Отличительная экспрессия генов толл-подобных рецепторов и глиальный ответ в разных областях мозга естественного скрапи. Часть 1

Абстрактный:

Прионные заболевания — это хронические и фатальные нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся накоплением специфического для болезни прионного белка (PrPSc), губчатыми изменениями, гибелью нейронов и глиозом.

Прионовая болезнь, также известная как болезнь храмовой ярмарки, воскоедящая болезнь и т. д., представляет собой острую вирусную инфекцию, вызываемую прионами. Заболевание в основном передается при употреблении в пищу сырой пищи, содержащей прионы. После заражения прионами он может вызвать воспаление головного мозга и повреждение нервной системы, а также могут возникнуть такие симптомы, как головная боль, рвота и лихорадка.

Однако, столкнувшись с такой ситуацией, мы не можем потерять доверие к своей памяти из-за существования прионной болезни. Большинство инфицированных людей могут выздороветь и восстановить память после лечения.

Конечно, с профилактической точки зрения мы можем попытаться есть больше приготовленной пищи, чтобы избежать прионного заражения. В то же время, если вы чувствуете какие-либо симптомы, вам также следует как можно скорее обратиться к врачу, чтобы не допустить обострения заболевания.

В повседневной жизни мы можем попробовать некоторые простые тренировки памяти, такие как чтение, составление списков, организация событий и информации и т. д., чтобы улучшить нашу память. Эти тренировки не требуют много времени и энергии, но очень важны для поддержания здоровья мозга и эффективной работы памяти.

Короче говоря, сталкиваясь с такими заболеваниями, как прионовая болезнь, мы должны относиться к этому позитивно, обращаться к профессиональному медицинскому лечению и профилактическим мерам, а также уделять внимание ежедневным упражнениям на память, чтобы обеспечить наше физическое здоровье и эффективную работу. Видно, что нам нужно улучшить память, а цистанхе может значительно улучшить память, потому что цистанхе — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффект Cistanche обусловлен различными содержащимися в нем активными ингредиентами, в том числе дубильной кислотой, полисахаридами, флавоноидными гликозидами и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

Нажмите, чтобы узнать, как улучшить работу мозга

Все больше данных показывает, что нейровоспалительная реакция является ключевым компонентом прионтических заболеваний и способствует нейродегенерации.

Toll-подобные рецепторы (TLR) были предложены в качестве важных медиаторов врожденных иммунных реакций, запускаемых в центральной нервной системе при других нейродегенеративных заболеваниях человека, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз.

Однако о роли TLR в прионовых заболеваниях известно мало, а их участие в нейропатологии естественного скрепи не изучено. Мы оценили экспрессию генов овечьих TLR в четырех анатомически различных областях мозга у овец, инфицированных скрепи, и оценили возможные корреляции между экспрессией генов и патологическими признаками прионной болезни.

Мы наблюдали значительные изменения в экспрессии TLR у овец, инфицированных скрепи, которые коррелируют со степенью спонгиоза, отложения PrPSc и глиоза в каждом из изученных регионов.

Примечательно, что TLR4 был единственным геном, активность которого повышалась во всех регионах, независимо от тяжести нейропатологии. В гиппокампе мы наблюдали более легкую нейропатологию, связанную с отчетливым профилем экспрессии гена TLR и наличием своеобразной морфологии микроглии, называемой палочковой микроглией, описанной здесь впервые в мозге овец, инфицированных скрепи.

Совпадение этих признаков позволяет предположить частичную нейропротекцию гиппокампа. Наконец, сравнение результатов у естественно инфицированных овец с моделью на мышах увеличенного размера (мыши tg338) выявило различные закономерности экспрессии гена TLR.

Ключевые слова: прион; скрепи; толл-подобные рецепторы; нейровоспаление; микроглия; астроциты.

1. Введение

Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (ТГЭ), или прионные заболевания, представляют собой группу фатальных нейродегенеративных заболеваний, которые включают болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ) у людей, скрепи у овец и коз, губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (ГЭКРС) у крупного рогатого скота и хроническую истощающую болезнь у оленей. УВД).

Эти TSE характеризуются трансформацией кодируемого хозяином прионного белка (PrPC) в инфекционную изоформу PrPSc, которая преимущественно накапливается в нервной системе и лимфоретикулярной системе (LRS), а также воспалительной иммунной реакцией в центральной нервной системе (ЦНС) [1 ,2]. Прионные заболевания, такие как скрепи, могут передаваться естественным путем при пероральном контакте с PrPSc.

После прохождения кишечного барьера и первичной репликации в лимфоидных тканях PrPSc достигает ЦНС посредством процесса, известного как нейроинвазия. Инфекция распространяется из участков желудочно-кишечного тракта через блуждающий и внутренностный нервы в ствол головного мозга и спинной мозг соответственно [3,4].

Достигая ЦНС, PrPSc распространяется из каудальных торостральных отделов, т. е. через ростральный ствол мозга в мозжечок, промежуточный мозг и лобную кору [5]. Анатомически стереотипное накопление PrPSc предполагает, что его распространение опосредовано связями нейронов и/или избирательной уязвимостью различных областей мозга.

Факторы хозяина, такие как генотип PrPSc, порода и возраст на момент заражения, способствуют величине отложения PrPSc и распространению губчатых поражений.

Однако молекулярная основа взаимодействий хозяин-прион, которые определяют селективное нацеливание PrPSc на определенные области мозга, остается неизвестной и представляет собой один из наиболее интригующих аспектов феномена прионного штамма.

Первоначально предполагалось, что иммунная система не отвечает на PrPSc из-за естественной толерантности, но исследования динамики выявили быструю активацию и пролиферацию микроглии и астроцитов еще до появления клинических признаков и дегенерации нейронов [6–8].

Эта ранняя активация и пролиферация микроглии и астроцитов, по-видимому, играют центральную роль в патогенезе прионных нарушений, хотя молекулярные механизмы, участвующие в их активации, и точная роль как реактивных астроцитов, так и микроглии в патогенезе заболевания остаются неясными [9,10].

Более того, широко признано, что распределение и фенотип микроглии и астроглии варьируются в зависимости от области мозга и вида [11–14], приписывая внутренние характеристики каждой области, которые влияют на уязвимость к нейродегенерации [10,15,16].

Этот феномен особенно очевиден на доклинической стадии, во время которой и микроглия, и астроглия реагируют на прионную инфекцию регионально-специфичным образом.

Однако по мере прогрессирования заболевания начинает преобладать более распространенная нейровоспалительная реакция, размывая большинство региональных характеристик [17,18]. За последние несколько лет сообщалось о роли Toll-подобных рецепторов (TLR) в микроглиальной и астроглиальной реактивности. при некоторых нейродегенеративных расстройствах, что подчеркивает их влияние на прогрессирование этих заболеваний [19–21].

Однако данные о роли прионных заболеваний TLRsin скудны. Частично защитная роль TLR описана при прионной патологии. В частности, сообщалось, что потеря TLR2 [22] и TLR4 [23] ускоряет прионный патогенез, тогда как стимуляция TLR9 замедляет прогрессирование заболевания на мышах [24,25].

На сегодняшний день большинство исследований TLR при прионных заболеваниях проведено in vitro или на моделях мышей [8,22,26–29], а их роль у естественно инфицированных животных и людей остается неопределенной. Насколько нам известно, одно исследование было проведено на новорожденных ягнятах, перорально инокулированных скрепи (т.е. с использованием естественного, но не естественно инфицированного хозяина), и выявило сверхэкспрессию TLR2 и TLR4 в крови на клинических стадиях заболевания [30].

В двух исследованиях сообщалось об изменении экспрессии гена TLR у людей со спорадической БКЯ (сБКЯ) [31,32]. Нарушение регуляции генов, участвующих в иммунном ответе, включало сверхэкспрессию мРНК TLR4 и TLR7 в мозжечке и лобной коре пациентов с сБКЯ MM1 и TLR7 в мозжечке пациентов с сБКЯ ВВ2.

Более того, Areskeviciuteet al. [32] включили TLR4 в топ-40 вышестоящих регуляторов, которые, по прогнозам, будут демонстрировать дифференциальную экспрессию в образцах головного мозга с сБКЯ по сравнению с контрольными образцами. Мы исследовали, как естественная инфекция скрепи влияет на уровни транскрипции овечьих TLR и некоторых цитокинов в четырех областях мозга с различной степенью восприимчивости к прионам, на основе предыдущие результаты [18].

Количественный ПЦР-анализ (кПЦР) выявил изменения в экспрессии генов в группе, инфицированной скрепи, по сравнению с контрольной группой, а также ответ, зависящий от региона мозга.

Интересно, что гиппокамп показал наиболее характерный профиль поражения со специфической реактивной морфологией микроглии и паттерном транскрипции TLR. Учитывая недостаток экспериментальных данных об экспрессии гена TLR у мышей со сверхэкспрессией овечьего PrP, мы также провели эксперименты с использованием мышей tg338, интрацеребрально инокулированных скрапи.

Наши результаты обнаруживают некоторое сходство с предыдущими исследованиями с использованием мышей дикого типа, но существенные различия в результатах, полученных на естественном скрепи.

2. Результаты

2.1. Нейропатология скрепи у естественно инфицированных овец

Мы впервые подтвердили невропатологию скрепи у естественно инфицированных овец, включенных в это исследование, как описано ранее [33–36]. Спонгиоз, отложение PrPSc и реактивную глию исследовали в четырех областях мозга инфицированных и контрольных овец: продолговатом мозге (Mo), таламусе (Th), гиппокампе (Hc) и лобной коре (Fc).

Все естественно инфицированные животные находились в клинической стадии заболевания. Однако клинический статус, основанный на частоте и тяжести клинических признаков, варьировал среди овец, начиная от начальной и заканчивая продвинутой клинической стадией (таблица 1).

На рисунке 1 показаны репрезентативные микрофотографии для оценки вакуолизации и иммуноокрашивания на PrPSc, GFAP и Iba1, сделанные в каждой из выбранных областей у инфицированных и контрольных животных.

Как и ожидалось, в срезах тканей контрольной овцы не было обнаружено никаких признаков вакуолизации или отложения PrPSc. И наоборот, у овец, инфицированных скрепи, во всех нейроанатомических областях наблюдался спонгиоз, отложение PrPSc и реактивная глия (p < 0,05).

Интенсивность вакуолизации, отложения PrPSc и глиоза уменьшалась от продолговатого мозга к лобной коре. Интересно, что, несмотря на близость таламуса и гиппокампа, наблюдались существенные различия в баллах по всем патологическим маркерам.

Наибольшая степень спонгиоза наблюдалась в продолговатом мозге и таламусе, в отличие от весьма рассеянной вакуолизации, обнаруживаемой в гиппокампе и лобной коре.

Внутринейрональная вакуолизация была обильной в ядрах продолговатого мозга, как показано в дорсальном двигательном ядре блуждающего нерва, тогда как нейропильный спонгиоз преобладал в таламусе и лобной коре (рис. 1А). В нейропиле гиппокампа обнаружено очень мало вакуолей.

Рисунок 1. Репрезентативная невропатология и иммуногистохимическая оценка спонгиоза, отложения PrPSc, микроглиоза и астроглиоза в ЦНС контрольных и инфицированных скрепи овец в продолговатом мозге (Mo), таламусе (Th), гиппокампе (Hc) и лобной коре (Fc). .

На графиках показаны значения полуколичественной оценки для каждого анализируемого параметра. (А) Окрашивание гематоксилином-эозином показало изменения спонгиоза в ЦНС у овец, инфицированных скрепи, и отсутствие спонгиоза у овец контрольной группы. (B) Обнаружение PrPSc с помощью антитела L42 в участках мозга овец, инфицированных скрепи.

В контрольной группе иммуномаркирования не обнаружено. (C) Иммуноокрашивание ионизированной кальций-связывающей адаптерной молекулы -1(Iba1) показало повышенную реактивность микроглии у овец, инфицированных скрепи, по сравнению с контрольной группой.

(D) Иммуноокрашивание глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), демонстрирующее повышенную реактивность овец, инфицированных скрейпи астроглиозином, по сравнению с контрольными овцами. (E) Статистическое сравнение спонгиоза, отложения PrPSc, Iba1 и интенсивности GFAP между областями мозга.

Оценки варьируются от 0 (отрицательный) до 5 (максимальная интенсивность). Значительные различия в спонгиозе, PrPSc, Iba1 и GFAP определяли с использованием t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни для нормально и ненормально распределенных данных соответственно.

Статистические различия между областями мозга определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) или теста Крускала-Уоллиса для нормально и ненормально распределенных данных соответственно. * p < 0.05, ** p < 0,01. Масштабная линейка=200 мкм.

У всех овец, инфицированных скрепи, наблюдалось широко распространенное накопление PrPSc в четырех проанализированных областях ЦНС, за исключением трех овец, у которых наблюдались начальные клинические признаки и которые были отрицательными по PrPSc по данным иммуногистохимии (ИГХ) и вестерн-блоттинга (WB) в лобной коре (таблица 1).

Интенсивность иммуноокрашивания PrPSc выявила каудальное снижение, аналогичное наблюдаемому при спонгиозе, с максимальной интенсивностью в продолговатом мозге и таламусе, двух областях с наибольшей степенью вакуолизации, и более низкой интенсивностью в гиппокампе и лобной коре (рис. 1B).

В гиппокампе иммуноокрашивание PrPSc показало очаговое и неравномерное распределение, в отличие от гомогенного, рассеянного рисунка пунктатов, наблюдаемого в лобных срезах коры.

Мы наблюдали четыре основных морфологических паттерна отложения PrPSc, как описано ранее [36]: два внутриклеточных паттерна, которые включали внутринейрональное и внутриглиальное (включая внутриастроцитарное и внутримикроглиальное) отложение, и два паттерна клеточной мембраны/внеклеточного паттерна, которые включали нейропил-ассоциированный и глиальный клеточный паттерн. сопутствующее отложение (рис. S1).

Во всех областях мозга преобладали интранейрональные и нейропил-ассоциированные паттерны. Примечательно, что инталио- и глиальные паттерны были резко уменьшены или даже отсутствовали в лобной коре и гиппокампе по сравнению с продолговатым мозгом и таламусом. Параллельно с ИГХ мы анализировали наличие протеазо-резистентных прионов (PrPres) с помощью WB.

Образцы мозга овец, инфицированных скрепи, демонстрировали классический трехполосный паттерн PrPres, связанный с классическим скрепи, с молекулярной массой негликозилированного фрагмента примерно 19 кДа (рис. 2).

Несмотря на определенную степень вариабельности, сигнал PrPres увеличивался с тяжестью клинических признаков во всех отделах мозга и был более многочисленным в каудальных отделах мозга.

ВБ для PrPres был положительным в продолговатом мозге и таламусе у всех овец, инфицированных скрепи. Напротив, образцы гиппокампа и лобной коры не были положительными на PrPres у всех инфицированных животных.

Хотя IHC был положительным на PrPres в гиппокампе всех инфицированных овец, 4 из 13 были отрицательными по WB. В лобной коре 3/13 овец были PrPres-отрицательными по IHC, а 4/13 были PrPres-отрицательными по WB.

Помимо вакуолизации и отложения PrPSc, активация глиальных клеток широко документирована как раннее событие патогенеза заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белков.

Чтобы охарактеризовать реактивную глию, все области мозга были подвергнуты ИГХ с использованием антител против GFAP для обнаружения астроцитов и антител против Iba1 для обнаружения микроглии.

Иммуноокрашивание Iba1, которое выявляет как покоящую, так и активированную микроглию [37], было значительно увеличено во всех областях мозга у инфицированных скрепи овец по сравнению с контрольной группой и выявило заметные различия в морфологии микроглии среди областей мозга у инфицированных животных (рис. 1C).

Статус активации клеток микроглии определяется на основе трех основных морфологий: разветвленной, гипертрофической и амебоидной [38,39]. Клетки микроглии в «наблюдающем» или относительно неактивном состоянии имеют разветвленную морфологию, характеризующуюся небольшим клеточным телом со множеством тонких отростков, как это наблюдалось у наших контрольных животных.

Активное состояние характеризуется амебоидной морфологией, которая обычно ассоциируется с фагоцитарным состоянием [38] и состоит из сферических, неразветвленных клеточных тел. Гипертрофическая морфология характеризуется микроглией с более крупным клеточным телом и более короткими и толстыми отростками и связана с выработкой и высвобождением медиаторов воспаления [40,41].

Амебоидная морфология была наиболее распространена в продолговатом мозге овец, инфицированных скрепи. В таламусе наблюдалась амебоидная морфология, но она не преобладала: множество крупных и тонких отростков смешивались с редкими, толстыми отростками, возникающими из удлиненных клеточных тел, соответствующих гипертрофированной микроглии.

Морфология пролиферативной микроглии лобной коры и гиппокампа резко отличалась от таковой продолговатого мозга и таламуса. В обоих регионах преобладала гипертрофированная микроглия, а амебоидная микроглия практически отсутствовала.

Примечательно, что область Cornu Ammonis 3 (CA3) гиппокампа показала наибольшие различия с точки зрения морфологии микроглии, демонстрируя структуру микроглии, известную как палочковидная микроглия, которая не наблюдалась ни в одной другой области мозга.

Эти заметные различия, наблюдаемые при оценке гиппокампа, побудили нас провести детальное исследование подполей СА1, 3, 4 и лакунозо-молекулярного слоя (SLM).

Рисунок 2. Обнаружение PrPres методом вестерн-блоттинга в ЦНС контрольных и естественных овец, инфицированных скрепи. Для адекватного сравнения были загружены равные количества белка, и иммуноблоттинг был проведен с использованием моноклональных антител SHA31 для анализа образцов из (A) продолговатого мозга, (B) ) таламус, (В) гиппокамп и (D) лобная кора от скрепи-инфицированных овец с начинающимися клиническими признаками (образцы 1–5) и с развитыми клиническими признаками (образцы 6–13). В строке 14 показан отрицательный контроль, а в строке 15 - образец гомогената мозга неинфицированной овцы, не подвергнутый pK-перевариванию.

Иммуноокрашивание GFAP выявило выраженный астроглиоз у овец, инфицированных скрепи, по сравнению с контрольной группой (рис. 1D). Морфологически астроциты инфицированных овец последовательно демонстрировали гипертрофированные клеточные тела и отростки, подтверждая наличие реактивного астроглиоза, в то время как контрольные овцы демонстрировали типичную звездчатую морфологию неактивированного состояния.

В продолговатом мозге и таламусе иммуноокрашивание GFAP было более интенсивным, с появлением сетей астроцитов за счет перекрывающихся процессов. В гиппокампе и лобной коре астроциты были распределены равномерно, с наличием изолированных гипертрофированных звездчатых тел.

For more information:1950477648nn@gmail.com