Влияние фенилэтанолгликозидов на трансформирующий фактор роста – сигнальный путь P1/Smads в фибробластах гипертрофического рубца человека

Влияние фенилэтаноидных гликозидов на трансформирующий фактор роста – сигнальный путь p1/Smads в фибробластах гипертрофического рубца человека

Для получения дополнительной информации:Ali.ma@wecistanche.com

[Абстрактный]Цель На основе сигнального пути трансформирующего фактора роста - pl (TGF - pl)/Smads исследовать эффектыфенилэтаноидные гликозидыизцистанхе трубчатая(CPhGs) на фибробластах гипертрофического рубца человека (HSFbs) и возможный механизм. Методы. С марта по июнь 2019 г. поступило 9 пациентов с гипертрофическим рубцом после анестезии. Фибробласты выделяли из гипертрофического рубца и культивировали. У человека удаляли гипертрофические рубцы и культивировали фибробласты in vitro. Были созданы пустая группа, модельная группа, группа положительного контроля (TGF-pl плюс 5 - фторурацил) и экспериментальная группа (TGF-pl плюс CPhG). Эффектыфенилэтаноидные гликозидыизцистанхе трубчатаяпри различных концентрациях на пролиферацию HSFbs обнаруживали с помощью набора для подсчета клеток {{0}} (CCK - 8). Экспрессию мРНК Smad2, Smad3, Smad7, коллагена I (COL -1) и коллагена HI (COL -3) определяли количественной обратной транскриптазой - полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (RT - qPCR) в каждая группа. Экспрессию белков Smad2, Smad3, фосфорилированного Smad2 (p - Smad2), фосфорилированного Smad3 (p - Smad3), Smad7, COL -1 и COL {{20}} белков определяли вестерн-блоттингом. Данные измерений выражали как среднее ± стандартное отклонение (Mean ± SD). Несколько групп сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Результаты. Степень ингибирования фибробластов после обработки CPhG в дозах 60, 90 и 120 мг/л в течение 48 часов составила (36,87 ± 0,06) процента по сравнению с (43,52 ± 0,04) процента по сравнению с (78,11 ± 0,03). процент , значение F =45.070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="" <="" 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

{{0}}.04 ± 0.04, значение F=14.780, P < {{21="" }}.05)="" ;="" результаты="" вестерн-блоттинга="" показали,="" что="" экспрессия="" белка="" p-smad2="" и="" p-smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3,="" в="" экспериментальной="" группе="" и="" группе="" положительного="" контроля="" была="" значительно="" ниже,="" чем="" в="" экспериментальной="" группе,="" и="" экспрессия="" белка="" smad7="" была="" значительно="" выше,="" чем="" в="" модельной="" группе="" (0,16="" ±="" 0,03="" против="" 0,11="" ±="" 0,02="" против="" 0,06="" ±="" 0,{{="" 26}}),="" (0,12="" ±="" 0,02="">

{{0}}.07 ± 0.{{1{0}}1 по сравнению с 0.04 ±{ {18}}.{{20}}1, значение F =7.670, P <0,05, (0,12 ± 0,03 против 0,15 ± 0,06 против 0,23 ± 0,05, значение F { {24}}.936, П<0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="" <="" 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[Ключевые слова] Фенилэтаноидные гликозидыизцистанхе трубчатая; Гипертрофированные рубцовые фибробласты; Трансформирующий фактор роста - сигнальный путь pl/Smads

Нажмите, чтобы увидеть cistanche Deserticola ma и продукты Cistanche

Гипертрофическое рубцевание (ГС) — фиброзное заболевание кожи, характеризующееся избыточной пролиферацией фибробластов (ФБС), а также отложением внеклеточного матрикса (ВКМ), которые являются основными клетками, обеспечивающими формирование рубца, могут секретировать большое количество коллагена и сигнальный путь трансформирующего фактора роста (TGF) - P/Smads тесно связан с образованием ГС.Цистанхеявляется традиционным тонизирующим средством традиционной китайской медицины, экстракт которого, общий фенилэтаноид уксусной кислоты (cphgs), является одним из основных ингредиентов, оказывающих лечебное действие и обладающих различными биологическими функциями, такими как противовоспалительное, противоопухолевое, антирадиационное, удаление свободных радикалов Исследования показали, что cphgs может ингибировать пролиферацию звездчатых клеток печени, и что он может делать это за счет снижения экспрессии Smad2, Smad3, увеличения экспрессии Smad7, тем самым блокируя трансдукцию сигнального пути tgf-p / Smads, а затем задерживая прогрессирование фиброза печени. Целью этого исследования было наблюдение за влиянием на экспрессию генов и белков, связанных с фибробластами гипертрофического рубца человека (hsfbs), на основе сигнального пути TGF PL/Smad.

материалы и методы

1. Материалы:Цистанхеcphgs были приобретены у Hechen Pharmaceutical Biotech Co., Ltd., Hetian, Китай; Фетальную бычью сыворотку приобретали у Clark Bioscience, США; Набор для подсчета клеток TGF PL был приобретен у компании pepro tech, США; Набор для количественной флуоресцентной ПЦР был приобретен у Takara Corporation, Япония; Все наборы для обратной транскрипции были приобретены у Thermo Fisher Scientific, США; Антитела Smad2/3, p-Smad2/3 были приобретены у компании Cell Signal Technology, США; Антитела к Smad7, COL-1, COL-3, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (gap-dh) были приобретены у abeam (Великобритания); Мембраны из поливинилиденфторида (ПВДФ) были приобретены у компании «Millipore», США.

2. Все случаи были отобраны из отделения ортопедии Первой аффилированной больницы Синьцзянского медицинского университета, и три образца (все из которых были определенно диагностированы как гипертрофический рубец при патологии) были случайным образом выбраны для первичной культуры FBS; Этот эксперимент был одобрен комитетом по медицинской этике Первой аффилированной больницы Синьцзянского медицинского университета (номер утверждения 20170214-71), и от пациентов и их семей было получено информированное согласие.

3. Cell grouping: randomly divided into blank group; Model group: 5 |ug / L TGF - & 1; Positive control: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Experimental group: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >, 120 мг/л) cphgso.

4. Пролиферацию клеток определяли с помощью набора для подсчета клеток (CCK-8): брали hsfbs в логарифмической фазе роста, клетки из каждой группы обрабатывали в соответствии с планом, и значение поглощения каждой лунки каждой группы контролировали последовательно при Длина волны 450 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов через 24, 48 и 72 часа.

5. Обнаружение экспрессии мРНК с помощью RT qPCR: hsfbs из каждой группы собирали после 48 часов вмешательства, выделяли РНК и определяли уровень экспрессии мРНК.

6. Экспрессию белка определяли вестерн-блоттингом. Общий клеточный белок экстрагировали через 48 часов после обработки из каждой группы для определения экспрессии каждого белка.

7. Статистические методы: для анализа использовали статистическое программное обеспечение SPSS 22.0, а данные измерений выражали как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SD), а для сравнения между несколько групп, и P < 0,05 считалось статистически значимым.

Полученные результаты

Результаты клеточной пролиферации показали, что 60, 9{{10}} и 120 мг/л cphgs в течение 48 часов на фибробластах степень ингибирования составила [(36,87 ± 0,06) процентов: (43,52 ±0,04) процента :(78,11 ±0,03) процента ,F=45,073,P< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

Сравнение экспрессии мРНК CoL-I, COL-3, Smad2 и Smad3 в каждой группе: по сравнению с модельной группой, как в положительном контроле, так и в экспериментальных группах удалось снизить CoL-I, индуцированный трансформирующим фактором роста, COL{{ 6}}, экспрессию мРНК Smad2 и Smad3 и способствуют экспрессии мРНК Smad7 со статистически значимыми различиями. (1,56 ± 0.01:0. 30 ± 0.25 : 0,21 ± 0,04, F=39. 755, п<0.01; 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01;="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ;2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ;0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

Сравнение p-Smad2, p-smad3, col-l, COL-3 в каждой группе: по сравнению с контрольной группой экспрессия белка p-Smad2, col-l в модельной группе увеличилась, в то время как у Smad7 уменьшился; По сравнению с модельной группой группа положительного контроля могла подавлять экспрессию белка p-smad3, COL-1, COL-3, а экспериментальная группа продемонстрировала ингибирующий эффект на повышенную экспрессию белка p-smad3. Smad2, p-smad3, столбец - 3. Экспрессия COL-3 ингибировалась в разной степени, тогда как экспрессия Smad7 была относительно увеличена в двух группах, а значения экспрессии белка p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL{{27 }} в пустой группе, группе положительного контроля и экспериментальной группе (0.{{30}}}9 ±0.04,{ {38}}.16 ±{{40}}.03,0.11 ± 0.{{50}}}2 ,0.06 ± 0.00,(0,07 ± 0,03, 0,12 ± 0,02, 0,07 ± 0,01, 0, 04 ± 0, 01, F { {60}}.670,П<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05,="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01),(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02,="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

Обсуждение

ГС является неизбежным исходом репарации тканей, и механизм его возникновения в основном гиперпролиферация ФБС, недостаточная деградация и т. д. приводят к формированию и развитию ГС. Tgf-p1 широко участвует в клеточных, тканевых заболеваниях с аномальной пролиферацией и дифференцировкой и сохраняется на протяжении всего заживления ран; Свои эффекты он оказывает в основном через сигнальный путь tgf-p/Smads, в котором фосфорилирование белков Smad2/3 приводит к усилению экспрессии внутриклеточных и внеклеточных фиброгенных белков, способствует продукции коллагена и ускоряет прогрессирование фиброза; Smad7, как негативный регулятор, может предотвращать этот путь за счет взаимодействия с активированными рецепторами tgf-p1, тем самым уменьшая синтез коллагеновых волокон; Таким образом, либо увеличение экспрессии Smad7, либо ингибирование экспрессии Smad2/3 может предотвратить развитие гипертрофического рубца.

Это исследование применило cphgs Cistanche к HS, кожному фиброзному заболеванию, и обнаружило, что различные дозы cphgs ингибируют пролиферацию hsfbs, индуцированную tgf-p1; Более того, 90 м & / л cphgs ингибировали сигнальный путь, стимулируя экспрессию Smad7 и снижая экспрессию Smad2 / 3 как на уровне экспрессии генов, так и на уровне белков, а также снижали продукцию CoL-I, COL-3, что, в свою очередь, ингибировало прогрессирование HS. Наши результаты подтвердили, что cphgs ингибирует выработку коллагена, вмешиваясь в экспрессию белков, связанных с сигнальным путем tgf-p/Smads, при стимуляции tgf-p1. Результаты настоящего исследования показали, что Cistanche cphgs ингибирует пролиферацию и эффективно снижает секрецию коллагена фибробластами гипертрофического рубца через сигнальный путь tgf-p/Smads.