Влияние различных извлеченных частей Cistanche Deserticola на гипогликемические эффекты у черных мышей Db / Db Ⅱ

2 Экспериментальные методы

2.1 Приготовление продуктов переработки Cistanche Deserticola Cistanche Deserticola:

Возьмите лекарственное сырье Cistanche Deserticola, смойте примеси, пропарьте в кастрюле при нормальном давлении в течение 2 часов, нарежьте на кусочки толщиной 6 мм и высушите при температуре 70 градусов. Cistanche Deserticola: Возьмите кусочки отвара Cistanche Deserticola, добавьте необходимое количество рисового вина, хорошо перемешайте, увлажняйте в течение 8 часов (желтое рисовое вино: вода=1:1), готовьте на пару под высоким давлением в течение 4 часов и сушите при температуре 70 градусов. (Используйте 30 мл рисового вина на каждые 100 г Cistanche Deserticola).

НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ

Служба поддержки Wecistanche — крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 Обогащение различных экстрагированных частей Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola

Возьмите 30 г порошка Cistanche Deserticola/Tamarococcus Deserticola, добавьте в 10 раз большее количество воды, нагревайте и дважды кипятите с обратным холодильником для экстракции по 2 часа каждый раз, объединяйте экстракты, концентрируйте, добавляйте этанол до тех пор, пока содержание спирта не достигнет 60%, осадите при низкая температура в течение 12 часов и фильтрация с отсасыванием. осадок представляет собой неочищенную часть полисахарида. Концентрируют надосадочную жидкость до соответствующей концентрации, наносят ее на макропористую адсорбционную смолу D101 и последовательно элюируют водой и этанолом разных концентраций. Водный элюат собирают и концентрируют при пониженном давлении до густой пасты, представляющей собой общую фракцию олигосахаридов; промыть 40% этанолом. Расслабить, сконцентрировать и высушить при пониженном давлении, что составляет общую гликозидную фракцию Cistanche Deserticola.

2.3 Определение содержания различных извлеченных частей Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola

2.3.1. Определение общего содержания полисахаридов в Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola.

Взвесьте образец глюкозы 20. 00 мг в мерную колбу емкостью 50 мл для приготовления 0. Для стандартного раствора глюкозы 4 мг·мл-1 перенесите пипеткой 3, 4, 5, 6 и 7 мл соответственно в мерную колбу емкостью 50 мл, разбавьте до нужного объема водой и отберите 2,0 мл раствора. каждый раствор глюкозы с градиентом концентрации в пробирку. В качестве холостого контроля возьмите еще такое же количество дистиллированной воды, добавьте в каждую пробирку по 1 мл 5%-ного фенола, хорошо встряхните, быстро добавьте 5 мл концентрированной серной кислоты, оставьте на 10 минут, поставьте на водяную баню с температурой 40 градусов. Через 15 минут выньте его, быстро охладите до комнатной температуры и измерьте значение оптической плотности при 490 нм, примите поглощение (А) по оси ординат, а концентрацию глюкозы (С) по оси абсцисс, нарисуйте стандартную кривую и получите уравнение регрессии Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Точно отвешивают 1,0 г общего порошка полисахаридов сырья и продуктов, помещают их в мерные колбы вместимостью 50 мл соответственно, добавляют воду для растворения и доводят объем до метки, аккуратно набирают 2,0 мл в пробирку и отмеряют в ней же в качестве метода построения стандартной кривой. , вот и все.

2.3.2 Определение содержания бетаина в Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola

2.3.2.1 Приготовление раствора сравнения:

Точно взвесьте 1,17 мг эталонного раствора бетаина, поместите его в мерную колбу емкостью 5 мл, добавьте 50% метанола для растворения и доведите до объема, и раствор готов.

2.3. 2． 2 Хроматографические условия

Хроматографическая колонка Ecosil {{0}}AMINO хроматографическая колонка (4,6 мм×250 мм, 5 мкм), подвижная фаза: ацетонитрил-вода (99,5 ∶ 0.5). , температура колонки: 30 градуса, длина волны обнаружения: 194 нм, скорость потока: 0,6 мл·мин-1, объем ввода 10 мкл, хроматограмма показана на рисунке 1. 2.3.2.3 Приготовление тестируемого раствора Точно взвешивают порошок суммарной фракции олигосахаридов сырья и готового продукта по 1,0 г соответственно, помещают в мерную колбу вместимостью 5 мл, добавляют дистиллированную воду для растворения и доводят до объема, хорошо встряхивают, пропускают через мембранный микропористый фильтр емкостью 0,45 мкл и готово.

2.3.2.4 Определение содержания образца

Точно впитайте общее количество тестируемого раствора олигосахаридов в сыром и приготовленном Cistanche Deserticola, измерьте его в соответствии с условиями «2.3.2.2» и рассчитайте содержание бетаина в образце.

2.3.3 Определение содержания эхинакозида, вербаскозида и гетероцимицифугарина в Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola.

2.3.3.1 Приготовление эталонного раствора

Точно взвесьте 4,50 мг эхинакозида, 4,80 мг вербаскозида и 5,05 мг гетерологичного комимицина в мерные колбы емкостью 5 мл, добавьте 50% метанола для растворения и разведения до метки и возьмите каждый контроль. Поместите 200 мкл раствора образца в инъекцию. во флакон, добавьте 400 мкл 50% метанола и хорошо перемешайте, чтобы получился смешанный раствор сравнения, хорошо встряхните – и готово.

2.3.3.2 Хроматографические условия

Хроматографическая колонка – Ecosil C18 (4,6 мм×250 мм, 5 мкм), метанол – подвижная фаза А, 0.1% муравьиная кислота – подвижная фаза Б, градиентное элюирование, {{ 12}}~45 мин, 30% A→ 70% A, скорость потока 1,0 мл·мин-1, температура колонки 30 градусов, длина волны обнаружения 330 нм, объем инъекции 10 мкл, и хроматограмма представлена ​​на рисунке 2.

2.3.3.3 Приготовление тестируемого раствора

Точно отвесьте 1,0 г общего гликозидного порошка сырья и продуктов, поместите их в мерные колбы вместимостью 100 мл, добавьте 50% метанола до растворения, доведите объем до метки и встряхните. хорошо. Точно наберите 5 мл каждого образца в мерную колбу емкостью 10 мл, добавьте 50% метанола для восстановления объема, хорошо встряхните и пропустите через микропористую фильтровальную мембрану с размером пор 0,45 мкм для получения.

2.3.3.4 Определение содержания образца

Точно отберите пробу общих гликозидов Cistanche Deserticola и измерьте ее в соответствии с условиями «2.3.3.2». Рассчитайте содержание эхинакозида, вербаскозида и гетерологичного соучастника в образце.

2.4 Группировка животных, моделирование и введение лекарств

В помещении для животных 12 часов света и 12 часов темноты, относительная влажность от 50% до 70% и температура в помещении от 18 до 22 градусов. Черных мышей db/db и черных мышей db/m (нормальная контрольная группа) кормили обычным кормом, и эксперимент начинали в возрасте 9 недель. За исключением нормальной контрольной группы, остальные черные мыши db/db были выбраны случайным образом в соответствии с уровнем сахара в крови и массой тела. Разделены на 8 групп, а именно модельная группа, группа положительного контроля, группа общих полисахаридов Cistanche Deserticola, группа общих олигосахаридов Cistanche Deserticola, группа общих глюкозидов Cistanche Deserticola, группа общих полисахаридов Tartschistanche Deserticola, группа общих олигосахаридов Tarthouse Deserticola, группа общих глюкозидов Tartschistanche Deserticola. Кроме обычного контроля

За исключением модельной группы и модельной группы, крысам остальных групп вводили внутрижелудочно в дозе 2 мл/100 г в течение 4 недель подряд. Концентрация жидкости составляла 4,1 г·кг-1. Нормальную контрольную группу и модельную группу лечили одинаково. Введите в желудок определенное количество физиологического раствора.

2.5 Влияние различных экстрагированных частей Cistanche Deserticola на уровень глюкозы в крови черных мышей db/db

2.5.1 Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT)

После 26 дней введения они голодали в течение 12 часов, а через 60 минут после введения на следующий день черным мышам в каждой группе давали 2,0 г·кг-1 глюкозы. в 0, {{10}}.5, 1.0 и 2 соответственно. .0 Для измерения уровня глюкозы в крови была взята кровь из хвостовой вены. По оси ординат было отложено значение глюкозы в крови, по оси абсцисс - время, строили график изменения уровня глюкозы в крови и рассчитывали площадь под линией кривой глюкозы в крови каждой экспериментальной группы по формуле (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. В формуле: A, B, C и D — значения уровня глюкозы в крови через 0, 0,5, 1,0 и 2,0 часа соответственно.

2.5.2 Расчет индекса инсулинорезистентности и индекса атеросклероза

Индекс инсулинорезистентности рассчитывали по литературной методике [20]: HOMA-IR=Глюкоза × Инсулин / 22.5. HOMA - =20 × Инсулин / (Глюкоза - 3.5) × 100%. ИР – инсулинорезистентность и (%) – функция клетки. Молярная единица глюкозы – ммоль·л-1.

. Инсулин указывается в мЕд·л-1. Уровень глюкозы и инсулина измеряют во время голодания. Индекс атеросклероза (индекс атерогенности) рассчитывали по методу, описанному Zheng et al. [21]. Метод расчета: Индекс атерогенности=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Влияние различных экстрагированных частей Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola на сывороточные INS и HbA1c черных мышей db/db

Возьмите замороженные образцы сыворотки и доведите их до комнатной температуры перед использованием для тестирования с помощью наборов для иммуноферментного анализа INS и HbA1c. Строго следуйте методам и действиям, указанным в инструкции к набору.

2.6 Влияние различных экстрагированных частей Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola на уровень окислительного стресса в печени черных мышей db/db

Возьмите замороженные образцы сыворотки и доведите их до комнатной температуры перед использованием для тестирования с помощью наборов для иммуноферментного анализа MDA и SOD. Строго следуйте методам и действиям, указанным в инструкции к набору.

2.7. Влияние различных экстрагированных частей Cistanche Deserticola/Cistanche Deserticola на жировой обмен в печени у черных мышей db/db.

Уровни ТГ, ОХ, ЛПВП и ЛПНП в сыворотке крыс измеряли с использованием соответствующих наборов. Конкретные этапы измерения см. в инструкциях к набору.

2.8 Влияние различных экстрагированных частей камфоры Cistanche Deserticola/Ratiana на UA, Cr и mALB в плазме и моче черных мышей db/db

Возьмите замороженные образцы плазмы и мочи и доведите их до комнатной температуры, прежде чем использовать их для тестирования наборов для иммуноферментного анализа UA, Cr и mALB. Строго следуйте методам и действиям, указанным в инструкции к набору.

2.9. Осмотр патологических срезов поджелудочной железы и почек методом окрашивания HE.

Ткани поджелудочной железы и почек, замоченные в 10% параформальдегидном фиксаторе в течение 24 часов, удаляли, промывали дистиллированной водой и хранили в 70% этаноле. Образцы тканей удаляли, обезвоживали этанолом определенной степени концентрации, очищали, заливали в парафин, делали срезы и затем окрашивали гематоксилином и эозином (окрашивание H&E). После высыхания клея срезов используйте систему цифровой визуализации высокого разрешения для наблюдения и фотографирования срезов.

2.10 Определение коллагена IV типа в почечной ткани иммуногистохимическим методом.

Для экспрессии срезы почек депарафинировали водой, а затем подвергали извлечению антигена. Их блокировали 10%-ной козьей сывороткой и инкубировали с первичным антителом при 4 градусах в течение ночи. После промывания вторичное антитело инкубировали. Текущим решением было DAB для разработки цвета. Промывку, обезвоживание и запечатывание проводили под оптическим микроскопом. Наблюдайте за экспрессией белка коллагена типа IV в ткани почек.

2.11 Статистические методы

Использование программного обеспечения GraphPad Prism версии 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) для анализа данных и результатов.

Результат средний ± SEM. Указывает, что разница между двумя группами односторонняя.

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ' тест одной пары столбцов), P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.