Цистанхе: эхинакозид подавляет рост клеток аденокарциномы поджелудочной железы, индуцируя апоптоз через митоген-активируемый путь протеинкиназы

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

ВЭЙ ВАН, ДЖИНБИНЬ ЛУО, ИНХУЙ ЛЯН и СИНФЭН ЛИ

Абстрактный.

Клиническое применение натуральных продуктов, полученных из традиционной китайской медицины, привлекло внимание в химиотерапии рака.Эхинакозид(ECH), один из фенилэтаноидов, выделенный из стеблейЦистанхе(китайское растительное лекарственное средство) оказывает тканезащитное и антиапоптотическое действие на центральную нервную систему. Однако остается неясным, обладает ли ЭХГ противоопухолевой активностью. В настоящем исследовании было продемонстрировано, что ЭХГ может заметно ингибировать пролиферацию клеток аденокарциномы поджелудочной железы, индуцируя выработку активных форм кислорода и нарушение потенциала митохондриальной мембраны и, таким образом, запуская апоптоз. Кроме того, выяснилось, что ECH(Эхинакозид)подавляет рост опухолевых клеток за счет модуляции активности МАРК. В заключение, это исследование раскрывает новую функцию ЭХГ (Эхинакозид) в предотвращении развития рака и подразумевает, что использование ЭХГ может быть потенциальной химиотерапевтической стратегией при раке.

Введение

Путь опухолевого супрессора p53 посредством индукции опухолевого супрессора, ARF, смягчает опосредованную онкогенной E{1}}лигазой мышиную двойную минуту (MDM)2-опосредованную деградацию p53 (3). Это саморегулирующийся самозащитный механизм, который предотвращает злокачественную трансформацию клеток. Примечательно, что p53 может подавлять активность Myc, активируя транскрипцию, например, miR-145, которая нацелена наМой смРНК для молчания трансляции (4,5), таким образом формируя регуляторную петлю отрицательной обратной связи.

Наиболее простой и эффективной стратегией лечения рака является уничтожение раковых клеток. Показано, что широко используемые противораковые препараты, такие как цисплатин (6), актиномицин D (7) и адриамицин (8), ингибируют рост опухоли, стимулируя апоптоз. В последнее время появляется все больше данных о том, что ряд натуральных продуктов и производных растений, особенно лекарственных растений, используемых в традиционной китайской медицине (ТКМ), обладают противоопухолевой функцией, вызывая апоптоз раковых клеток, и имеют потенциал для клинического применения. в терапии рака (9). Например, природный антрахинон эмодин выделяют из многочисленных типов раковых клеток (10,11). Камптотецин, производное от китайского «счастливого дерева»,Камптотека острый, является ценным природным продуктом, который ингибирует лигирование ДНК после опосредованных topo I разрывов цепи (12). В другом ретроспективном популяционном когортном исследовании, включавшем в общей сложности 729 пациентов с распространенным раком молочной железы, было высказано предположение, что ТКМ может способствовать лечению рака. Из этой когорты 115 пациентов применяли ТКМ, а 614 пациентов не использовали ТКМ. Многофакторный анализ показал, что по сравнению с теми, кто не употреблял ТКМ, использование ТКМ было связано со значительно сниженным риском смертности от всех причин (13). Все вышеупомянутые результаты показали, что ТКМ является важной дополнительной и альтернативной медициной, которую можно использовать при лечении рака.

мыши с острым повреждением легких (16,17). Кроме того, ЭЧ(Эхинакозид)было показано, что он оказывает защитное действие на нервную ткань и улучшает поведенческие расстройства у мышиных моделей болезни Паркинсона (18). Примечательно, что было обнаружено, что ЭХГ способствует пролиферации клеток и ингибирует апоптоз в эпителиальных клетках кишечника мышей MODE-K (19). Однако до сих пор меньше внимания уделялось потенциальной роли ЭХГ в профилактике рака.

В этом исследовании изучалось, влияет ли лечение ЭХГ на рост и пролиферацию опухолевых клеток, а также влияет ли ЭХГ на рост и пролиферацию опухолевых клеток.(Эхинакозид)индуцирует апоптоз, повышает выработку активных форм кислорода (АФК) и снижает потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и, следовательно, подавляет рост опухолевых клеток. Кроме того, настоящее исследование было направлено на выявление молекулярных механизмов, ответственных за ингибирование роста клеток, опосредованное ЭХГ.

Материалы а также методы

Клетка линия, реагент, а также антитела.Клетки аденокарциномы поджелудочной железы SW1990 (ATCC, Манассас, Вирджиния, США) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 50 ЕД/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина при 37°C в Увлажненная атмосфера с 5-процентным содержанием CO2. ЭХ(Эхинакозид)был приобретен у Jrdun Biotechnology Corp. (Шанхай, Китай). Антитела против AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 и GAPDH были приобретены у Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); анти-Bax и анти-Bcl-2 были приобретены у Santa Cruz Biotechnology Inc. (Санта-Круз, Калифорния, США); а антикаспаза-3 была приобретена у Abcam (Шанхай, Китай).

Клетка жизнеспособностьпроба. Для оценки скорости роста опухолевых клеток использовали набор для подсчета клеток{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Суспензию клеток высевали по 5 000 клеток на лунку с обработкой ЭХГ в течение 0, 12, 24, 48 или 72 ч в 96 -луночные культуральные планшеты. Ингибирование роста клеток определяли путем добавления реагента WST-8 из набора CCK-8 в конечной концентрации 10 процентов в каждую лунку, а оптическую плотность образцов измеряли при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США).

Хёхст 33342 окрашивание.Клетки (60-процентное слияние) обрабатывали Hoechst 33342 (Институт биотехнологии Beyotime, Хаймен, Китай) в конечной концентрации 1 мкл.µг/мл, инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 15 минут, дважды промывали фосфатно-солевым буфером, фиксировали в 4-процентном параформальдегиде в течение 30 минут при комнатной температуре и наносили на предметные стекла. Морфологические изменения ядер клеток наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Нормальные ядра были круглыми и окрашивались в светло-голубой цвет, в то время как апоптотические ядра сморщились и окрашивались в ярко-синий цвет.

Флуоресцентно-активированный клетка сортировка (ФАКС) анализы.Для оценки апоптоза использовали набор флуоресцеинизотиоцианат (FITC)-аннексин V для обнаружения апоптоза (BD Biosciences, Шанхай, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки 5x104 промывали ледяным PBS, ресуспендировали в 0,1 мл связывающего буфера (Beyotime Institute of Biotechnology) и окрашивали 10 мл FITC-конъюгированного аннексина V (10 мг/мл) и 10 мл пропидия йодида (ИП) (50 мг/мл). После инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте и добавления 400 мл буфера для связывания клетки анализировали с помощью проточного цитометра (C6; BD Biosciences, Шанхай, Китай).

Измерение из реактивный кислород разновидность (РОС).Для оценки продукции АФК использовали набор для анализа реактивных форм кислорода (Vigorous Biotechnology, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки (слияние 80 процентов) собирали и промывали PBS перед окрашиванием раствором дигидроэтидия (DHE) (Институт биотехнологии Beyotime). Затем клетки анализировали методом проточной цитометрии.

Измерение из митохондриальный мембрана потенциал (ММП).

Набор для анализа метилового эфира тетраметилродамина (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Блумингтон, Миннесота, США) использовали для обнаружения изменений в MMP. Вкратце, клетки (слияние 80 процентов) собирали, промывали PBS и окрашивали TMRM в течение 15-20 минут в инкубаторе при 37°C. Затем клетки однократно промывали PBS и подвергали анализу с помощью проточной цитометрии.

Иммуноблоттинганализы. Клетки (80 процентов слияния) собирали и лизировали в буфере RIPA (Jrdun Biotechnology), состоящем из 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4; 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 процент NP-40, 1 процент дезоксихолевой кислоты натрия и 0,1 процента SDS и свежедобавленные ингибиторы протеасом. Равные количества лизата прозрачных клеток использовали для иммуноблоттинга, как описано ранее (20).

Статистический анализ.Количественные данные выражены как среднее ± стандартное отклонение. Статистические различия оценивали с помощью непарного критерия Стьюдента с использованием статистического программного обеспечения SPSS 15.0. п<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Полученные результаты

ЭХ (Эхинакозид)подавляет опухоль клеткарост. Хотя сообщалось, что ECH(Эхинакозид)проявляет защитную роль, ингибируя апоптоз и воспалительные сигналы в соматических клетках, таких как нейрональные и кишечные эпителиальные клетки (16-19), остается неясным, контролирует ли ЭХГ рост и пролиферацию раковых клеток. Чтобы проверить это, был проведен анализ выживаемости клеток путем обработки клеток SW1990, полученных из аденокарциномы поджелудочной железы II степени, титрованными дозами ЭХГ, как показано на рис. 1. Примечательно, что было продемонстрировано, что ЭХГ значительно замедляет пролиферацию опухолевых клеток в дозе -зависимым образом в течение 5-дневного периода культивирования (рис. 1).ЭХ триггерыапоптоз. Поскольку потеря апоптоза является одним из основных причинных механизмов, лежащих в основе неконтролируемой пролиферации клеток рака поджелудочной железы (21), в настоящем исследовании был проведен ряд экспериментов, чтобы определить, вызывает ли ЭХГ апоптоз. Во-первых, путем окрашивания ядер опухолевых клеток Hoechst 33342 было продемонстрировано, что ЭХГ приводит к апоптозу дозозависимым образом (рис. 2А). Кроме того, был проведен анализ FACS с использованием окрашивания аннексином V/PI для дальнейшего подтверждения апоптотического эффекта ty ECH (фиг. 2B). Средний процент апоптотических клеток составлял 1,1 процента в нормальных условиях культивирования, в то время как этот процент значительно увеличивался до 10,6, 21,4 и 51,3 процента в ответ на обработку ЭХГ дозозависимым образом (рис. 2С). Эти результаты вместе с анализом жизнеспособности клеток, показанным на рис. 1, демонстрируют, что обработка ЭХГ подавляет пролиферацию опухолевых клеток, вызывая апоптоз.

генерировать этидий, интеркалирующий с ДНК, использовали в этом исследовании для оценки продукции АФК. Было обнаружено, что, как и другие противораковые препараты, ЭХГ также дозозависимо стимулирует выработку АФК, о чем свидетельствует повышенная интенсивность флуоресценции при лечении ЭХГ (рис. 3).

ЭХ (Эхинакозид)уменьшает ММП.Было показано, что митохондриальная дисфункция участвует в индукции апоптоза. Было показано, что открытие митохондриальной поры перехода проницаемости вызывает деполяризацию трансмембранного потенциала и высвобождение проапоптотических факторов (23). Поэтому было проверено, может ли ЭХГ индуцировать потерю ММР в опухолевых клетках, путем проведения анализа TMRM, который является хорошо зарекомендовавшим себя подходом, поскольку интенсивность флуоресценции TMRM пропорциональна мембранному потенциалу. Было продемонстрировано, что лечение ЭХГ значительно снижает ММП дозозависимым образом (рис. 4).ЭХ контролирует опухоль клетка рост с помощью митоген-активируемый белокВ качестве молекулярной основы опосредованной ЭХГ гибели опухолевых клеток изучали активность нескольких жизненно важных сигнальных путей, таких как МАРК и АКТ (24,25), которые контролируют выживание и гибель клеток. МАРК представляют собой эволюционно консервативные пролин-направленные протеинкиназы Ser/Thr, включая киназы, регулируемые внеклеточными сигналами (ERK), c-Jun NH2-терминальную киназу (JNK) и членов семейства p38, которые активируются через три сигнальные каскады киназы уровня (26,27). В данном исследовании оценивали экспрессию МАРК и АКТ, а также их активированных фосфорилированных форм и выявили, что ЭХГ заметно подавляет активность JNK и ERK1/2, но усиливает активность р38 (рис. 5). Примечательно, что было продемонстрировано, что активность AKT, которая также имеет решающее значение для пролиферации клеток, не зависит от обработки ЭХГ (рис. 5). Кроме того, было показано, что обработка ЭХГ повышает экспрессию Bax и каспазы -3, одновременно снижая экспрессию Bcl-2 (рис. 5), что согласуется с рис. 2. Таким образом, результаты показывают, что ЭХГ запускает апоптоз опухолевых клеток посредством пути МАРК.

Обсуждение

Насколько нам известно, это первое исследование, показывающее, что ЭХГ обладает противоопухолевой функцией, вызывая апоптоз (рис. 2), способствуя выработке АФК (рис. 3) и вызывая деполяризацию потенциала митохондриальной мембраны (рис. 4). , что, следовательно, приводит к ингибированию роста опухолевых клеток (рис. 1). Кроме того, было показано, что молекулярная основа ECH-опосредованной гибели опухолевых клеток происходит за счет регуляции сигнальных путей MAPK (Fig. 5). Эти результаты демонстрируют новую функцию ЭХГ в предотвращении онкогенеза и, таким образом, позволяют предположить, что он может быть агентом-кандидатом для лечения рака.

Большинство противоопухолевых препаратов могут индуцировать апоптоз опухолевых клеток, старение и/или остановку клеточного цикла, что приводит к ингибированию роста и пролиферации опухолевых клеток. Остановка клеточного цикла представляет собой клеточный ответ на слабые сигналы стресса, которые позволяют клеткам восстанавливать поврежденную ДНК до начала репликативного синтеза ДНК или митоза, тогда как апоптоз и старение (постоянная остановка клеточного цикла) происходят в ответ на сигналы стресса, которые уничтожают непоправимые или злокачественные клетки. 28,29). Поэтому в этом исследовании оценивали только апоптотическое действие ЭХГ на опухолевые клетки, поскольку уничтожение раковых клеток является основным критерием для оценки эффективности противоопухолевого агента. Примечательно, что было продемонстрировано, что ЭХГ индуцирует экспрессиюБакс(рис. 5), проапоптотический ген, транскрипционно активируемый супрессором опухоли р53 (30). Таким образом, стоит проверить, может ли ЭХГ активировать сигнальный путь р53. Если это так, ЭХГ также может вызывать p53-зависимую остановку клеточного цикла, старение, апоптоз или аутофагию. В этом исследовании была выяснена противоопухолевая функция ECH в клеточной линии аденокарциномы поджелудочной железы SW1990. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, в которых наблюдают больше клеточных линий рака поджелудочной железы. Было показано, что мутации в онкогенном белке RAS и опухолевом супрессоре p53 связаны с развитием рака поджелудочной железы (31); однако клеточная линия SW1990 не несет никакой мутации р53, согласно базе данных р53 IARC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Следовательно, важно исследовать, может ли ECH влиять на рост и пролиферацию других клеточных линий рака поджелудочной железы с различными мутациями p53. Кроме того, было бы интересно определить, способен ли ЭХГ способствовать апоптозу и ингибировать рост других типов опухолей.

Было показано, что повышение уровня АФК и снижение ММР, вызванные обработкой ЭХГ, играют важную роль в индукции апоптоза (22). Кроме того, было обнаружено, что АФК могут индуцировать окисление митохондриальных пор, способствуя высвобождению цитохрома.c, промежуточное звено в апоптозе из-за разрушения ММР (22). Таким образом, еще предстоит определить, разрушает ли ЭХГ ММП опосредованно через индукцию АФК. Кроме того, было показано, что вызванный АФК окислительный стресс участвует в модулировании множества сигналов, контролирующих рост клеток, включая p53, NF-κB, HIF и PI3K (32). Остается определить, регулирует ли ЭХГ эти важные сигнальные пути, и если да, то как. Примечательно, что окислительный стресс вызывает различные нейродегенеративные заболевания из-за высокого потребления кислорода, слабых антиоксидантных систем и характеристик терминальной дифференциации центральной нервной системы (33). Однако несколько исследований показали, что ЭХГ оказывает защитное и антиапоптотическое действие на нервную ткань. В связи с этим разумно предположить, что ЭХГ может снижать продукцию АФК в терминально дифференцированных нервных клетках. Поэтому еще предстоит определить, зависит ли регуляция продукции АФК с помощью ЭХГ от статуса клеточной дифференцировки. Следовательно, настоящие результаты вместе с другими исследованиями показывают, что ЭХГ, широко используемая ТКМ, может быть важной химиотерапевтической стратегией не только для лечения нейродегенеративных заболеваний, но и злокачественных карцином.

В последнее время все большее внимание уделяется использованию ТКМ в лечении рака. Потенциал натуральных продуктов из лекарственных растений, используемых в традиционной китайской медицине, был признан научным сообществом даже в западном мире (9). Необходимы усилия для выяснения основных механизмов действия этих натуральных продуктов, что в конечном итоге может привести к разработке эффективных и безопасных лекарств для лечения рака.

В заключение, настоящее исследование продемонстрировало ингибирующую функцию ЭХГ в отношении опухолей, а также разработало молекулярную основу опосредованного ЭХГ подавления опухоли, что позволяет предположить потенциальное клиническое применение ЭХГ в терапии рака.

Благодарности

Это исследование финансировалось и поддерживалось Ключевой программой научных исследований FMU (грант № 09ZD014). Авторы благодарят компанию Biomedworld (Шанхай, Китай) за помощь в редактировании рукописи.

использованная литература

1. Ханахан Д. и Вайнберг Р.А. Признаки рака: следующее поколение. Ячейка 144: 646-674, 2011 г.

2. Олдертон Г.К.: Транскрипция: Транскрипционные эффекты MYC. Nat Rev Рак 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ и Roussel MF: передача сигналов Myc через опухолевой супрессор ARF регулирует p53-зависимый апоптоз и иммортализацию. Гены Дев 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K и Mo YY: p53 репрессирует c-Myc посредством индукции супрессора опухоли miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Ляо Дж. М., Цао Б., Чжоу С. и Лу Х.: Новое понимание функций р53 через его микроРНК-мишени. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB и Lippard SJ: Цисплатин и репарация ДНК при химиотерапии рака. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H и Korc M: Актиномицин D индуцирует апоптоз и ингибирует рост раковых клеток поджелудочной железы. Int J Рак 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P и Dass CR: Доксорубицин: обновленная информация о противораковом молекулярном действии, токсичности и новых системах доставки лекарств. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Эфферт Т., Ли П.С., Конкималла В.С. и Каина Б.: От традиционной китайской медицины к рациональной терапии рака. Тенденции Mol Med 13: 353-361, 2007.