Диетический цистанхе облегчил острое повреждение подвздошной кишки утки

Резюме: Афлатоксин B1 (AFB1) представляет собой стабильный токсический метаболит, угрожающий здоровью человека и животных и широко загрязняющий корма для животных и пищу человека. Настоящее исследование было направлено на изучение влияниядиетическая цистанхео повреждении подвздошной кишки у уток, вызванном введением AFB1, и изучить лежащие в его основе механизмы. Утки (N=450, однодневные самцы) с аналогичным весом были случайным образом разделены на 3 группы, содержащие контрольную группу, группу AFB1 (60 мкг AFB1 кг-1 массы тела) и группу цистанхе (500 мг cistanche кг-1 рациона) плюс группа AFB1. Введение AFB1 заметно увеличивало повреждение подвздошной кишки, аддукты ДНК AFB1- в плазме, а также окислительный стресс и воспаление. Добавление цистанхе в рацион защищало подвздошную кишку от морфологических повреждений, вызванных введением AFB1, уменьшало количество аддуктов ДНК AFB1- в плазме и устраняло окислительный стресс и воспаление в подвздошной кишке уток.анти-окислениеипротивовоспалительное средство эффекты цистанхеможет защитить подвздошную кишку от острого повреждения, активируя сигнальный путь Nrf2-ARE и ингибируя сигнальный путь NF-κB. Окончательно,цистанхебыл диетическимантиокислительныйипротивовоспалительноеагент через активацию сигнального пути Nrf2-ARE и ингибирование острого повреждения сигнального пути NF-κB, вызванного введением AFB1.

Ключевые слова:цистанхе; острая подвздошная кишка; Аддукты ДНК AFB1-; NRF2-ЯВЛЯЕТСЯ;

Нажмите здесь, чтобы купить антивозрастные продукты Cistanche

Попросить больше:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com WhatsApp плюс 86 15292862950

1. Введение

Мясо является важным источником высококачественного белка для питания человека. Утиное мясо в изобилии потребляется во всем мире, особенно в Азии, из-за его желательных питательных свойств [1]. Поэтому разведение уток привлекло внимание людей. Для уток существуют различные недостатки в процессе разведения, такие как AFB1, которые угрожают здоровью уток. Афлатоксин B1 (AFB1) является одним из токсичных метаболитов, продуцируемых видами Aspergillus. AFB1 признан наиболее токсичным среди групп афлатоксинов (AF), наряду с целым рядом токсических эффектов, угрожающих здоровью людей и животных [2].

Для людей или животных продукты питания или корма являются обычным и важным путем воздействия AFB1, но вдыхание и прямой контакт с кожей или слизистыми оболочками также учитываются и не игнорируются [3]. Предыдущие исследования доказали, что AFB1 обладает мощной токсичностью, которая является очень сложной и сильной, что приводит к задержке роста, биологическим порокам развития, токсичности печени, расстройствам пищеварительного тракта и даже раку [4,5]. AFB1, полученный при контакте с пищей или слизистой оболочкой, оказал негативное влияние на дыхательную систему, пищеварительную систему и ткани, а также на показатели роста [3,6,7]. Повреждения тканей и органов, вызванные введением AFB1, связаны с окислительным стрессом и воспалением. При введении AFB1 отмечалось увеличение содержания аддуктов ДНК AFB1- в поврежденном органе [8]. Всасывание и преобразование питательных веществ и токсинов происходит в желудке и тонкой кишке, поэтому

Иммунная система слизистой оболочки кишечника является первой линией защиты организма от повреждений [9]. Функциональность и морфология здорового желудочно-кишечного тракта могут быть нарушены неблагоприятными факторами, такими как токсиканты, бактерии и вирусы [10,11]. AFB1 индуцирует разрушение структуры кишечника, проявляющееся отщеплением эпителиальных клеток в ворсинах тощей кишки и лимфоцитарно-клеточной инфильтрацией в кишечнике кур [12,13]. Изменение функциональности и морфологии может быть связано с процессом метаболизма токсинов, который часто сопровождается воспалением окислительного стресса. Необходимо срочно найти противоядие для снижения и минимизации угрозы AFB1 для людей и животных.

Следовательно, AFB1 является одной из основных проблем в птицеводстве из-за его сильной токсичности. цистанхе — разновидность полифенольного компонента, встречающегося в корневищах куркумы (Curcuma Longa Linn) в качестве функциональной кормовой добавки, используемой в кормах для скота [14], и широко используемой

в качестве зеленой и натуральной пряности, красителя, консерванта и ароматизатора в пищевой промышленности. Экстракты растений, такие как цистанхе, содержащие полифенолы, улучшали иммунитет организма [15]. Цистанхе играет ключевую роль в борьбе с патологическими состояниями и активностью, опосредованными окислительным стрессом, при использовании в качестве терапии для лечения и профилактики хронических заболеваний [16,17]. Клинические испытания показали, что цистанхе не имеет тяжелого токсического или побочного действия, а также обладает антиканцерогенными и антитоксикогенными свойствами, что сделало цистанхе привлекательным химиопрофилактическим средством против КУБ1-индуцированного повреждения тканей [18–20]. Литература продемонстрировала, что цистанхе обладает противовоспалительной, антиапоптозной и антиоксидантной способностью путем активации пути Nrf2/HO-1, усиленной антиоксической способностью устранять воспаление и окислительный стресс в организме, а также устранять 1-вызванные КУМ окислительный стресс [21–25]. Цистанхе подавлял окислительный стресс и образование воспалительных процессов путем активации Nrf2-ARE и ингибирования сигнального пути NF-κB в остаточной почечной недостаточности [26], обладая антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. Кроме того, диетический цистанхе значительно улучшил антиоксидантную способность бройлеров [27] и уток [28]. Не было попыток сопоставить роль цистанхе в сигнальном пути Nrf2-ARE и NF-kB, а также в модели острого введения AFB1 на животных.

Это исследование пролило свет на этот вопрос и предоставило теоретическую основу для использования цистанхе в качестве кормовой добавки для защиты здоровья уток от введения AFB1 и снижения экономических потерь кормовой и племенной промышленности, вызванных загрязнением AFB1.

2. Материалы и методы

2.1. Химикаты

cistanche был приобретен у Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Нанкин, Цзянсу, Китай, CAS: 458-37-7), его чистота составила более 98 процентов по анализу ВЭЖХ. AFB1 (чистота больше или равна 98 процентам, номер CAS 1162-65-8) был приобретен у Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Антитела, используемые в этом исследовании, были приобретены у Bey time Biotechnology, Шанхай, Китай, включая GAPDH (каталожный номер: AG019), Nrf2 (каталожный номер: AF7623), Phospho-NF-κB p65 (Ser276) (каталожный номер: AF5875), HRP меченный козий анти-кроличий IgG (H плюс L) (номер по каталогу: A0208) и козий, меченный HRP

Антимышиный IgG (H плюс L) (каталожный номер: A0216).

2.2. Утки и животноводство

Экспериментальный протокол был проведен в соответствии с методами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию сельскохозяйственных животных в сельскохозяйственных исследованиях и обучении Северо-восточного сельскохозяйственного университета (номер протокола: NEAU-[2011]-9).

Утки (n {{0}}, однодневные самцы Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 г) без существенных различий в весе были приобретены в коммерческом инкубаторе и случайным образом разделены на 3 группы (таблица 1), по 10 особей. повторные загоны (клетки) на группу и 15 уток на загон в течение 70-дня

пробное кормление. Основные рационы были составлены в соответствии с Национальным исследовательским советом (1994). Утки в группе T0 и T0 плюс AFB1 получали основной рацион из кукурузы и сои (таблица 2), утки в группе T500 плюс AFB1 получали основной рацион с добавлением 500 мг

cistanche кг-1 рациона (T500) пробный 70-день. На 70 дней уткам с одинаковой массой тела в группах T0 плюс AFB1 и T500 плюс AFB1 скармливали 60 мкг AFB1 кг-1 массы тела, и уткам в группе Т0 давали равный объем раствора PBS. Уток кормили на экспериментальной базе Ачэн Северо-восточного сельскохозяйственного университета и обеспечивали свободный доступ к воде и порошковым кормам. Пятнадцать уток с одинаковой массой тела (1,4 ± 0,3 кг) из каждой группы были отобраны и голодали в течение 12 часов, затем им давали раствор PBS уткам в группе T0 и 60 мкг AFB1 кг-1 массы тела уткам в группе T0 плюс AFB1 и T500 плюс группы AFB1 одновременно. Через 12 часов пятнадцать уток в каждой группе должны были получить образцы уток.

2.3. Сбор образцов

Образцы крови (10 мл) получали в пробирках с гепарином из вен утиных крыльев и центрифугировали при 1000×g в течение 15 мин при 4 ◦C. Полученную плазму сразу отделяли и хранили при -80 ◦C для анализа. Уток анестезировали путем вдыхания эфира и умерщвляли для получения подвздошной кишки. Подвздошную кишку сразу же промывали 3 раза в PBS и отдельно хранили в резервуаре с жидким азотом, а затем при температуре -80 ◦ C для количественной RT-PCR и анализа антиоксидантной способности. Затем было получено около 0,125 см3 подвздошной кишки и помещено в 4-процентный раствор параформальдегида для среза тканей и около 1 мм3 подвздошной кишки было помещено в электронный микроскоп.

раствор при 4 ◦C для последующего ультраструктурного наблюдения.

2.4. Анализ уровней антиоксидантов в плазме

Уровни в плазме общей супероксиддисмутазы (T-SOD), глутатионпероксидазы (GSH Px), глутатион S-трансферазы (GSH-ST) и малонового диальдегида (MDA) измеряли с помощью наборов для анализа (Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн, Нанкин, Китай). соответственно, с

Спектрофотометр UV-VIS (UV1100, MAPADA, Шанхай, Китай).

2.5. Анализ уровня КУМ1-аддуктов ДНК в плазме

Генерацию аддуктов AFB1-ДНК в плазме определяли с использованием наборов ELISA в соответствии со спецификациями набора (Нанкинский институт биоинженерии Цзяньчэн, Нанкин, Китай).

2.6. Анализ антиоксидантной способности подвздошной кишки

Подвздошная кишка (100.00 мг) выделяли и смешивали с 0,9 мл инсультно-физиологического раствора (4°C, 0,9% NaCl, pH=7.2 -7.4) для получения 10-процентного гомогената подвздошной кишки/SPSS. Активность или содержание общей супероксиддисмутазы (Т-СОД Ед/мг белка), редуктивного глутатиона (GSH-PX мкмоль/мг белка), глутатион-S-трансферазы (GSH-ST Ед/мг белка) и малонового диальдегида (МДА нмоль/мг белка). мг белка) в подвздошной кишке оценивали с использованием наборов для анализа (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), соответственно, с помощью UV-VIS

спектрофотометр (UV1100, MAPADA, Шанхай, Китай).

2.7. Выделение РНК и количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR)

Суммарную РНК подвздошной кишки утки (100.00 мг) выделяли с помощью набора реагентов (TaKaRa, Япония) по протоколу, рекомендованному производителями. Концентрацию и чистоту тотальной РНК определяли при соотношении А260/А280 на спектрофотометре (IMPLEN, Германия). 1 мкг общей РНК в каждом образце преобразовывали в кДНК с помощью набора реагентов Prime Script™ RT с gDNA Eraser (TaKaRa, Далянь, Китай) согласно

протоколу, рекомендованному производителями. Полученную кДНК из подвздошной кишки каждой утки использовали в качестве матрицы для набора TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Далянь, Китай) для RT-PCR (qRT-PCR). Номер доступа к гену уток был получен из NCBI и

праймеры генов утки были синтезированы Sangon Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай) (табл. 3). Соответствующую экспрессию гена в подвздошной кишке утки определяли с помощью термоциклера Quanta gene Q225. qRT-PCR выполняли в Monad Selected Real-Time.

Система ПЦР (прибор для ПЦР в реальном времени ABI 7500 (США)) протекала до условий: один цикл при 95 ◦С в течение 30 с, 40 циклов при 95 ◦С в течение 5 с и при 60 ◦С в течение 30 с. Относительный коэффициент экспрессии генов детектирующей мРНК определяли с использованием метода 2-∆∆Ct и нормализовали по экспрессии -актина.

2.8. Вестерн-блоттинг

Подвздошную кишку утки измельчали ​​и лизировали в буфере RIPA, содержащем 1 ммоль/л PMSF (Beyotime, Шанхай, Китай) на льду. Концентрацию общего белка в подвздошной кишке определяли с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай). 12-процентный и 10-процентный SDS-полиакриламидный гель для электрофореза.

используются для получения целевых белков с различной молекулярной массой. Затем целевые белки переносили на поливинилидендифторидную (ПВДФ) мембрану (Beyotime, Шанхай, Китай) для блоттинга с помощью аппарата для транс-блоттинга. Мембрану PVDF промывали 3 раза по 10 мин каждый раз в 1 × PBST, а затем блокировали на 2 ч в 5% обезжиренном молоке. Мембрану PVDF снова промывали 3 раза и инкубировали с первичными антителами GAPDH, Nrf2 и P-P65 (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) в течение 8–12 ч при 4 ◦C соответственно. На следующий день ПВДФ-мембрану снова промывали 3 раза и инкубировали с соответствующим антителом, меченным пероксидазой хрена, при 37°С в течение 1 ч, затем снова промывали 3 раза.

Полосы белков-мишеней выявляли и визуализировали под действием набора для детекции усиленной флуоресценции BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Изображения пятен записывали и анализировали с помощью платформы обработки изображений Essential V6 (UVITEC, Кембридж, США).

Англия). Белок GAPDH служил внутренним контрольным белком. Все результаты эксперимента были повторены в трехкратной повторности. Относительную экспрессию белков-мишеней выражали как отношение интенсивностей полос белков к GAPDH.

2.9. Статистический анализ

Данные эксперимента получали не менее шести раз и каждый образец измеряли трижды. Анализ данных исследования с использованием T-критерия независимых выборок SPSS (версия 22.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США) с 5 процентами. Вероятность ошибки и статистическая значимость были p < {{4} }.05 в этом исследовании