Воздействие дизельных выхлопов изменяет экспрессию сетей, участвующих в нейродегенерации в мозге рыбок данио. Часть 2

Подготовка проб белка

Для приготовления образцов белка головы от 80 до 100 анестезированных личинок (5 pdf) тщательно изолировали и промывали PBS перед переносом в буфер для лизиса, который состоял из 15% предварительно охлажденной ТСА/ацетона, содержащего 0,07% бета-меркаптоэтанола (МЭ). ) и коктейль ингибиторов протеаз (необходим производитель) в общем объеме 500 мкл.

В последние годы наблюдается значительный интерес к влиянию образцов белка на память. Все больше и больше людей начинают осознавать важность диеты для здоровья, особенно важную роль белка в организме человека.

Белки являются основным строительным материалом человеческого организма и играют важную роль в организме человека. Из-за этого образцы белка стали важным каналом для многих людей в их стремлении к здоровью и красоте. Помимо наращивания мышечной массы и формирования фигуры, образцы белка также могут улучшить память человека.

Некоторые ученые изучали взаимосвязь между белками и памятью. Они обнаружили, что длительное потребление достаточного количества белка полезно для всех аспектов физического здоровья, особенно для памяти. Появляется все больше доказательств того, что потребление белка с пищей оказывает важное влияние на функцию мозга и память.

Белок является важным компонентом нейронов человеческого мозга, поэтому ежедневное потребление белка оказывает важное влияние на память и мыслительные способности человека. Длительное потребление белка не только удовлетворяет потребности организма в белке, но также помогает мозгу оставаться активным и здоровым.

Кроме того, белок также может помочь организму поддерживать баланс сахара в крови и поддерживать стабильное настроение. Это очень важно для поддержания памяти и мышления. Таким образом, умеренное потребление белка может помочь улучшить различные когнитивные функции и эмоциональное состояние организма человека.

В целом существует тесная связь между образцами белка и памятью. Увеличение потребления белка помогает сохранить здоровье мозга и тела, улучшает мыслительные способности и память. Людям, которым необходимо улучшить память, очень важно потреблять соответствующее количество белка. Нам следует правильно питаться белковой пищей и уделять внимание разумному питанию, чтобы сохранить здоровое тело и острый ум. Видно, что нам необходимо улучшить память, а Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola обладает антиоксидантным, противовоспалительным и омолаживающим действием, что может помочь уменьшить окислительные и воспалительные реакции в мозге, тем самым защищая здоровье нервной системы. Кроме того, Cistanche Deserticola может также способствовать росту и восстановлению нервных клеток, тем самым улучшая связь и функцию нейронных сетей. Эти эффекты могут помочь улучшить память, скорость обучения и мышления, а также предотвратить развитие когнитивной дисфункции и нейродегенеративных заболеваний.

Нажмите «Знайте добавки для улучшения памяти»

После кратковременной гомогенизации белки осаждали в течение 12 часов при 20 градусах с последующим центрифугированием при 12000 об/мин в течение 5 минут при 4 градусах. Супернатант удаляли, а белковый осадок дважды промывали холодным ацетоном (содержащим 0.07% коктейли ME и ингибитора протеазы). Конечный белковый осадок растворяли в буфере для лизиса, содержащем 7,0 М мочевины. и 2,0 М тиомочевины путем обработки ультразвуком на льду.

Образцы солюбилизированного белка центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 минут при 4 градусах для осаждения нерастворимых частиц, а концентрацию конечных образцов белка измеряли с использованием метода Брэдфорда.

Высокопроизводительный протеомный анализ на основе ТМТ

Образцы восстанавливали, алкилировали и расщепляли последовательным добавлением трипсина и протеаз lys-C. Затем пептиды метили с использованием изобарических меток 10-plexTMT в соответствии с инструкциями производителя. Меченые образцы смешивали и затем тонко фракционировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии с высоким pH.

Затем отдельные фракции были проанализированы методом ЖХ-МС/МС с использованием онлайн-хроматографии с обращенной фазой и тандемной масс-спектрометрии на масс-спектрометре Thermofsher Fusion Lumos. Данные были получены с использованием метода MS3 на основе синхронного отбора прекурсоров, как описано ранее (McAlister et al. 2014). Поиск в базе данных и извлечение информации о репортерных ионах ТМТ осуществляли с использованием программной платформы MaxQuant (Cox and Mann 2008).

Сравнение данных ТМТ в образцах проводили с использованием MSStats (Choiet al. 2014). Транскриптомный анализ. Приблизительно 80–100 голов были выделены из анестезированных эмбрионов (120 часов), промыты PBS и подвергнуты экстракции тотальной РНК с использованием Trizol (Sigma Aldrich, Сент-Луис). , США) реагент, следуя инструкциям производителя.

Качество и количество РНК оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop2000 (Thermo Scientific, Массачусетс) и далее с помощью биоанализатора Agilent 2100, чтобы гарантировать минимальную концентрацию 50 нг/мл и число целостности РНК (RIN) 8. Затем осуществляли подготовку библиотеки с использованием Illumina HiSeq4000 в соответствии с протокол: «Рабочий процесс подготовки библиотеки тотальной РНК TruSeqStranded с Ribo-Zero Gold», и образцы секвенировали в следующих условиях: «Парный конечный цикл, циклы R1=75 (антисмысловая цепь), циклы индекса=8, R2=75 циклов (смысловая цепь)».

Анализ данных

Оба набора данных для протеомных и транскриптомных исследований были одновременно загружены и проанализированы с помощью онлайн-инструмента Metascape, который позволяет аннотировать гены для различных видов, включая Danio rerio (Zhou et al. 2019). Чтобы оценить вклад изменения профиля протеома или транскриптома в конкретных путях, данные были анализировались с помощью программного обеспечения Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

В приложение были загружены наборы данных, содержащие идентификаторы генов или белков и соответствующие значения экспрессии. Каждый идентификатор был сопоставлен с соответствующим объектом в базе знаний Ingenuity.

Порог изменения экспрессии в 1,3- раз был установлен для идентификации молекул, экспрессия которых регулируется дифференциально. Функциональный анализ выявил биологические функции и/или заболевания, которые были наиболее значимыми для набора данных. Для анализа рассматривались молекулы из набора данных, которые соответствовали пороговому значению и были связаны с биологическими функциями. Точный критерий Фишера с правым хвостом использовался для расчета значения p, определяющего вероятность того, что каждая биологическая функция и/или заболевание, отнесенное к этому набору данных, обусловлены исключительно случайностью.

Анализ пути

Чтобы оценить вклад изменений профиля протеома или транскриптома в конкретные пути, оба набора данных были загружены в программное обеспечение IPA (Krämer et al. 2014). Затем наиболее существенные измененные канонические пути были дополнительно оценены и интерпретированы с использованием ПЦР и вестерн-блоттинга, как описано ниже.

Вестерн-блоттинг

Всего 25 мкг белков было загружено в 12% NuPAGE (Novex, Калифорния) и перенесено на PVDF-мембраны (Novex, Калифорния), как описано (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе и 0,01% Твин 20 (буфер TBST) в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем инкубировали в течение ночи при 4 градусах либо с кроличьим поликлональным анти-Cyp1A1 (Abcam, Калифорния), либо с мышиным моноклональным анти-GAPDH ( Абкам, Калифорния), разведенный в буфере TBST, содержащем 1% обезжиренного молока.

После промывки в TBST блоты инкубировали со вторичными антителами осла против кроличьего HRP (Abcam, Калифорния) или козы против мышиного HRP (Санта-Круз, Калифорния) в течение 2 часов с последующей проявкой с использованием субстрата для вестерн-блоттинга Pierce™ ECL Plus Thermo Fisher Scientific, США). Полосы визуализировали путем визуализации с использованием сканера LI-COR и анализировали с помощью денситометрии (LI_COR Biosciences, NE).

ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли из голов с использованием реагента TRIzol (Sigma Aldrich, Сент-Луис, США) в соответствии с инструкциями производителя, а затем измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Массачусетс). 1 мкг каждого образца РНК подвергали обратной транскрипции с использованием супермикса обратной транскрипции iScript™ (Bio-Rad, Калифорния) и проводили ПЦР в реальном времени с использованием супермикса SsoAdvancedUniversal SYBR Green (Bio-Rad, Калифорния), праймеры перечислены. в дополнительной таблице 1. Относительные уровни экспрессии рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCT, а для оценки значимых различий использовали статистический Т-тест.

Результаты и обсуждение

Протеомный и транскриптомный анализы являются двумя основными инструментами для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе процессов заболевания и реакции на раздражители окружающей среды (Дуан и др., 2017; Гарсиа-Эстрада и др., 2013; Джами и др., 2014a, b, 2015; Косалкова и др., 2012). . Здесь мы провели глубокий анализ экспрессии как на транскриптомном, так и на протеомном уровнях в головках эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию DEPe.

Головы, состоящие в основном из ткани головного мозга, были изолированы, чтобы исключить профили экспрессии других тканей, поскольку мы заинтересованы в определении внутренних патологических путей ЦНС.

Профиль экспрессии головок рыбок данио

Профильный анализ выявил 11 172 обнаруженных белка и 14 748 мишеней мРНК из более чем 26 000 кодирующих генов (Howe et al. 2013). Среди 11 172 белков, идентифицированных в образцах, меченных ТМТ (дополнительная таблица 2), 141 белок был значительно повышен, а 607 — понижен (дополнительная таблица 3 и рис. 1a). Аналогично, 367 транскриптов были активированы, а 149 — подавлены среди 14 748 транскриптов (дополнительная таблица 4), обнаруженных при анализе секвенирования РНК (рис. 1b и дополнительная таблица 5).
В большинстве случаев результаты протеомного и транскриптомного анализа с повышенной регуляцией были согласованными. Например, наиболее высокоактивные белки включают цитохром P450 Cyp1a, Cyp1c1, субъединицу гамма-связывающего гуаниннуклеотидного белка, аннексин, короткую изоформу плексина B2b, член дегидрогеназы/редуктазы (семейство SDR), 13-подобный 1, S-антиген сетчатки/шишковидной железы. (аррестин) b и сульфотрансфераза 6B1.

Аналогичным образом, гены с самой высокой транскриптомной регуляцией включают цитохром P450 (Cyp1a), хемокин (мотив C–C), лиганд 27a, репрессор арилуглеводородного рецептора A, цитохром P450 (Cyp1b) и гликопротеин семейства C Rh. С другой стороны, белки и транскрипты с пониженной регуляцией не всегда были тесно взаимосвязаны.

Например, комплексин 2, спектрин альфа, легкая цепь сердечного миозина-1, белок, взаимодействующий с SEC23, субъединица мембраны АТФ-синтазы EA, цитохром b и НАД-зависимая протеиндеацетилаза входят в число белков с высокой степенью подавления регуляции, в то время как мембранный белок 1a наружного сегмента сетчатки , семейство растворенных носителей 5 (переносчик йодида), гомолог B вирусного онкогена остеосаркомы мыши FBJ, комплексин 4c, FOS-подобный антиген 1a, опсин 1 и v-fos демонстрируют наибольшее подавление транскрипции (таблицы 1 и 2).

Антитела, распознающие белки рыбок данио, ограничены, но мы подтвердили выборку этих изменений с помощью вестерн-блот-анализа. Повышающая регуляция белка Cyp1A и понижающая регуляция Комплексина 2 (CPLX2) была подтверждена с использованием GAPDH в качестве контроля нагрузки (рис. 2a). Более высокие уровни транскрипции TAT и UGT1B1 и более низкие уровни CHNRB и TH2 также были подтверждены с помощью кПЦР с использованием Elf-альфа в качестве внутреннего контроля (рис. 2b).

Генная аннотация

Существует несколько онлайн-биоинформатических инструментов и программного обеспечения, которые могут предоставить полезную информацию об аннотации генов. Среди них в этой работе использовался Metascape с возможностью аннотации генов Danio rerio (Zhouet al. 2019).

Оба набора данных для протеомных и транскриптомных исследований были одновременно загружены и проанализированы с помощью этого онлайн-инструмента. После объединения результатов как протеомных, так и транскриптомных изменений в программном обеспечении, несколько процессов, таких как ответ на ксенобиотический стимул, метаболизм ксенобиотиков цитохромом P450 и циркадная регуляция экспрессии генов были обнаружены индуцированными при обработке DEPe (рис. 3а).

Этот анализ также показал подавление уровней биологических процессов, таких как «зрительное восприятие», «фототрансдукция» и «интернализация рецепторов, связанных с G-белком». Изменения в профилях экспрессии, связанных со зрением, не были неожиданными, поскольку лечение DEPe на раннем этапе развития приводило к уменьшению размеров глаз (данные не показаны).

Передача сигналов метаболизма ксенобиотиков

Ксенобиотики, являющиеся чужеродными природными или синтетическими химическими соединениями, могут запускать клеточную стрессовую реакцию, приводящую к дифференцировке, пролиферации, апоптозу или некрозу. Действительно, организму необходимо активно защищаться от ксенобиотиков, а также токсичных эндогенных соединений и их метаболитов посредством экспрессии ферментов и переносчиков, участвующих в их выведении и детоксикации.

Эти ферменты подразделяются на три группы: ферменты фазы I (CYP, ALDH, FMO), которые придают полярность ксенобиотикам; Ферменты фазы II (UGT, GST, SULT), которые придают гидрофильность посредством конъюгации гидрофильных молекул, таких как сульфат, глюкуроновая кислота и глутатион, с ксенобиотиками; и ферменты фазы III (MDR1, OATP2, MRP), которые транспортируют ксенобиотики или конъюгаты, образовавшиеся во время фазы II. во внеклеточную область.

Эти ферменты индуцируются посредством сигнальных каскадов с участием специфических рецепторов (CAR, PXR, AHR) и MAPK-опосредованной активации транскрипционных факторов (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

В отсутствие активаторов конститутивно активный рецептор (CAR) располагается в цитоплазме в виде комплекса с CCRP и HSP90. Но когда активатор присутствует, CAR транслоцируется в ядро ​​и связывается с RXR с образованием гетеродимера, а затем связывается с несколькими вариантами повторяющегося мотива, такими как DR3, DR4, ER6 и ER8, и способствует регуляции экспрессии генов (дополнительная таблица 2).

Протеомный анализ выявил активацию метаболизма ксенобиотиков. Действительно, явная активация CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (гемоксигеназы 1), CAT (каталазы) и CES1 (карбоксилэстеразы 1) свидетельствует об индукции метаболизма фазы I, в то время как повышенная экспрессия UGT1A1 (член A1 семейства UDP-глюкуронозилтрансфераз 1) и GSTP1 ( глутатионS-трансфераза pi 1) указывает на активацию метаболизма фазы II.

Интересно, что подавление сульфаттрансфераз, таких как SULT1A1 (член 1 семейства сульфотрансфераз 1A), SULT1C2 (член 2 семейства сульфотрансфераз 1C) и SULT2B1 (член 1 семейства сульфотрансфераз 2B), предполагает, что повышение гидрофильности в метаболизме фазы II имеет тенденцию преимущественно происходить посредством конъюгации с глюкуроновой кислотой и глутатионом. , а не сульфатная конъюгация (рис. 4).

Результаты транскриптомного исследования вполне согласуются, поскольку CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 и UGT1A1 активируются на уровне РНК. Однако SULT2B1 демонстрирует активацию на уровне РНК (хотя и недостаточно представлен на уровне белка).

Это может быть связано с участием других механизмов, которые вызывают деградацию или инактивацию ферментов сульфаттрансферазы при лечении DEPe. Что особенно удивительно, так это то, что эти изменения в метаболизме ксенобиотиков произошли в головах (предположительно, мозге) рыб. Экспрессия генов ксенобиотиков была описана в нервной системе млекопитающих, но это первое сообщение о них в мозге рыбок данио (McMillan and Tyndale 2018).

Эти результаты согласуются с аналогичным исследованием, проведенным Шанкаром и его коллегами, которые проверяли влияние различных групп полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) окружающей среды на развитие эмбрионов и дополнительно оценивали влияние каждого режима лечения на профиль транскриптома.

На всем теле 48 эмбрионов после оплодотворения (hpf) они показали усиление регуляции Cyp1a как на уровне транскрипции, так и на уровне белка, что является ранним надежным биомаркером активации ксенобиотических AHR и последующих транскриптомных изменений (Shankar et al. 2019).

Реакция на окислительный стресс, опосредованная NRF2-

Окислительный стресс может вызвать апоптоз и некроз, и считается, что он участвует в нейродегенерации (Ахмадинежад и др., 2017; Джами и др., 2014b, 2015). Основным защитным ответом клеток на окислительный стресс является индукция антиоксидантных и детоксифицирующих ферментов.

Фактор 2 (Nrf2), родственный ядерному фактору 2-эритроида, связывается с промотором элементов антиоксидантного ответа (ARE) и активирует их транскрипцию. Неактивный Nrf2 связан с актин-связывающим белком Keap1 и сохраняется в цитоплазме.

Запускаемый окислительным стрессом, Nrf2 фосфорилируется в ответ на пути протеинкиназы C, фосфатидилинозитол3-киназы и MAP-киназы. Фосфорилированный Nrf2 может затем перемещаться в ядро ​​и связываться с AREs, чтобы трансактивировать детоксицирующие и антиоксидантные ферменты (дополнительная таблица 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com