Определение эхинакозида в водном экстракте Cistanche Herba методом ВЭЖХ

Сюй Шаньшань1 ,У Канюй2 ,ТУ Синмин2 （1. Третий клинический медицинский колледж Гуанчжоуского университета китайской медицины., Гуанчжоу 510405 Гуандун, Китай; 2. Третья дочерняя больница Университета китайской медицины Гуанчжоу.,Гуанчжоу 510378 Гуандун,Китай） 

Абстрактный: Цель Метод ВЭЖХ был разработан для определенияЭхинакозидв водной вытяжке Cистанче пустыникола. МетодыЭхинакозид определяли с помощью ВЭЖХ. Разделение проводили на Inertsil ODSSP C.18 колонка с подвижной фазой состояла из ацетонитрила（A）и 0,4% раствор фосфорной кислоты（B）,градиентным элюированием. Длина волны обнаружения была установлена ​​на 333 нм.,и температура колонки составляла 30 градуса. Скорость потока составляла 1,0 мл·мин.-1 объем инъекции 10 мкл.Полученные результатыЛинейная зависимость эхинакозида в диапазоне концентраций 44,939 7-539.276 4 мкг·мл- 1 было хорошо（r = 0.999 8）. Извлечение составило 94,59 процента -105,31 процента.（РСД= 2,93%,n = 9）. Содержание эхинакозида в водных экстрактах травы цистанхе составило 15,527 г.,7.347,12,267 мг·г-1 . 

Заключение: Известный метод ВЭЖХ с хорошей воспроизводимостью является точным,просто и осуществимо. Подходит для определения эхинакозида в водном экстрактеЦистанхе пустынная ма. 

Ключевые слова:ВЭЖХ;водный экстракт изЦистанхе пустынная;Эхинакозид;определение содержания

Цистанхе пустыннаяявляется широко используемым тонизирующим средством в традиционной китайской медицине в клинической практике и имеет репутацию "пустынный женьшень". Цистанхе пустынная, включенная в издание Китайской фармакопеи 2015 года, представляет собой высушенный, чешуйчатый, мясистый стебель растения Orobaceae Cistanche Deserticola YC Ma или Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Он имеет теплую природу, сладко-соленый вкус и относится к меридианам почек и толстой кишки. Обладает эффектом тонизирующего Ян почек, благотворно влияет на эссенцию и кровь, увлажняет кишечник и избавляет от запоров. [2]. 

Пустынный женьшень

В «Shennong Materia Medica Classic» говорится, что он может «питать середину, питать пять внутренних органов, укреплять инь и питать сущность».Цистанхе пустынная в основном содержит фенилэтаноидные гликозиды, иридоиды и гликозиды, лигнаны и гликозиды, полисахариды, сложные эфиры и алкалоиды [3].Фенилэтанолгликозидыявляются основными активными компонентамиЦистанхе пустынная, среди которых эхинацея и пулсайд являются индикаторными компонентами для идентификации и определения содержания цистанхе пустынной в Китайской фармакопее.. 

Гликозид фенилэтанола является основным активным компонентом Cistanche Deserticola.

Фармакологические исследования [4] свидетельствуют о том, что Цистанхе пустыннаяобладает различными фармакологическими эффектами, такими как увлажнение кишечника и устранение запоров, защита печени, противодействие остеопорозу, антиоксидантное, омолаживающее и антиусталостное действие. Водный экстрактЦистанхе пустыннаяможет стимулировать гены костного морфогенетического белка 2 остеобластов у крыс, а также устойчивую к тартрату кислую фосфатазу и остеокальцин в сыворотке мышей после овариэктомии., а также генов Smad1 и Smad5 и трансформирующих факторов роста в костном мозге.антиостеопорозный эффект [5-6]. Эхинозид может способствовать пролиферации остеобластов и способствовать дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в остеобласты in vitro[7-9]. 

Эхинозид, основной химический компонент цистанхе пустынной.

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Natural Cistanche Echinacoside

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

В последние годы появилось много сообщений об определении содержания эхинакозида и пулзида в спиртовом экстракте цистанхе пустынной и его составных препаратах [10-12], но мало сообщений об определении содержания индикаторные компоненты в водной вытяжке цистанхе пустынной. В данном исследовании для определения содержания эхинакозида в водном экстракте цистанхе пустынной использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

1. Материал

1.1 Аппарат

Высокоэффективная жидкостная хроматография LC-20AT, детектор SPD-20A, автоматический пробоотборник SIL-20A, термостат колонки CTO-10ASvp, рабочая станция жидкостной хроматографии LCsolution, Shimadzu Corporation Японии; Электронные аналитические весы MES125P-OCE-DU, Sartorius, Германия; Многоцелевой вакуумный насос циркуляционной воды SHZ-D (III), Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 система охлаждения роторного испарителя, роторный испаритель RV10DS96, IKA, Германия; Электрическая термостатическая водяная баня DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Машина для сверхчистой воды серии UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Лекарственные материалы и реактивы

Лекарственный материал Meat Rong, приобретенный у компании Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., номер партии: 18010011806001, 181001. Высушенные, чешуйчатые, мясистые стебли растения Leobaceae Cistanche Deserticola, идентифицированные главным китайским травником Ту Синмином из Третьего филиала Больница Университета традиционной китайской медицины Гуанчжоу хранится в комнате для осмотра лекарств Третьей дочерней больницы Университета традиционной китайской медицины Гуанчжоу; Эталонное вещество эхинозид, содержание 89,7%, Китайский институт контроля пищевых продуктов и лекарственных средств, номер партии: 111670-201706; Ацетонитрил хроматографически чистый (Merck, Германия); Метанол и фосфорная кислота аналитически чистые (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Вода – это сверхчистая вода.

2. Методы и результаты

2.1 Приготовление водного экстракта из цистанхе пустынной

Возьмитепорошок цистанхе, добавьте 10 количество дистиллированной воды, нагревайте и кипятите с обратным холодильником для экстракции дважды, каждый раз в течение 1 часа. Фильтруют, объединяют фильтрат и используют роторный испаритель для концентрирования фильтрата до содержания неочищенного лекарственного средства 0,100 г · мл-1. Хранить при температуре 4 градуса в режиме ожидания. 2.2 Хроматографические условия и пригодность системы Хроматографическая колонка: колонка InertsilODS SPC18 (150 мм × 4,6 мм, 5 мкм); подвижная фаза: ацетонитрил (A) - 0,4% раствор фосфорной кислоты (B), градиент элюирования: 0~ 5 мин, 17% А; 5~25 мин, 20% А; 25~30 мин, 17% А; Длина волны обнаружения: 333 нм; Температура колонки: 30 градусов; Скорость потока: 1,0 мл · мин-1; Объем впрыска: 10 мкл. В этих хроматографических условиях разрешение между пиками эхинацеи и соседних компонентов больше 1,5, а теоретическое число колонок для пиков эхинацеи должно быть не менее 4000. Хроматограмма показана на рисунке 1.

Рисунок 1. Хроматограммы ВЭЖХ эхинакозида (А) и водного экстракта травы цистанхе (В)

2.3 Приготовление раствора

2.3.1 Эталонный раствор

Взвесьте необходимое количествоЭхинацетинэталонного вещества, точно взвесьте его, поместите в мерную колбу на 10 мл, добавьте метанол для растворения и сделайте так, чтобы он содержал 898,794 эхинацетина на миллилитр мкг эталонного раствора, хранящегося при 4 градусах в режиме ожидания.

Эхинозид цистанхе пустынной

2.3.2 Тестовый раствор

Точно отмерить 2,0 мл водного экстракта цистанхе пустынной, выпарить на водяной бане, растворить в метаноле, довести до постоянного объема в мерной колбе вместимостью 1{3}} мл, хорошо встряхнуть, 0,22 мкМ микропористого мембранная фильтрация, а именно.

2.4 Исследование линейной зависимости

Точно измерить {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, и 3,00 мл эталонного раствора согласно 2.3.1 и помещают их в мерную колбу на 5 мл, добавляют метанол до постоянного объема и хорошо встряхивают, чтобы получить градиенты концентраций 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 449,3970. , и 539,2764 мкГ·мл-1 раствора сравнения, 0,22 мкМ Фильтрация через микропористую мембрану. Проведите определение в соответствии с хроматографическими условиями, указанными в 2.2, и запишите площадь пика. Используя массовую концентрацию эталонного вещества в качестве оси абсцисс (X, мкг·мл-1), площадь пика представляет собой ординату (Y), и получают уравнение линейной регрессии: Y=13185. 0X-32273.0, г=0.9998. Результаты показали, что эхинацея находится в диапазоне от 44,9397 до 539,2764 мк. Линейная зависимость в диапазоне концентраций г · мл-1 является хорошей.

2.5 Проверка точности

Берут 539,2764 мкг·мл -1 эталонного раствора, непрерывно вводят образец 6 раз в соответствии с условиями хроматографии в 2.2 и записывают площадь пика. Результаты. ОСО площади пика эхинацеи составило 1,81%, что свидетельствует о хорошей точности прибора.

2.6 Испытание на стабильность

Точно измерьте 2,0 млЦистанхе пустыннаяводного экстракта, выпаривают досуха на водяной бане, растворяют в метаноле, доводят до постоянного объема в мерной колбе вместимостью 10 мл, хорошо встряхивают, фильтр 0.22 мк с микропористой мембраной, вводят пробы для определения через 0, 2, 4, 8, 12 и 24 часа в соответствии с хроматографическими условиями, указанными в 2.2, и записывают площадь пика. Результаты. ОСО площади пика эхинацеи составило 1,16%, что свидетельствует о хорошей стабильности тестируемого раствора в течение 24 часов.

2.7 Испытание на повторяемость

Точно отмерьте 6 порций 2,0 мл водногоэкстракт цистанхе пустынной, готовят параллельно 6 порций испытуемого раствора по методу, описанному в 2.3.2, вводят пробы для определения в соответствии с хроматографическими условиями, описанными в 2.2, и записывают площадь пика. Результаты ОСО массовой концентрации эхинацеи составило 1,28%, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости метода.

Цистанхе пустынная эксперимент

2.8 Тест восстановления с добавлением пробы

Точно отмерьте 9 порций по 1,0 млЦистанхе пустыннаяводного экстракта, добавляют {{0}}.8, 1.0 и 1,2 мл раствора сравнения (101,552 мг·мл - 1), выпаривают на водяной бане, растворяют в метанол и доводят до объема в мерной колбе мл; Хорошо встряхните, фильтр 0,22 мкм с микропористой фильтрующей мембраной для приготовления тестового раствора с высокой, средней и низкой концентрацией. Параллельно готовят 3 части каждой концентрации, измеряют в соответствии с хроматографическими условиями, указанными в 2.2, записывают площадь пика и рассчитывают восстановление привыкания к образцу. Результаты представлены в таблице 1.

2.9 Определение содержания пробы

Точно отмерьте 3 порции по 2,0млводный экстракт цистанхе пустынной, выпаривают досуха на водяной бане, растворяют в метаноле, доводят до постоянного объема в мерной колбе вместимостью 1 мл, хорошо встряхивают, фильтр 0,22 мкм с микропористой мембраной, измеряют по хроматографическим условиям 2.2, запишите площадь пика и рассчитайте содержание эхинацеи. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 1. Результаты испытаний на восстановление эхинакозида

Таблица 2 Результаты определения содержания эхинакозида в водном экстракте травы цистанхе

3.Обсуждение

3.1 Метод приготовления испытуемого изделия

Водный экстрактЦистанхе пустыннаясодержит различные химические компоненты, такие как фенилэтанолгликозиды и полисахариды, которые вызывают определенное взаимодействие с тестируемыми компонентами. В этом исследовании изучались две разные концентрации растворителей: 50-процентный метанол и метанол. Результаты показали, что эффект разделения пиков на хроматограмме испытуемого продукта с использованием 50-процентного метанола в качестве растворителя был слабым между эхинацеей и соседними компонентами; При использовании метанола в качестве растворителя разрешение пика гликозида эхинацеи хорошее, и отсутствуют помехи от пиков других примесей. Поэтому в качестве растворителя для исследуемого раствора был выбран метанол. Используя метанол в качестве растворителя, водный экстракт цистанхе пустынной выпаривали досуха на водяной бане. Использовали два метода обработки: растворение в метаноле, встряхивание при постоянном объеме и ультразвуковое (10 мин) растворение в метаноле. Результаты показали, что существенной разницы между двумя методами нет. Этот метод был выбран для приготовления испытуемого раствора из-за простой операции растворения метанола и встряхивания постоянного объема.

Цистанхе китайская трава

3.2 Выбор подвижной фазы

В этом исследовании была сделана ссылка на подвижную фазу (метанол -0,1% муравьиной кислоты), используемую для определения содержания цистанхе пустынного в Китайской фармакопее (том I) (2015 г.). Результаты показали, что пик гликозида эхинацеи расширился и появился феномен переднего края, что может быть связано со слабой элюирующей способностью подвижной фазы; Ссылаясь на соответствующую литературу [12-13], в качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил-0,5% уксусной кислоты, но форма пика эхинацеи была плохой, и наблюдалось явление хвоста. Принимая во внимание значение рН подвижной фазы, в качестве подвижной фазы в конечном итоге использовали ацетонитрил-0,4% фосфорной кислоты. В результате теоретическое количество пиков эхинацеи на чашке превышало 4000, а разрешение пиков эхинацеи и смежных компонентов превышало 1,5. Форма пика была симметричной, без помех от примесных пиков, а базовая линия была стабильной. Поэтому в этом исследовании в качестве хроматографической подвижной фазы для определения содержания эхинацеи использовали ацетонитрил - 0,4% фосфорной кислоты. В этом исследовании,метод ВЭЖХ использовали для определения эхинацеи в водном экстракте цистанхе пустынной.

Порошок экстракта цистанхе

Метод прост, точен и воспроизводим. Он подходит для определения эхинацеи в водном экстракте цистанхе пустынной и может использоваться в качестве метода контроля качества водного экстракта цистанхе пустынной.В этом исследовании определялось только содержание эхинацеи в водном экстракте цистанхе пустынной.В будущем,планируется определить содержание эхинацеи в составном отваре цистанхе пустынной, изучить влияние различных факторов на содержание эхинацеи, предоставить эталон для контроля качества отвара, содержащего цистанхе пустынной.

ссылка:

[1] Женьшень и цистанхе пустыни Чжун Пин [J] Лес и люди, 2004, 24 (11): 25

[2] Фармакопея Национальной фармакопеи Китайской Народной Республики (Часть I) [M] Пекин: China Medical Science and Technology Press, 2015: 135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei, et al. Ход исследований Cistanche Deserticola [J] Исследование по оценке лекарств, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Фан Цзянь Успехи в фармакологических исследованиях цистанхе пустынного [J] Традиционная китайская медицина Гуанмин, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Влияние водного экстракта цистанхе пустынной на экспрессию гена костного морфогенетического белка 2 в остеобластах крыс [J] China AnimalЖивотноводство и ветеринария, 2013, 40 (1): 17-21

[6] ЛЯН Х, Ю Ф, ТОНГ З и др. Водный экстракт травы цистанков, влияющий на уровень экспрессии BGP и TRAP в сыворотке крови и мРНК Smad1, мРНК Smad5, мРНК TGF- 1 и мРНК TIEG1 в костном мозге при остеопорозе[J]. Отчеты по молекулярной биологии, 2013 г., 40 （2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming и др. Наблюдение за эхинозидом, стимулирующим пролиферацию остеобластов крыс путем активации сигнального пути ERK/BMP-2 [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Тянь Юань Исследование дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в остеобласты, индуцированной эхиназидом, и ее механизм [D] Шэньян: Ляонинский университет традиционной китайской медицины, 2015 г.

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan и др. Исследование индуцированной эхинозидом дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в остеобласты [J] Фармакология и клиника традиционной китайской медицины, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie и др. Определение содержания эхинозидов и пилозидов в микропорошке Cistanche Deserticola с помощью ВЭЖХ [J] Сельскохозяйственный университет Аньхой, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Ян Судэ, Ху Цзюньхуа, Ли Цзячунь и др. Одновременное определение эхинозида, пилозида и изопилозида в капсулах гликозида цистанхе с помощью ВЭЖХ [J] Мировая наука и технологии – Модернизация традиционной китайской медицины, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Сюй Сяосюэ. Фармакодинамические и метабономические исследования антиостеопоротических эффектов цистанхе пустынного и его эффективных компонентов [D] Иньчуань: Медицинский университет Нинся, 2017 г.

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan и др. Определение эхинозидов и пилозидов в пероральной жидкости Qirong Runchang с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892