Пищевые флаванолы какао улучшают функцию митохондрий в скелетных мышцах и изменяют метаболизм всего тела у здоровых мышей

для получения дополнительной информации обращайтесь:tina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный: Митохондриальная дисфункция часто встречается при различных заболеваниях и способствует их патогенезу. Мы оценили влияниефлаванолы какаодобавки на митохондриальную функцию и общий метаболизм, и мы исследовали, участвует ли митохондриальная деацетилаза сиртуин-3 (Sirt3) или нет. Мы исследовали эффекты 15-дневного приема CF на мышах дикого типа и Sirt3-//. Метаболизм всего организма оценивали с помощью непрямой калориметрии, а для оценки проводили пероральный тест на толерантность к глюкозе.метаболизм глюкозы. В пермеабилизированных волокнах оценивали дыхательную функцию митохондрий и количественно определяли содержание пиридиновых нуклеотидов (НАД плюс и НАДН). У дикого типа добавка CF значительно изменила метаболизм всего организма, способствуя использованию углеводов и улучшая толерантность к глюкозе. Добавка CF вызывала значительное увеличение митохондриальной массы, в то время как происходила значительная качественная адаптация для поддержания производства H2O2 и клеточного окислительного стресса. Добавление CF вызывало значительное увеличение содержания NAD plus и NADH. Все упомянутые выше эффекты у мышей Sirt3-7 нивелировались. В совокупности прием CF повышал метаболизм НАД, который стимулировал метаболизм сиртуинов, и улучшал функцию митохондрий, что, вероятно, способствовало наблюдаемой адаптации метаболизма всего организма с большей способностью использовать углеводы, по крайней мере частично, через Sirt3.

Ключевые слова: флаванолы какао; метаболизм НАД; митохондриальная масса; метаболизм глюкозы; скелетная мышца

нажмите, чтобы получить больше информации

1. Введение

Митохондрии представляют собой субклеточные органеллы, которые участвуют во многих клеточных функциях, таких как передача энергии посредством митохондриального окислительного фосфорилирования и в митохондриальной продукции перекиси водорода или активации митохондриально-опосредованной гибели клеток [1-3]. Появляющиеся данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция участвует во многих патологиях и играет центральную роль в их патогенезе [4]. Наша группа сообщила о нарушении митохондрий у пациентов с диабетом 1 типа задолго до клинических осложнений [5]. Более того, снижение окислительной способности митохондрий происходит с возрастом даже у здоровых людей [6]. Таким образом, определение стратегий смягчения этих дисфункций или увеличения митохондриальной массы является возможностью предотвратить или, по крайней мере, уменьшить частоту многих нарушений или увеличить аэробную способность здоровых людей.

В этом контексте представляет интерес идентификация безопасных и природных соединений, которые улучшают митохондриальную функцию и метаболизм всего организма с ограниченными побочными эффектами или без них. Среди природных соединенийфлаванолы какао(CF) считаются многообещающими молекулами, поскольку было показано, что их потребление положительно влияет на здоровье сердечно-сосудистой системы, резистентность к инсулину или иммунную функцию [7]. Действительно, было показано, что CF улучшает метаболизм глюкозы, а кратковременное введение CF сопровождается повышением чувствительности к инсулину даже у пациентов с гипертонической болезнью, не переносящих глюкозу [8,9].

Среди флаванолов (-)-эпикатехин (EPI) является наиболее часто встречающимся мономером при CF, а EPI считается основной биодоступной и биоактивной молекулой CF [10]. Многочисленные доказательства указывают на то, что добавки EPI улучшают функцию митохондрий и/или их содержание в скелетных мышцах [11]. Добавка EPI стимулирует несколько путей, сходящихся к коактиватору гамма-рецептора, активируемому пролифератором пероксисом, 1-альфа (PGCl) и основным ядерным транскрипционным комплексам. EPI напрямую усиливает образование оксида азота, что стимулирует митохондриальный биогенез [11]. Одновременно с этим сиртуины 1 и 3 также стимулируются добавками EPI [11]. Применение проантоцианидинов, олигомерныхфлавоноидыкоторые содержат EPI, было показано, что они увеличивают внутриклеточные уровни никотинамидадениндинуклеотида (НАД плюс) за счет увеличения количества нескольких предшественников для биосинтеза НАД и повышения уровня мРНК сиртуина -1 в печени крыс [12]. Семейство сиртуинов (Sirt), NAD-зависимых деацетилаз, включает семь членов, которые различаются по своему внутриклеточному распределению, субстратной специфичности и клеточным функциям [13]. Sirt1, широко изученный член этого семейства, стимулирует митохондриальный биогенез, способствуя деацетилированию PGCl, тем самым усиливая его транскрипционную активность [14]. Sirte, ключевой метаболический сенсор, стимулировался после введения EPI [12, 15-17]. Однако влияние EPI на другие сиртуины не изучалось. Оценка эффекта ЭФИ будет особенно интересна для сиртуинов, расположенных внутри митохондрий (Sirt3, Sirt 4 и Sirt5), которые, как известно, модулируют активность ферментов цикла Кребса и дыхательной цепи [18]. Sirt3, который в высокой степени экспрессируется в тканях с высоким метаболическим оборотом и содержанием митохондрий, представляет особый интерес в связи с его критической ролью в поддержании нормальной функции митохондрий посредством обратимого деацетилирования белка лизина [19-21]. Более того, Sirt3 играет важную роль в регуляция обмена веществ в организме [20. Было показано, что Sirt3 изменяется в скелетных мышцах моделей диабета 1 и 2 типа и сердечно-сосудистых заболеваний [22,23]. Кроме того, было высказано предположение, что активация Sirt3 может представлять собой многообещающую терапевтическую стратегию для улучшения митохондриальной функции и метаболизма [23,24]. Следовательно, представляет интерес определение того, лежит ли Sirt3 в основе благотворного воздействия добавок CF на метаболизм всего организма и функцию митохондрий.

В этом исследовании мы использовали интегративный подход для изучения на мышах эффекта добавки CF в течение 15-дня. Мы предположили, что добавки CF будут: (i) изменять метаболизм всего тела иметаболизм глюкозы, (ii) усиливают митохондриальную функцию в окислительных и гликолитических мышцах в пермеабилизированных волокнах и (ii) повышают метаболизм НАД. Мы также исследовали предполагаемое участие Sirt3 в индуцированном CF митохондриальном биогенезе и метаболизме всего организма. Наша гипотеза заключалась в том, что влияние муковисцидоза на метаболизм всего тела и митохондриальную массу будет притуплено у мышей Sirt3-7.

2. Методы

2.1. Животные и диета

Для этого исследования мышей-самцов 129S1/SvlmJ 10-недельного возраста приобретали в Jackson Laboratories (Бар-Харбор, Мэн, США). Чтобы определить, участвуют ли сиртуины в индуцированной введением CF адаптации митохондриальной массы и функции, мы также использовали 10-недельных самцов мышей с нокаутом Sirt3 в том же штамме, что и дикий тип [25]. Sirt3/мышей использовали для изучения участия Sirt3 в индуцированном CF митохондриальном биогенезе и адаптации метаболизма всего организма. Мышей содержали в помещении с регулируемой температурой 23-25 градусов и контролируемым освещением (циклы света и темноты 12-ч). Животные имели свободный доступ к корму для грызунов и водопроводной воде.

После не менее недели привыкания в виварии экспериментальные животные получали добавку CF через пероральный желудочный зонд натурального экстракта (302,1 мг/кг массы тела два раза в день в течение 15 дней), ресуспендированного в карбоксиметилцеллюлозе (Sigma-Aldrich, Сент-Луис). , Миссури, США). Состав какао-порошка описан в таблице 1 и был получен от Naturex (Quart de Poblet, Испания). Состав был установлен методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и 100 мг экстракта эквивалентны в среднем 475 мг сухих семян какао. Контрольные мыши получали носитель, состоящий из аналогичного содержания теобромина и кофеина, растворенных в карбоксиметилцеллюлозе, через пероральный желудочный зонд. Суточная доза была определена в соответствии с отраслевым руководством, в котором дозы для человека преобразуются в дозы, эквивалентные животным, исходя из площади поверхности тела, и мы умножили дозу для человека на 12,3 [26]. Оральный желудочный зонд был выполнен опытным техником.

2.2. Коллекция тканей1

Через 24 часа после последнего перорального зонда неголодных животных анестезировали кетамином и ксилазином (соответственно: 100 и 10 мг/кг). Забор тканей производили сразу после достижения анестезии. Камбаловидная мышца и белая часть икроножной мышцы были иссечены. Образцы либо немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 градусах для последующего анализа, либо использовали для приготовления снятых с кожи мышечных волокон.

2.3. Оценка метаболической и физической активности

Непрямую калориметрию и спонтанную физическую активность измеряли с использованием Комплексной системы мониторинга лабораторных животных (CLAMS; Columbus Instruments, Колумбус, Огайо, США). Мышей содержали индивидуально в камерах при температуре 28 градусов, с освещением от 07 ч00 до 19 ч00 и свободным доступом к корму для грызунов и водопроводной воде. Мышей акклиматизировали к метаболическим клеткам за три дня до первого дня сбора данных. Сбор данных проводили на пятнадцатый день приема добавок. Потребление кислорода (VO2), производство двуокиси углерода (VCO2) и коэффициент дыхательного обмена (RER) измерялись при расходе воздуха 0,5 л/мин и пробе воздуха 0,4 л/мин. мин. Относительная кумулятивная частота RER в процентах (PCRF) определялась в течение 24- часового периода, как описано ранее Riachi et al. (2004). Вкратце, PCRF определяли путем добавления частоты каждой точки данных к предыдущей последовательности приращений (от 0,65 до 1,20 с шагом 0,01) [27]. Метаболическую гибкость определяли по наклону Хилла (значение H) и 50-му процентилю (EC50) кривой PRCF, а также путем измерения амплитуды RER в течение 24 часов (Riachi et al., 2004). Общая физическая активность контролировалась с помощью сенсорной системы с инфракрасным лучом, которая обнаруживала активность по осям x и z. Оценивались как общие подсчеты (каждый раз, когда ломается луч), так и амбулаторные подсчеты (каждый раз, когда ломается новый луч). Подсчет X-total (X-TOT) регистрируется, когда животное перемещается по горизонтали более чем на 0,5 дюйма и представляет мелкомасштабные повторяющиеся действия, такие как царапание и уход. X-амбулаторный подсчет (X-AMB) измеряет фактическую локомоцию, регистрируя подсчет только тогда, когда животное ломает новый луч. Общий Z-подсчет (Z-TOT) регистрируется, когда происходит вертикальное перемещение на 1,5 дюйма, т. е. при вставании на дыбы (Abreu-Vieira 2016). Для оценки углеводов и жировокислениеот VO2 и VCO2 мы использовали таблицу небелковых дыхательных коэффициентов от Péronnet и Massicotte, ранее использовавшуюся на мышах [28,29].

2.4. Общее тело и жировая масса

Общую жировую массу и общую безжировую массу определяли у неанестезированных мышей с помощью количественного резонансно-интерференционного анализа с использованием магнитно-резонансного анализатора всего тела EchoMRI (Echo Medical System, Хьюстон, Техас, США). Общая жировая масса представляла собой сумму всего жира в организме. Общая безжировая масса включала в основном мышцы и внутренние органы. Известно, что скелетная мышечная масса составляет наибольшую часть общей мышечной массы.

2.5. Оральный тест на толерантность к глюкозе (ОГТТ)

Гликемию измеряли с помощью капли крови, взятой из хвоста с помощью глюкометра (Accu-Chek Performa, Roche, Аргентина). ПГТТ проводили на мышах, которые голодали в течение 5–6 часов. Измерение проводили в последний день приема CF. После измерения базальной гликемии (время O) мышам вводили перорально 20-процентный раствор глюкозы в стерильной воде в дозе 1,5 г глюкозы на кг массы тела-1. Гликемию измеряли через 15, 30, 60, 90 и 120 мин после введения раствора глюкозы. Затем рассчитывали приращение площади кривой глюкозы как меру толерантности к глюкозе.

2.6.qRT-ПЦР-анализ

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. кДНК синтезировали из тотальной РНК (2 мкл), используя супермикс обратной транскрипции iScript для RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Общие продукты ОТ анализировали количественной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG в соответствии со спецификациями производителя (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canada). Циклирование проводили в циклере CFX96 (Biorad, Hercules, California; условия: 95°C в течение 10 мин и 40 циклов при 95°C в течение 30 с, 55° в течение 45 с и 72° в течение 45 с). В конце каждого цикла отсутствие образования праймер-димера и наличие уникального ампликона подтверждали с помощью кривой плавления. Значения порогового цикла (Ct) использовали в соответствии с методом 2-A△Ct для анализа данных количественной ПЦР либо с β-актином, либо с HPRT1 в качестве гена домашнего хозяйства【30】. Количественные значения ОТ-ПЦР были связаны со значениями контрольной группы, которые были установлены на 1.

2.7. Ферментативная активность

Измерение удельной активности комплексов электронтранспортной цепи и цитратсинтазы проводили спектрофотометрически, как описано ранее [31]. Измельченные замороженные белые икроножные мышцы (~ 30 мг) гомогенизировали с помощью вибрирующего микрошарикового гомогенизатора в 500 мкл буфера для гомогенизации (120 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA и 5 мг·мл-I BSA). , pH 7,4) с последующим добавлением 500 мкл гипотонической среды (25 мМ фосфата калия и 5 мМ MgCl, pH 7,2). Затем образцы подвергали трем циклам замораживания-оттаивания в жидком азоте. Образцы центрифугировали в течение 10 мин при 600×g при 4 градусах, а супернатант хранили на льду до проведения анализа. Содержание белка определяли в супернатанте в трех экземплярах с использованием набора для анализа белка Pierce BCA (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США).

Активность цитратсинтазы (ЦС) определяли спектрофотометрически при 412 нм после восстановления 2 мМ 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной кислоты) в присутствии 0,1 мМ ацетил -КоА и 12 мМ щавелевоуксусной кислоты в 200 мМ трис-буфере (рН 7,4). Анализ чувствительной к ротенону НАДН-децилубихиноноксидоредуктазы (комплекс I) проводили при 340 нм с использованием акцептора 2,3-диметокси-5-метил-6-н-децил-14-бензохинона （ 80 мкМ) и НАДН в качестве донора электронов (200 мкМ) в 10 мМ трис-буфере (рН 8,0). Добавление 4 мкМ ротенона использовали для количественного определения чувствительной к ротенону активности. Активность цитохромоксидазы (комплекс IV) определяли при 550 нм с использованием 10 мкМ восстановленного цитохрома с в качестве донора и 2,5 мМ н-додецил-β-мальтозида для проницаемости обеих митохондриальных мембран в 100 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0).

Все анализы ферментов были определены в трех повторностях, и результаты были связаны с результатами контрольной группы, которые были установлены на 100.

2.8. Митохондриальная оценка

Митохондриальное дыхание и митохондриальное производство H2O2 изучали in situ в проницаемых сапонином волокнах с использованием белых икроножных и камбаловидных мышц |1]. Вкратце, волокна разделяли под бинокулярным микроскопом в растворе А при 4 градусе (в мМ: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 таурин, 0,5 DTT, 5{ {50}} К-метансульфонатов, 20 имидазолов, 5,7 Na2 АТФ и 15 креатинфосфата, рН 7,1) и пермеабилизированы в растворе А с 50 мкг·мл-1 сапонина в течение 30 мин при 4°С. Дыхательную функцию митохондрий определяли на оксиметре, снабженном электродом типа Кларка (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Камеру наполняли 1 мл раствора В (в мМ: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20% таурина, 0,5 DTT, 50 K-метансульфонатов и 20 имидазолов, pH 7,1) и после регистрации исходного содержания кислорода в камере, один пучок 1-2 мг сухого веса пермеабилизированных миоволокон помещали в камеру, которую затем закрывали. После исходных показаний последовательно добавляли следующие добавки: пальмитоилкарнитин и малат (160 мкМ∶5 мМ), глутамат (10 мМ), сукцинат (25 мМ), ротенон (0,5 мкМ), разобщитель CCCP (1 мкМ), антимицин. -A (8 мкМ) и N,N',N'-тетраметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид и аскорбат (0,9:9 мМ). Дыхание измеряли при 23 градусах при постоянном перемешивании. В конце каждого теста волокна осторожно извлекали из ксилографической ячейки, промокали и сушили не менее 24 ч при ~80°С для определения массы волокна. Скорость потребления О2 (JO2) выражали в нмоль О2 мин-1.(мг сухого веса)-I. Все измерения проводились как минимум дважды.

Чистое высвобождение H2O2 дышащими митохондриями измеряли в пермеабилизированных пучках волокон с помощью флуоресцентного зонда Amplex Red (20 мкМ∶возбуждение-испускание∶563-587 нм), как описано ранее [32]. После подготовки пермеабилизированных волокон образцы

предназначенные для измерения H2O2, промывали три раза в буфере Z (в мМ:110 K-Mes, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3MgCl, 6H2O и 0,5 мг:мл{ {14}} БСА, рН 7,3, 4 град.). Пучки волокон ({{20}}.3-1.0 мг сухого веса) инкубировали при 37°С в кварцевой микрокювете с непрерывным магнитным перемешиванием в 600 мкл буфера Z (рН 7,3 при 37°С). с добавлением 1,2 ЕД·мл-I пероксидазы хрена. Базовые значения флуоресценции были сняты в отсутствие каких-либо экзогенных респираторных субстратов. Затем последовательно добавляли следующие добавки: глутамат (5 мМ), сукцинат (5 мМ), ротенон (0,5 мкМ), АДФ (10 мМ) и антимицин-А (8 мкМ). осторожно извлекают из кюветы, промокают и сушат для определения массы волокна. Скорость образования H2O2 выражали в AU·мин-1.(мг сухого веса)-I и на оксофосфорную емкость, которая соответствовала максимальному митохондриальному дыханию в состоянии фосфорилирования. Все измерения проводились как минимум дважды.

Митохондриальную способность к удержанию кальция (CRC) оценивали в фантомных волокнах белой икроножной мышцы, как описано ранее [33]. Вкратце, волокна инкубировали в кварцевой микрокювете при непрерывном перемешивании в 600 мкл буфера CRC (в мМ∶250 сахарозы, 10 MOPS, 0,005 EGTA и 10P;-трис, pH 7,3). Затем на волокна воздействовали одиночным импульсом 20 нМ Ca2 плюс . Изменения внемитохондриальной концентрации кальция контролировали флуорометрически с использованием кальциевого зеленого 5N (1 мМ: возбуждение-испускание: 505-535 нм). Восприимчивость переходной поры проницаемости (PTP) оценивали путем измерения времени, необходимого для открытия PTP, а CRC принимали за общее количество Ca', накопленное митохондриями до его высвобождения. В конце каждого теста волокна осторожно удаляли из кюветы, промокали и сушили для определения массы волокна. Значения CRC выражали в нМ Ca2 плюс на мг сухого веса.

2.9. Вестерн-блот-анализ

Белки из белых икроножных и камбаловидных мышц разбавляли в буфере Лэммли и разделяли на полиакриламидных гелях Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10% (Biorad); на каждый гель наносили внутренний стандарт. Электрофоретическое разделение проводили при 200 В в течение 35 минут в миграционном буфере (25 мМ TrisBase, 0,2 М глицина и 1% SDS (м./об.)). Технология Stain-Free (SF) содержит запатентованное тригалогеновое соединение, которое вступает в реакцию с белками, делая их обнаруживаемыми при воздействии УФ-излучения. Визуализация SF выполнялась с использованием программного обеспечения ChemiDoc MP Imager и Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, Калифорния, США) с временем активации окрашивания 5-мин, и таким образом визуализировались общие белковые структуры. Затем белки переносили на нитроцеллюлозный лист толщиной 0,2 мкм с использованием системы Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Качество переноса контролировали с помощью визуализирующих мембран с использованием технологии SF. После стадии переноса карбонильные белки были дериватизированы динитрофенилгидразином, разбавленным 2 н. HCl, и, наконец, тщательно промыты метанолом. Мембраны блокировали 5-процентным обезжиренным сухим молоком в Трис-буферном солевом растворе, содержащем Твин-20 (TBST: 15 мМ Трис/HCl, pH 7,6, 140 мМ NaCl и 0,05% Твин-20) для 1 ч при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали при 4 градусах в течение ночи или 2 ч при комнатной температуре со следующими первичными антителами: первичное антитело к карбонилу белка (анти-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) и SOD2 (#Ab13533, Abcam). После трех 10-минутных промывок в TBST мембраны исследовали с помощью вторичных антител на карбонил белка (HRP-конъюгат; #STA-308, Cell Biolabs) и SOD2 (антикроличий IgG-HRP, связанный; #7074, Cell Signalling). в блокирующем растворе в течение 2 ч при комнатной температуре и, наконец, тщательно промывали TBST. Разведение первичных и вторичных антител оптимизировали для каждого антитела. Детекцию хемилюминесценции проводили с помощью ECL Clarity (Biorad), а захват изображений — с помощью ChemiDocMP. Все изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения Image Lab 4.0.1. Нормализация интенсивности сигнала белка проводилась после количественного определения соответствующих уровней общего белка на изображениях SF, контроле образца и внутренних стандартах.

2.10. НАД измерение

Общие уровни НАД и НАДН измеряли в гомогенизированной белой икроножной мышце с использованием коммерческого набора (#K337-100, Biovision, США) и в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, общий пул NAD (NADt= NADt и NADH) экстрагировали. Для каждого из извлеченных образцов половину образца нагревали до 60 градусов в течение 30 минут для разложения NADt, сохраняя при этом NADH нетронутым. Образцы как NADt, так и NADH смешивали с циклическим ферментом NAD, и измеряли оптическую плотность при 450 нм. NADt и NADH определяли количественно путем сравнения со стандартной кривой NADH и нормализацией к мг белка. Наконец, рассчитывали отношение НАД плюс (НАДt-НАДН) к НАДН. Все анализы проводились в трехкратной повторности.

2.11. Статистика

Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Нормальность данных оценивали с помощью критерия нормальности Д'Агостино-Пирсона. Анализ данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента и двустороннего дисперсионного анализа (группа и время) для повторных измерений с последующим апостериорным тестом Бонферрони с использованием Prism8.4.1 (программное обеспечение GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Был применен двусторонний уровень 5 процентов для ошибки первого рода.

3. Результаты

3.1. Состав тела и метаболизм всего тела

Пятнадцать дней приема CF у мышей дикого типа (WT) не изменили массу тела (p=0.091), безжировую массу (p=0.{{24} }73) и жировая масса, оцененная с помощью ЭхоМРТ (p=0,89; рис. 1А). Уровень потребления O2, выраженный на нежирную массу, был значительно выше в темном цикле (8 ± 8 процентов, p=0.042), тогда как в светлом цикле он оставался одинаковым (p =0). .392; рис. 1В). Не было никаких изменений в двигательной активности (данные не показаны). Мыши CF показали значительное увеличение расхода энергии всего тела на 15 ± 15 процентов (p =0. 0 42; рис. 1C) и в прием пищи (0,08 ± 0,01 против 0,11 ± 0,01 г на безжировую массу тела, соответственно группа CF и WT, p=0,013, рисунок 1D).

Добавка CF значительно изменила метаболизм всего тела: основной эффект более высокого RER в группе CF наблюдался в течение 24 часов (p=0.023, рис. 2A), а среднее значение RER в течение 12 часов было выше. в группе МВ в цикле света и темноты (плюс 5±3%, p=0.035 и плюс 9±4% соответственно, p=0.026). Кроме того, добавка CF способствовала использованию углеводов (CHO) (51 ± 13 процентов потребления энергии зависело от окисления CHO в группе CF по сравнению с 37 ± 12 процентами в контрольной группе во время светового цикла, p=0.108 и 71±21 процент в группе CF по сравнению с 47±24 процентами в контрольной группе во время темнового цикла, p=0,004; рисунок 2B.). Однако при выражении в кДж не было никакой разницы в окислении CHO или окислении жирных кислот (окисление CHO: 3,7±1,4 ккал·д-1 в контроле по сравнению с 4,4±1,7 ккал безжировой массы тела-1. d-1 при CF,p=0.33 и окисление жирных кислот: 2,3±1,0 ккал·d-I в контроле против 2,6±0,87 ккал. безжировая масса тела-1.d{{ 50}} в CF, p=0,608). Анализ PRCF RER выявил увеличение значений EC50 в группе CF (p=0,009; рис. 2D), что означает, что CF вызывает сдвиг к большему использованию углеводов. Уменьшение наклона Хилла наблюдалось в группе CF (значения H: 25,16 ± 4,44 в контроле против 12,79 ± 3,96 в группе CF, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Митохондриальная биоэнергетика

Мы проверили влияние добавок CF на энергетику митохондрий в белой икроножной и камбаловидной мышцах у мышей дикого типа. Наблюдалось более высокое митохондриальное дыхание с использованием субстратов комплекса IV в белых икроножных и камбаловидных мышцах (p=0,004 и p=0,028 соответственно; рис. 3A, B). Никаких изменений отношений дыхания CII/CI и CIV/CI не наблюдалось (p =0,899 и p =0,701 для белой икроножной мышцы и p=0,693 и p{{ 11}}.912 для камбаловидной мышцы соответственно, данные не показаны). Более того, активность комплексов I, IV и цитрат-синтаз была значительно повышена в белой икроножной мышце (соответственно: плюс 31 ± 27 процентов, p=0,004; плюс 28 ± 38 процентов, p=0 0,027; плюс 35±38 процентов, p= 0,009; плюс 14±13 процентов, p=0,040;рис. 3C). Способность митохондрий окислять пальмитоилкарнитин имеет тенденцию к увеличению в белая икроножная мышца (плюс 24 ± 12 процентов, p =0,096; рисунок 3D), тогда как в камбаловидной мышце различий не наблюдалось (p =0,363). Относительная частота пальмитоил-карнитин-стимулированного дыхания не изменилась при выражении в функции дыхания комплекса I (62±11 в контрольной группе против 64±20 в группе МВ у белых икроножных и 70±18 против 72±16). в камбаловидной). Затем мы исследовали чувствительность к Ca plus-индуцированному открытию PTP в белой икроножной мышце. Как показано на рисунке 3E, ни время открытия PTP, ни способность удержания Ca² не изменились после добавления CF (p=0,608 и p=0,943 соответственно).

Оценка мРНК генов, участвующих в митохондриальном биогенезе, показала 70-процентную повышенную регуляцию мРНК NRF1, тогда как для PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa и Cox2 не сообщалось о различиях (таблица 3). На нескольких образцах мы исследовали влияние добавок CF на митохондриальные суперкомплексы (рис. S1, дополнительные материалы). Денситометрический анализ показывает, что добавка CF увеличивает общее содержание суперкомплексов без качественной адаптации или перестройки. Действительно, плотность дыхания улучшилась на 58 процентов при использовании комплексов I и II и на 93% при использовании комплексов I. Точно так же содержание комплекса I и комплекса III, встроенных в суперкомплексы, было выше в группе CF.

Добавка CF снижает выброс митохондриальных АФК. В то время как выброс H2O2 оставался неизменным как в белой икроножной, так и в камбаловидной мышце при выражении в пересчете на сухую массу (рис. 4A, B соответственно), показатели снижались при выражении в пересчете на содержание митохондрий (рис. 4C). Основной положительный эффект добавки CF наблюдался в различных условиях у белой икроножной мышцы (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Маркеры окислительного стресса в скелетных мышцах

На уровень окислительного стресса клеточного белка у мышей WT не влияло добавление CF, поскольку клеточное содержание SOD2 было одинаковым в экспериментальных и контрольных группах в белой икроножной и камбаловидной мышцах (рис. 4E). Кроме того, не наблюдалось различий в карбонилировании белков в белой икроножной и камбаловидной мышцах (рис. 4F). Кроме того, после добавления CF не наблюдалось различий в экспрессии мРНК каталазы и MnSod (таблица 3).

3.4. Метаболизм НАД

Общий пул пиридиновых нуклеотидов увеличился после добавления CF на 36 ± 33 процента (p =0,012). В частности, содержание NAD и NADH увеличилось в белой икроножной мышце (соответственно на 69 ± 60 процентов, p {{6). }},026 и 29 ± 42 процента, p=0,017; рис. 5A, B), а соотношение NAD plus / NADH имело тенденцию к увеличению в группе МВ (p =0,084). Нет значительный эффект наблюдался для мРНК Sirt3 (p=0,096), мРНК NMNAT (p=0,094) и мРНК Sirt1 (p =0,869; Таблица 3 ).

3.5. Реакция всего тела и клеточного метаболизма после добавления CF у мышей Sirt3-/

Мы исследовали влияние добавок CF на мышей Sirt{{0}}. Состав тела по весу, мышечной массе и жировой массе не отличался между группами CF и контрольной группой (p= 0,52, p=0,66, p=0,45, соответственно; Рисунок 6A). Точно так же потребление CF не повлияло на ежедневный расход энергии ({{1{0}},38±0,{{4{0}}}1 ккал. масса-1.день-1 в контрольной группе по сравнению с 0.39 ± 0.01 ккал·сухая масса тела-1.день-1 в CF, p=0.502; рисунок 6B). RER был одинаковым между обеими группами в световых и темных циклах (p =0.301; рис. 6C), и на окисление субстрата не влияло добавление CF (44 ± 17 процентов потребления энергии зависело от окисления CHO в цикле). контрольная группа по сравнению с 50 ± 11 % в группе CF в световую фазу, p=0.209 и 65 ± 19 % в контрольной группе против 77 ± 21 % в группе CF в темновую фазу, p=0.395; рис. 6D). Метаболическая гибкость, оцениваемая по амплитуде RER в течение 24 часов, оставалась одинаковой между двумя группами (0,19 ± 0,05 в контроле против 0,20 ± 0,03 в группе CF, p =0,604), тогда как наклон PRCF был уменьшен в группе CF. (Значения H: 17,77 ± 4,38 в контроле против 12,79 ± 3,93 в CF, p=0,039).

Затем мы сравнили влияние добавок CF на активность митохондриальных ферментов. Добавка CF не увеличивала ферментативную активность комплекса I, I, IV и CS у мышей Sirt3-/, как это наблюдалось ранее у мышей дикого типа (соответственно: p=0.623,p=0 .629, p=0.283 и p=0.791, рис. 6E). Более высокая ферментативная активность комплекса и IV наблюдалась у мышей дикого типа по сравнению с мышами Sirt3-7 после добавления CF ( соответственно: p=0.027 и P=0.045)

4. Дискуссия

В этом исследовании мы проводим интегративный анализ эффекта приема внутрь CF. Мы наблюдали, что хроническое употребление CF улучшало митохондриальное дыхание и снижало выработку H2O2, что оценивалось в среде их миофибрилл, тогда как восприимчивость к открытию PTP не изменилась. Прием внутрь МВ усиливал метаболизм НАД, поддерживая участие сиртуиновых путей в наблюдаемых митохондриальных адаптациях. Мы также наблюдали изменения метаболизма всего тела в сторону большей способности использовать углеводы в качестве основного субстрата, предполагая, что митохондриальная адаптация, вероятно, способствовала наблюдаемой адаптации метаболизма всего тела.

4.1.Обмен веществ

Диетическое введение флаванолов какао было определено как эффективная стратегия для облегчения непереносимости глюкозы, позволяющая улучшить метаболические заболевания [34]. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось о повышении толерантности к глюкозе после приема флаванолов [35,36]. Механизмы, предложенные для этого эффекта, включают увеличение транслокации GLUT4 к клеточной мембране, увеличение фосфорилирования AMPK и активацию экспрессии гена UCP-2 в скелетных мышцах [8,37]. . Более того, прием CF был связан с улучшением чувствительности к инсулину у людей [8]. После 15 дней употребления темного шоколада у здоровых лиц наблюдалось снижение модели гомеостаза индекса резистентности к инсулину одновременно с увеличением индекса количественной проверки чувствительности к инсулину и индекса чувствительности к инсулину [8]. Мы также наблюдали сопутствующее увеличение толерантности к глюкозе и метаболической гибкости у мышей WT, что относится к способности организма адаптировать окисление топлива к его доступности [38]. Интересно, что в то время как нарушенная окислительная способность митохондрий и связанное с ней окисление субстрата были связаны с резистентностью к инсулину 39, тренировки на выносливость увеличивали содержание митохондрий, чувствительность к инсулину и метаболическую гибкость [38]. Таким образом, настоящие результаты специфичны для добавок CF и не зависят от спонтанной активности.

Положительный эффект CF на метаболическую гибкость, а также увеличение активности митохондриальных комплексов были притуплены у мышей Sirt3-7, что указывает на то, что положительные эффекты CF проявляются, по крайней мере, частично через Sirt3. Эти результаты подтверждают предыдущие выводы и ключевую роль Sirt3 в регуляции метаболической гибкости [24]. Наши результаты показывают, что усиление митохондриальной функции может повысить метаболическую гибкость. Однако, помимо митохондриальной функции, базальный дыхательный коэффициент, скорость утилизации глюкозы, емкость накопления липидов жировой ткани и концентрация свободных жирных кислот в плазме также были идентифицированы как определяющие факторы метаболической гибкости, и их следует учитывать [40]. Будущие исследования должны более глубоко оценить клеточные детерминанты метаболической гибкости, чтобы углубить наше понимание основных причин повышения метаболической гибкости после приема CF.

Оценка метаболизма всего организма выявила увеличение относительного окисления CHO после приема CF. Этот результат контрастирует с предыдущим исследованием, в котором сообщалось об увеличении липолиза после острого приема флаванолов или двухнедельного приема флаван-3-олов у мышей [36]. Помимо различий в составе экстрактов, эти противоречивые результаты могут быть результатом плейотропных эффектов NO. Общепризнано, что прием CF стимулирует выработку или биодоступность метаболизма NO [7]. С одной стороны, NO стимулирует транспорт и поглощение глюкозы скелетными мышцами. Стимуляция продукции NO в мышечных трубках клеточной линии инсулином или перекисью водорода приводила к увеличению транслокации GLUT4, которая снижалась при ингибировании nNOS [41]. Кроме того, NO может увеличивать транспорт глюкозы инсулинонезависимым путем, что приводит к увеличению уровней циклического GMP и AMPK [42], что способствует окислению глюкозы в скелетных мышцах крыс независимо от наличия и окисления жирных кислот [43]. С другой стороны, NO способствует окислению жирных кислот за счет снижения уровня малонил-КоА за счет ингибирования ацетил-КоА-карбоксилазы и активации малонил-КоА-декарбоксилазы в скелетных мышцах [44]. В то время как мы наблюдали сдвиг в сторону более низкой относительной доли использования жирных кислот в качестве субстрата с CF, не было никакой разницы в отношении абсолютных значений, выраженных в кДж. Это говорит о том, что увеличение расхода энергии, наблюдаемое при добавлении CF, зависит от увеличения окисления глюкозы. Таким образом, эти результаты подтверждают идею о том, что потребление CF повышает чувствительность к инсулину и способствует окислению глюкозы без сопутствующего влияния на способность к окислению жирных кислот. Эти результаты поднимают вопрос об уместности использования флаванолов какао в контексте диеты с высоким содержанием жиров. Будущие исследования должны оценить возможный вредный эффект комбинации добавок CF и диеты с высоким содержанием жиров.

4.2. Митохондриальная функция

Было показано, что прием флаванолов какао с пищей улучшает функцию митохондрий, включая (i) митохондриальное дыхание и активность ферментов цепи переноса электронов; (i) высвобождение митохондриальной H2O2, которое отражает выработку митохондриальными активными формами кислорода (АФК); и (i) митохондриальная способность удерживать кальций, которая отражает восприимчивость к открытию митохондриальной поры перехода проницаемости (mPTP) (для обзора см. [11]. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями; тем не менее, наше исследование было первым, чтобы оценить эффект Добавка CF на митохондриальную функцию, оцениваемую in situ в пермеабилизированном волокне и в различных типах мышц.В отличие от предыдущих исследований изолированных митохондрий, оценка митохондриальной функции в пермеабилизированном волокне сохраняет митохондриальную морфологию, функциональные взаимодействия с другими внутриклеточными компонентами [1] и избегает митохондриальной структуры. нарушение в процессе выделения митохондрий [32].Поэтому важно изучать функцию митохондрий в тканевых препаратах, где митохондриальная структура сохранена, и представлен весь митохондриальный пул, чтобы лучше оценить ответ на лечение.

Предыдущие исследования, проведенные в клеточной культуре или in vivo на мышах, показали, что добавление EPI, который считается основной биоактивной молекулой при муковисцидозе, увеличивает максимальное дыхание, стимулированное АДФ (например, дыхание в состоянии 3), когда митохондрии заряжаются комбинацией энергии. субстраты, питающие различные участки дыхательной цепи [45-49]. В соответствии с этими результатами мы наблюдали основное влияние добавок CF на митохондриальное дыхание в окислительных и гликолитических мышцах. Чтобы определить, связано ли это увеличение с увеличением митохондриальной массы или ремоделированием митохондриальных дыхательных комплексов, мы оценили митохондриальные суперкомплексы из четырехглавой мышцы. Считается, что эти надмолекулярные структуры снижают продукцию АФК, стабилизируют или помогают в сборке отдельных комплексов, регулируют активность дыхательной цепи и предотвращают агрегацию белков в богатой белками внутренней митохондриальной мембране [50-52]. Несмотря на ограниченное количество мер, визуальный анализ результатов (дополнительные материалы) предполагает, что добавка CF вызывает увеличение митохондриальной массы, что отражается в увеличении всех видов суперкомплексов, а не в реорганизации конкретных комплексов дыхательной цепи. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что муковисцидоз способствует увеличению митохондриальной массы без качественной адаптации комплексов дыхательной цепи.

Во время митохондриального дыхания образуются переменные количества супероксида, который может метаболизироваться с образованием других типов АФК [53]. Хотя избыточная продукция АФК из митохондрий связана с широким спектром патологий, низкие физиологические концентрации АФК могут оказывать благотворное влияние, например, защищать от инфекционных агентов и участвовать в клеточной передаче сигналов [2,54]. Предыдущие исследования, проведенные in vivo на грызунах и людях, а также на моделях клеточных культур, сообщали о благотворном влиянии добавок CF на выработку АФК и различных антиоксидантных систем [11]. Например, пероральный желудочный зонд с ЭПИ в течение 15 дней увеличивает активность SOD2 и каталазы в четырехглавых мышцах мышей [17]. Хотя производство митохондриальных АФК широко не оценивалось, мы заметили, что уровни производства АФК были одинаковыми, когда значения были выражены в расчете на мышечную массу, тогда как производство было снижено при выражении в расчете на митохондриальную массу, что позволяет предположить, что качественные адаптации происходят для поддержания физиологических концентраций АФК. Более того, мы не наблюдали ни влияния КФ на СОД2, ни АФК-индуцированных повреждений, оцениваемых по карбонилированию белков. В то время как CF увеличивает пулы антиоксидантных белков, включая широко известные уровни SOD2 и каталазы [16,17,55], эта адаптация не всегда была связана со снижением повреждений, вызванных АФК [56-59]. Эти данные подтверждают теорию о том, что низкие уровни продукции АФК необходимы для нормального клеточного гомеостаза [2]. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что одновременно с увеличением митохондриальной массы CF способствует качественной адаптации митохондрий для повышения их антиоксидантной способности и поддержания низкого уровня продукции АФК.

4.3. Митохондриальный биогенез

Митохондриальная масса является результатом взаимодействия митохондриального биогенеза и митофагии. Наше исследование было сосредоточено на митохондриальном биогенезе, активируемом потреблением полифенолов [60]. Митохондриальный биогенез — это клеточный процесс, улучшающий митохондриальную массу. Этот сложный и строго регулируемый процесс включает в себя несколько факторов транскрипции, ядерные рецепторы гормонов и коактиваторы транскрипции, которые совместно действуют для координации изменений в экспрессии генов, кодируемых ядерной и митохондриальной ДНК [61]. Предыдущие исследования пытались определить, какие пути могут лежать в основе митохондриального биогенеза, индуцированного добавками CF. Стимуляция NO-зависимой передачи сигналов стала центральным путем, участвующим в митохондриальном биогенезе. Добавка CF усиливает образование NO путем ингибирования фермента аргиназы, расщепляющего аргинин, что увеличивает доступность L-аргинина для биосинтеза NO [62,63]. Более того, при использовании ингибитора eNOS стимулирующее действие эпикатехина на биогенез митохондрий частично притуплялось [17]. Эти результаты предполагают участие других сигнальных путей для стимуляции митохондриального биогенеза.

Недавно Арагонес и др. (2016) сообщили, что пищевые проантоцианидины, члены семейства полифенолов, усиливают метаболизм NAD+ в печени путем усиления пути биосинтеза de now o NAD+ и активности Sirte дозозависимым образом у крыс [12]. Кроме того, печень экспортирует предшественники NADt в другие органы, такие как скелетные мышцы, которые обладают меньшей способностью синтезировать NAD, что повышает вероятность распространения эффектов, наблюдаемых в печени, на весь организм [64]. В то время как в некоторых исследованиях сообщается о влиянии добавок CF на содержание, активность или мРНК белка Sirt1 [12, 15-17, 65, 66], участие метаболизма NAD в митохондриальном биогенезе после добавок CF с использованием потери или увеличения функция никогда не проверялась. Хотя нокаут, специфичный для мышц, был бы предпочтительнее, чем мыши Sirt3 KO всего тела, использованные в нашем исследовании, наши результаты показывают, что CF улучшает метаболизм NAD, и Sirt3 участвует в этом улучшении активности митохондриальной транспортной цепи электронов, вызванной добавками. Положительные эффекты, наблюдаемые на активности митохондриальных комплексов после приема CF, не наблюдались у мышей Sirt3-7, а более высокая активность комплексов I и IV наблюдалась после приема CF только у WT. Эти наблюдения дополняют предыдущие работы, показывающие, что Sirt3 играет ключевую роль в митохондриальной функции [67]. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сиртуины посредством модуляции метаболизма НАД участвуют в улучшении митохондриальной массы, наблюдаемом после приема CF. 4.4.Ограничения

Какао-бобы состоят из смеси мономерных, олигомерных и полимерных флаванолов. Среди флаванолов EPI, по-видимому, является наиболее распространенным полифенольным мономером, обнаруженным в продуктах из какао, на долю которого приходится до 35 процентов содержания полифенолов [68]. EPI был признан основной биоактивной молекулой, лежащей в основе преимуществ, связанных с добавлением какао и шоколада [47,69]. Однако метаболиты EPI (EPIm) могут быть вовлечены в индуцированные EPI биологические эффекты, наблюдаемые в исследованиях in vivo. EPIm может достигать более высоких концентраций в плазме, чем EPI[70]. Более того, между видами наблюдались серьезные различия в EPIm. Действительно, 80 процентов EPIm, присутствующих у людей, не были обнаружены у крыс, в то время как сходство между мышами и людьми оказалось немного более благоприятным, поскольку были обнаружены два основных метаболита человека [70]. Мы использовали обогащенный экстракт CF, содержащий в пять раз больше EPI, чем неферментированные какао-бобы[71]. Кроме того, содержание ЭФИ было снижено на 10-20 процентов в результате ферментации и уменьшалось в зависимости от температуры во время обжарки [71,72]. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что внимание следует уделять только содержанию EPI при оценке пользы добавок EPI для здоровья человека, и настоящие результаты следует рассматривать с осторожностью, прежде чем экстраполировать наблюдаемые основные механизмы на людей.

5. Выводы

Ежедневный прием CF в течение 15 дней приводит к улучшению функции митохондрий в окислительных и гликолитических мышцах. Настоящие результаты предполагают, что усиленное митохондриальное дыхание приводит к увеличению митохондриальной массы, в то время как клеточный уровень продукции АФК сохраняется, что предполагает качественную адаптацию внутри митохондрий. Одновременно с клеточным влиянием на метаболизм NO, описанным ранее [73], CF модулирует метаболизм NAD, который стимулирует активность сиртуинов. Sirt3 играет центральную роль в митохондриальной адаптации и метаболической гибкости после приема CF. Поскольку сиртуины являются недавними мишенями в патогенезе различных заболеваний, таких как диабет или астма [74,75], дальнейшие исследования изучат потенциальный интерес использования CF в качестве естественного активатора сиртуинов.

использованная литература

1. Кузнецов А.В.; Векслер, В.; Геллерих, Ф. Н.; Сакс, В.; Маргрейтер, Р .; Кунц, В.С. Анализ митохондриальной функции in situ в пермеабилизированных мышечных волокнах, тканях и клетках. Нац. протокол 2008, 3, 965–976. [Перекрестная ссылка]

2. Сена, Луизиана; Чандель, Н.С. Физиологические роли митохондриальных активных форм кислорода. Мол. Ячейка 2012, 48, 158–167. [Перекрестная ссылка]

3. Вакье, Б.; Комбеттс, Л.; Ван Ниеу, GT; Дюпон, Г. Взаимодействие между внутриклеточными колебаниями Ca2+ и Ca2+-стимулированным митохондриальным метаболизмом. науч. Респ. 2016, 6, среп19316. [Перекрестная ссылка]

4. Суомалайнен-Вартиоваара, А.; Баттерсби, Б. Дж. Митохондриальные заболевания: вклад стрессовых реакций органелл в патологию. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 2018, 19, 77–92. [Перекрестная ссылка]

5. Хейман, Э.; Дауссен, Ф .; Вечорек, В.; Кайаццо, Р .; Матран, Р .; Бертон, П.; Окутюрье, Дж.; Бертуан, С .; Дескатуар, А .; Леклер, Э.; и другие. Снабжение мышц кислородом и его использование при диабете 1 типа, от атмосферного воздуха до митохондриальной дыхательной цепи: есть ли ограничивающий шаг? Diabetes Care 2020, 43, 209–218. [Перекрестная ссылка]

6. Дауссен, Ф.Н.; Буланже, Э.; Лансель, С. От митохондрий к саркопении: роль воспаления и участие оси RAGE-лиганда. Эксп. Геронтол. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Кац, Д.Л.; Даути, К.; Али, А. Какао и шоколад в здоровье и болезнях человека. Антиоксид. Окислительно-восстановительный сигнал. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Грасси, Д.; Липпи, К.; Некоционе, С.; Дезидери, Г.; Ferri, C. Кратковременное введение темного шоколада сопровождается значительным повышением чувствительности к инсулину и снижением артериального давления у здоровых людей. Являюсь. Дж. Клин. Нутр. 2005, 81, 611–614. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

9. Грасси, Д.; Дезидери, Г.; Некоционе, С.; Липпи, К.; Казале, Р.; Проперци, Г.; Блумберг, Дж. Б.; Ferri, C. Артериальное давление снижается, а чувствительность к инсулину повышается у гипертоников с непереносимостью глюкозы после 15 дней употребления темного шоколада с высоким содержанием полифенолов. Дж. Нутр. 2008, 138, 1671–1676. [Перекрестная ссылка]

10. Оттавиани, Дж.И.; Мама, Тайвань; Хейсс, К.; Квик-Урибе, К.; Шретер, Х .; Кин, С.Л. Стереохимическая конфигурация флаванолов влияет на уровень и метаболизм флаванолов в организме человека и их биологическую активность in vivo. Свободный Радик. биол. Мед. 2011, 50, 237–244. [Перекрестная ссылка] [PubMed]