЛПС, тем самым давая относительный уровень экспрессии для группы без ЛПС, равный 1.0 для всех маркеров. Последовательности прямого и обратного праймеров, использованные для qRT. -ПЦР показаны в таблице ниже. Все последовательности записываются от 5′→3′.

Кроме того, у BIORAD были приобретены коммерчески доступные праймеры для iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452), SOCS1. (qmmuced0024846), CD36 (qmmuced0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmuced0021296), CCL1 (qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmuced000 6404) и PPAR (qmmucid0018821). Анализ фагоцитоза.

Влияние свободных Tesa и D-Tesa на фагоцитоз -амилоида определяли с использованием ранее описанного метода.47 Вкратце, HiLyte™ Flour 488-, меченный -амилоидом 1–42 (от Anaspec Inc.), растворяли в ДМСО (конечная концентрация ДМСО). менее 0,5% (об/об)) и разбавляли до 5 мкг/мл в PBS.

После обработки клеток Tesa и D-Tesa по схеме обработки, описанной выше, на клетки наносили раствор -амилоида на 2 часа. Затем клетки трижды промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка с двухвалентными катионами (кальция и магния), удаляли из лунок с помощью трипсина и ресуспендировали в буфере FACS (от Invitrogen).

Образцы хранили на льду и сразу же обрабатывали на проточной цитометрической машине Sony Cell Sorter SH800, а данные анализировали с помощью соответствующего программного обеспечения.

Ворота были установлены с использованием клеток, не обработанных флуоресцентным амилоидом, и показанные результаты представляют собой процент клеток из каждой группы, которые демонстрировали флуоресценцию выше фоновой флуоресценции.

Для каждой группы также сообщали среднюю интенсивность флуоресценции (MFA) HiLyte™ 488--амилоида, меченного 488-. Этот анализ проводили в двух экземплярах. Статистика. Все представленные данные являются результатом трех отдельных экспериментов, каждый из которых проводился в трех экземплярах, если не указано иное. Для выполнения статистики использовались GraphPad Prism 5 и Microsoft Excel.

Были выполнены двусторонние парные t-критерии Стьюдента с коррекцией Бонферрони. Для определения выбросов использовался тест Граббса. Для построения графиков данных использовалась GraphPad Prism 5 для Windows (Сан-Диего, Калифорния). Показанные данные представляют собой среднее значение + SEM.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика D-Tesa

Чтобы обеспечить целенаправленную внутриклеточную доставку к активированным клеткам микроглии головного мозга, Tesa ковалентно конъюгировали на поверхности G4-PAMAM-OH с расщепляемыми эфирными связями между лекарственным средством и дендримером-линкером (рис. 1).

На первом этапе Tesa (1) подвергали взаимодействию с азидом тетраметиленгликоля (TEG-азидом) (2) с образованием Tesa-TEG-азида (3), который имеет сложноэфирную связь между лекарственным средством и линкером (рис. 1А).

ВЭЖХ соединения (3) показала время удерживания 13,4 минуты с чистотой более 99% (рис. S1B†). Масс-спектр (3) показал пик 610,13 [M + 1]+, соответствующий молекулярной массе Tesa-TEG-азида, что еще раз подтверждает образование продукта (рис. S2†). Отдельно дендример G4-PAMAM-OH (4) подвергали взаимодействию с 5-гексиновой кислотой с использованием реакции этерификации с получением D-YNE (5) (рис. 1B).

Наконец, Tesa-TEG-азид (3) и D-YNE (5) подвергались реакции клик-реакции медно-катализируемого алкинового циклоприсоединения (CuAAC) с образованием D-Tesa (6) (рис. 1B).48 1H ЯМР. подтвердил успешный синтез всех промежуточных продуктов и конечного продукта; D-Tesa (6) содержал характерные пики протонов дендримера и лекарственного линкера, демонстрирующие успешный синтез D-Tesa (рис. 2А).

ЯМР конечного конъюгата D-Tesa показал, что к каждому дендримеру было присоединено в среднем десять молекул Tesa. ВЭЖХ подтвердила успешную ковалентную конъюгацию, поскольку D-Tesa продемонстрировал сдвиг как со стороны D-YNE, так и со стороны TesaTEG-азида (рис. 2B и S1†).

Tesa имеет плохую растворимость в воде, которая, по оценкам, составляет 0,0035 мг/мл-1,49. Конъюгация Tesa с онгидроксильным дендримером улучшила его растворимость в воде на несколько порядков по сравнению с этой оценкой. Растворимость D-Tesa в воде составляла 22 мг/мл, а поскольку Tesa составляет ~19% массы D-Tesa, было солюбилизировано 4,2 мг/мл эквивалента Tesa (рис. 3А).

Повышенная растворимость, обеспечиваемая дендримером, упрощает составление рецептуры и устраняет необходимость в потенциально токсичных наполнителях.50 Все эти преимущества дополняют превосходную способность дендримера доставлять свободные лекарства через ГЭБ в микроглию in vivo и потенциально снижать доза, необходимая для достижения терапевтического эффекта. 18–28 Наконец, средний размер D-Tesa составлял 7,75 ± 0,29 нм (рис. S3†) и зета-потенциал 2,86 ± 0,38 мВ. (измерение N=5 и N=3 соответственно).

Выпуск лекарств

Мы разработали D-Tesa для высвобождения Tesa внутриклеточно в среде с низким pH и высокой концентрацией эстеразы в эндосомах/лизосомах активированной микроглии. Ранее мы сообщали, что дендримеры PAMAM в основном проникают в клетки посредством жидкофазного эндоцитоза, а везикулы, содержащие конъюгаты, трансформируются в лизосомы.51

Мы инкубировали D-Tesa при 37 градусах в натрий-цитратном буфере (рН 5,5) в присутствии эстераз, чтобы имитировать условия лизосом, как это было выполнено ранее.52–54 Мы также исследовали высвобождение в условиях, имитирующих условия плазмы (фосфатно-солевой буфер [PBS] ] буфер, рН 7,4).

В условиях плазмы только около 1,5% Tesa высвобождается через 48 часов и менее 20% Tesa высвобождается к 25-му дню, что указывает на стабильность конъюгата в плазме (фиг. 3B).

В лизосомальных условиях около 60% Tesa высвобождается из D-Tesa в течение первых 48 часов, а в течение 19 дней высвобождается почти 100% Tesa. Эти результаты демонстрируют, что D-Tesa обеспечивает замедленное инициируемое высвобождение свободного лекарственного средства в течение первых двух недель инкубации в физиологически значимых лизосомальных условиях.

Кроме того, минимальное высвобождение Tesa в моделируемых условиях плазмы (группа с pH 7,4) в течение первых 48 часов является значительным, поскольку это типичное время циркуляции G4-PAMAM-OH до почечного клиренса, поэтому минимальное количество Tesa, вероятно, будет высвобождаться из конъюгаты до того, как они достигнут микроглии.24

D-Tesa снижает экспрессию маркеров M1 и увеличивает маркеры M2.

Чтобы оценить способность D-Tesa вызывать сдвиг фенотипа M1 на M2, мы оценили способность D-Tesa изменять экспрессию маркеров M1 и M2 in vitro, используя линию клеток микроглии мышей (BV2).

Клетки BV2 были созданы путем иммортализации мышиных микроглиальных клеток и оказались подходящей альтернативой первичным клеткам микроглии для изучения воспалительной реакции микроглии.55,56 В наших экспериментах, чтобы имитировать нейровоспалительную среду, присутствующую при многих неврологических заболеваниях, мы предварительно обрабатывали микроглию 100 нг мл-1 (300 эндотоксиновых единиц (ЕС) на мл) ЛПС в течение 3 часов.

Затем мы совместно обрабатывали клетки ЛПС и свободным Tesa или D-Tesa в течение 48 часов, а затем собирали образцы. Мы обрабатывали клетки концентрациями 1,5, 15 и 150 мкМ свободного Tesa или D-Tesa на эквивалентной лекарственной основе.

Анализ МТТ показал, что свободный Tesaor D-Tesa в этих концентрациях не вызывает цитотоксичности (рис. S4†). Первоначальное исследование по подбору дозы было проведено с использованием Tesa и D-Tesa, чтобы определить наиболее эффективную дозу Tesa и D-Tesa.

Обработка 1,5 и 15 мкМ свободными Tesa и D-Tesadid не изменяла секрецию оксида азота или TNF-, что определялось с помощью реагента Грисса и TNF-ELISA соответственно (рис. S5†). Основываясь на этих результатах, мы не анализировали эти более низкие концентрации в наших анализах qRT-PCR.

При многих нейродегенеративных заболеваниях одной из основных нейротоксических функций провоспалительной микроглии М1 является секреция ими активных форм кислорода (например, оксида азота), которые непосредственно убивают нейроны.57,58 Впоследствии было высказано предположение, что одной из потенциальных терапевтических стратегий может быть снижение секреции этих молекул.

Мы оценили способность D-Tesa достичь такого эффекта. После стимуляции ЛПС D-Tesa снизил уровни секретируемой оксида азота и индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) в 3,7- раза (p < 0.0001) и 2- раза (p {{ 7}}.011), соответственно, по сравнению с клетками, обработанными только ЛПС (только ЛПС) (рис. 4А и В).

С другой стороны, свободный Tesa снижал секретируемый оксид азота более умеренно (в 1,4-раз, p= 0.004) и не приводил к значительному снижению экспрессии мРНК iNOS (рис. 4А и Б). ).

D-Tesa был гораздо более эффективен, чем свободный Tesain, подавляя секрецию оксида азота. Далее, в зависимости от того, находится ли микроглия в фенотипе M1 или M2, микроглия активирует либо iNOS, либо аргиназу 1 (Arg1) для метаболизма L-аргинина с образованием оксида азота для реакции уничтожения патогенов M1, орнитина и мочевины для реакции заживления ран M2 соответственно. 59

В соответствии с подавлением iNOS, D-Tesa повышал уровни мРНК Arg1 в 2- раза (p=0.011) по сравнению с контролем, содержащим только LPS, в то время как свободный Tesa не увеличивал экспрессию существенно (p=0 .40) (рис. 4В).

D-Tesa и, в меньшей степени, свободная Tesa, переключили микроглию с высвобождения цитотоксичного нитриоксида на метаболизм L-аргинина для заживления ран, что приводит к уменьшению и потенциальному обращению вспять нейротоксичности, вызванной микроглией при нейродегенерации.5–7,10

Снижение уровня iNOS и секретируемого оксида азота при лечении D-Tesa является результатом предыдущей работы, которая продемонстрировала, что природный лиганд PPAR (15-дезокси-Δ12,14-простагландин J2) снижает экспрессию и секрецию iNOS и оксида азота у пациентов, получавших ЛПС. первичная микроглия.60

IL-10, IL-4 и TGF- 1 — все это цитокины, которые секретируются альтернативно активированной микроглией М2 и могут индуцировать нейропротекторную и противовоспалительную среду в мозге.58,61,62В направлении с этой целью D-Tesa увеличила экспрессию IL-105.5-крата (p=0.011) и IL-4 8.2-крата (p { {15}}.013) по сравнению с контролем, содержащим только ЛПС (рис. 4D и E).

Бесплатная версия Tesa не привела к существенному увеличению уровней IL-10 или IL-4, хотя средние значения составляли 1,7-раз (p=0,066) и 2,{{7} } раз (p=0.11) выше, соответственно, для микроглии, обработанной Tesa, по сравнению с контролем, содержащим только LPS (рис. 4D и E). Кроме того, D-Tesa увеличивал экспрессию TGF- 1 2.3- раз (p=0.015), а свободный Tesa существенно не менял экспрессию (фиг. 4F).

Таким образом, D-Tesa индуцирует секрецию противовоспалительных цитокинов после лечения микроглии ЛПС, что может смягчать нейротоксическую и провоспалительную среду, присутствующую при нейродегенеративных заболеваниях.5–7,10

D-Tesa-индуцированная экспрессия маркеров подтипа M2-

CD206, Ccl1 и TLR8 являются специфическими маркерами подтипов микроглии M2a, M2b и M2c соответственно.58 D-Tesa усиливает экспрессию CD206 4.{{10 }}кратно (p < 0,001), Ccl1 3.5-кратно (p < 0,005) и TLR8 5-кратно (p < 0,01), в то время как свободный Tesa существенно не увеличивал экспрессию любой из этих трех маркеров (рис. 5А–С).

Эти данные показывают, что микроглия, обработанная D-Tesa, демонстрирует значительную активацию маркеров всех трех подтипов M2, что согласуется с пониманием того, что фенотип микроглии является пластичным, а не бинарным.63–65

Номенклатура M1/M2 чрезмерно упрощает сложность того, что микроглия может существовать в спектре состояний активации; вдоль этого континуума были охарактеризованы три различных фенотипа M2 (M2a, M2b и M2c), и D-Tesa индуцирует экспрессию маркеров, соответствующих каждому из этих состояний.58,61,63,66,67 Микроглия M2a участвует в повышенном фагоцитозе патогенных белки путем активации рецепторов-поглотителей, восстановления тканей и противовоспалительного действия.

Микроглия M2b подобна микроглии M1 тем, что они экспрессируют IL-1, TNF- и IL-6; однако M2b отличается от микроглии M1 тем, что они экспрессируют IL-10 на высоких уровнях и подавляют экспрессию iNOS. Макрофаги M2b и микроглия стимулируют Th2 Т-клетки, что свидетельствует об одной из ролей M2b в индукции противовоспалительного ответа.

M2cмикроглия участвует в заживлении ран, ремоделировании тканей, секвестрации железа и активации STAT3, что снижает провоспалительную передачу сигналов. оба являются маркерами M2a. 58D-Tesa увеличила экспрессию PPAR в 2,3-раза (p=0.0036) и STAT6 3.4- раза (p < 0,001), тогда как свободный Tesa увеличил STAT6 1.8-раз (p=0.011) без значительного увеличения экспрессии PPAR (увеличение в 1,58-крата, р=0.17) (рис. 5Г и Е).

Повышенная экспрессия STAT6 и PPAR приводит к выработке противовоспалительных генов и ингибированию провоспалительных сигналов за счет ингибирования активности NF-κB. Поскольку микроглия M2a может быть индуцирована путем обработки микроглии IL-4, который передает сигналы через STAT6 и PPAR, усиление этих двух нижестоящих сигнальных белков может привести к прямой поляризации M2a.68

В наших анализах активация ЛПС повышала уровни IL-6, TNF- и IL-1, а лечение D-Tesa дополнительно повышало экспрессию этих цитокинов (рис. S6A–D†), что, вероятно, из-за D-Tesa, индуцирующего фенотип M2b (рис. 5Б).

Свободный Tesa увеличивал экспрессию IL-6 и существенно не изменял экспрессию TNF- и IL-1 (рис. S6A–D†). Хотя эти цитокины секретируются микроглией M1, микроглия M2b также экспрессирует эти цитокины.58,61 CD86 является маркером микроглии как M1, так и M2b, и его уровень увеличивается при лечении D-Tesa (рис. S6E†).

Кроме того, супрессор передачи сигналов цитокинов (SOCS) представляет собой семейство внутриклеточных белков, которые регулируют фенотипическую поляризацию микроглии путем подавления нескольких сигнальных путей, активируемых цитокинами.69 SOCS1 является одним из членов этого семейства, и было показано, что он ингибирует LPS/TLR4. опосредует передачу сигналов NF-κB и JAK2, тем самым снижая количество TNF-, IL-1 и IL-6, высвобождаемых микроглией M1 по пути LPS/TLR4.

D-Tesa усиливает экспрессию SOCS1 по сравнению с контролем, содержащим только LPS (рис. S6F†), что позволяет предположить, что увеличение IL-6, TNF- и IL-1, проявляемое D-Tes, может быть связано с индукцией Фенотип M2b, а не за счет усиления LPS/TLR4, фенотипа, индуцирующего M1-.

Более того, ЛПС сигнализирует через TLR4 и для предотвращения чрезмерной клеточной активации микроглия обладает механизмом отрицательной обратной связи, при котором активация TLR4 приводит к снижению экспрессии TLR4.70

Лечение свободным Tesa и D-Tesa повышало уровни TLR4 в 3,6-раза (p < 0.001) и 3,7-раз (p < 0,001) соответственно. (Рис. 5F), что позволяет предположить, что Tesa и D-Tesa изменили типичный сигнальный путь отрицательной обратной связи LPS/TRL4.

For more information:1950477648nn@gmail.com