Влияние гликозидов цистанхе на синаптическую морфологическую пластичность у мышей с ускоренным старением
Mar 11, 2022
Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com
ЛЯН Хуанци1, ВАН Лу2, ЧЖАО Фуцзюнь3, ЛИН Шуай3, ЯНЬ Сюшэн4, Цзя Цзяньсинь4, ЦАЙ Чжипин4
(1-й класс 2014 г. Высшей школы медицинского колледжа Баотоу, Баотоу 014060, Китай)
(2. 12 класс клинической медицины 2015 г. в медицинском колледже Баотоу)
(3. Класс 1 судебной медицины 2013 г. в Медицинском колледже Баотоу)
(4. Кафедра анатомии человека Медицинского колледжа Баотоу)
АННОТАЦИЯ
Задача: исследовать влияниегликозидыцистанхе (GCs) на синаптическую пластичность нейронов гиппокампа у мышей с ускоренным старением, склонных к 8 (SAMP8).Методы: 4 0 мышей были случайным образом разделены на контрольную группу, группу с носителем, группу с низкой дозой (вводили ГК 2,5 мг/кг·d), группу со средней дозой (вводили ГК 5,0 мг/кг). г) и группы высоких доз (принимали ГК 10,0 мг/кг · г). Мыши в контрольной группе не подвергались никакому вмешательству; тем, кто находился в группах, которым вводили, и группе, получавшей носитель, вводили внутрибрюшинно (ГК/физиологический раствор) или физиологический раствор в течение 30 дней. Количество нормальных пирамидных нейронов в области CA1 гиппокампа подсчитывали с помощью окрашивания по Нисслю; количество дендритных шипиков в синапсах подсчитывали с помощью окрашивания по методу Гольджи, а экспрессию белка PSD-95 определяли с помощью иммуногистохимии.Полученные результаты: по сравнению с таковыми в контрольной группе ГК значительно увеличивали количество нормальных пирамидных нейронов в области CA1 гиппокампа (P<0.05) and="" increased="" the="" number="" of="" dendritic="" spines="" in="" synapses="" (p=""><0.05). the="" expression="" levels="" of="" psd-95="" in="" administered="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.05), and="" the="" effect="" in="" the="" middle="" dose="" group="" was="" the="" most="" significant.="">Вывод: ГК могут повышать выживаемость пирамидных клеток гиппокампа и улучшать синаптическую пластичность.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Гликозиды цистанхе (ГЦ); Мышь с ускоренным старением; дендритный шип; PSD－95
По мере того, как старение социального населения становится все более серьезным, распространенностьБолезнь Альцгеймера(AD) постепенно увеличивалась, что легло тяжелым бременем на семьи пациентов и общество
[1]. Основными клиническими проявлениями БА являются когнитивные нарушения и ухудшение памяти, а основными признаками болезни являются сенильные бляшки, образованные внеклеточными амилоидными отложениями и внутриклеточными нейрофибриллярными клубками [2]. Патогенез БА до сих пор не ясен. Патологические изменения синапсов считаются нейробиологической основой памяти и когнитивной дисфункции при БА. Аномальные изменения в синапсах могут быть основным звеном патогенеза БА. Мышь с ускоренным старением (SAM) представляет собой инбредную модель старения мыши. Его сублиния Р8 имеет однородные и стабильные патологические характеристики старения, что проявляется прогрессирующим снижением обучаемости, памяти и узнавания с увеличением месяцев. Известные дисфункции и патологические проявления аналогичны пациентам с БА, поэтому мыши SAMP8 являются идеальной животной моделью для изучения механизма связанных со старением нарушений обучения и памяти.
Эта статья предназначена для анализа выживаемости клеток, измерения плотности дендритных шипов и обнаружения постсинаптических компактов для изучения возможного механизма GCs.(гликозидыцистанхе)влияние на синаптическую морфологическую пластичность нейронов гиппокампа у быстро стареющих мышей с целью лечения БАцистанхегликозиды(GCs) Нарушение пространственного обучения и памяти обеспечивает теоретическую и экспериментальную основу.
1 Материал и методы
1.1 Экспериментальные животные и группы 4 0 самцов 10- мышей SAMP8 месячного возраста (приобретены в Тяньцзиньском университете традиционной китайской медицины), выращенных в чистой среде при температуре окружающей среды (24,0 ± 1.0) градус, влажность (50.0 ± 5.0) процентов, бесплатная еда и вода. Для начала эксперимента животных выращивали до 11-месячного возраста. Животные были случайным образом разделены на 5 групп (8 животных в группе): контрольная группа (контроль), группа контроля растворителя (носитель),цистанхе общие гликозиды(ГК) группа низких доз [2,5 мг/(кг·сут)], группа средних доз [5. 0 мг/(кг·сут)], группа высоких доз [10.0 мг/(кг·сут)]. Животные контрольной группы не подвергались никакому вмешательству. Животные в группе с низкими дозами получали ГК 2,5 мг/(кг·сут), животные в группе средних доз получали ГК 5,0 мг/(кг·сут), а животные в группе с высокими дозами давали ГК. 0 мг/(кг·сут) животным в группе, получавшей носитель, давали такое же количество физиологического раствора. Непрерывное внутрибрюшинное введение лекарственных препаратов или физиологического раствора в течение 30 дней по 0,5 мл/сут.
1.2 Подготовка и обработка образцов. Животных умерщвляли через 24 часа после последнего введения, анестезировали и умерщвляли шею. Разрежьте грудную полость, чтобы обнажить сердце, разрежьте ушко правого предсердия, чтобы выпустить кровь, и вставьте перфузионную иглу в левый желудочек. После вливания 100 мл физиологического раствора 4-процентный параформальдегид продолжали вливать до тех пор, пока конечности мышей не одеревенеют. Возьмите мозг и поместите его в 4-процентный раствор параформальдегида более чем на 24 часа.
1.3 Препараты и реагенты ГХ(гликозидыцистанхе) были приобретены в Китайской академии традиционной китайской медицины, постсинаптическая плотность -95, PSD -95 были приобретены у Epitomic, набор Coomassie Brilliant Blue CBBG 250 был приобретен у Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd. Инженерный институт, набор для иммуногистохимии DAB был приобретен у Пекинская биотехнологическая компания Zhongshan Jinqiao.
1.4 Окрашивание по Нисслю и подсчет клеток. Фиксация мозговой ткани 4-процентным параформальдегидом в течение более 24 часов, обрезка и дегидратация градиентным спиртом, прозрачным ксилолом, иммерсия воском, обычная заливка парафином, серийный срез толщиной 5 мкм. Нарезать ломтики и депарафинировать до воды, окрасить 1-процентным толуидиновым синим при 37 градусах в течение 60 минут, промыть в течение 5 минут × 3 раза, дифференцировать 95-процентным спиртом, 100-процентным спиртом. микроскоп. Область СА1 одного и того же среза гиппокампа каждой группы случайным образом выбирали из 3 полей наблюдения (×100), подсчитывали количество нормальных пирамидных клеток в пределах 1 мм и для анализа брали среднее значение.
1.5 Модифицированное окрашивание по методу Гольджи Поместите репарированную ткань головного мозга в раствор для окрашивания Гольджи-Кокса, защитите от света на 14 дней и меняйте раствор каждые 2 дня; поместите мозговую ткань в 30-процентный раствор сахарозы и поместите ее в холодильник при температуре 4 градуса. Ткань можно разрезать после погружения на дно; вибрационный микротом для срезов и окрашивания; закрепитель раствор для разработки; сушка монтажной пластины, наблюдение и подсчет под микроскопом. Наблюдайте за изменениями в дендритном шипе вершины нейрона гиппокампа CA1 и CA3 каждой группы мышей и рассчитайте плотность дендритного шипа.
1.6 Иммуногистохимические срезы депарафинизировали до воды, инкубировали с 3% H2O2 в течение 10 минут для устранения активности эндогенной пероксидазы, промывали дистиллированной водой в течение 5 минут × 3 раза, ремонтировали в микроволновой печи высокого давления, промывали PBS в течение 5 минут × 3 раза, козья сыворотка блокировалась в течение 30 минут при комнатной температуре, по каплям добавлялось первичное антитело кролика против PSD-95 мыши, в течение ночи при 4°С, промывалось PBS в течение 5 минут × 3 раза добавляли по каплям вторичное антитело, меченное биотином, инкубировали при 37°С в течение 2 ч, промывали PBS в течение 5 мин × 3 раза, добавляли стрептавидин, меченный пероксидазой хрена, промывали PBS в течение 5 мин × 3, промывали DAB в течение 2 мин, контрастное окрашивание гематоксилином, обезвоживание градиентным спиртом, прозрачное ксилолом и крепление. 1.7 Обработка изображений и статистический анализ. Для наблюдения были выбраны одни и те же поперечные срезы гиппокампа каждой группы. Три поля зрения (×100) были случайным образом выбраны в области СА1 для подсчета количества нормальных пирамидных клеток в пределах 1 мм, и было проанализировано среднее значение. Результаты иммуногистохимии измеряли с помощью программного обеспечения для анализа изображений IPP 7.0. Экспериментальные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения SPSS 17.0, и однофакторный дисперсионный анализ был использован для попарного сравнения средних по нескольким образцам. п<0.05 was="" considered="" statistically="">
Болезнь Альцгеймера
2 результата
2.1 Влияние общих гликозидовцистанхена количество нормальных пирамидных клеток в гиппокампе мышей SAMP8 Окраска по Нисслю Результаты окраски по Нисслю показали, что количество нейронов в области СА1 контрольной группы уменьшилось, их расположение было нарушено, и большинство клеток имели аномальную морфологию и лизис и некроз. Морфология клеток в ГК(гликозидыцистанхе)группа была относительно ясной и полной, с большим количеством видимых выпячиваний, тельца Ниссля были фиолетовыми, ядрышки были глубоко окрашены, ясны и располагались по центру, а ядра не окрашивались. Морфология клеток в группе, получавшей носитель, сходна с таковой в контрольной группе. Подсчет клеток показал, что количество нормальных пирамидных нейронов в области СА1 в группе введения увеличилось (P<0.05); the="" difference="" between="" the="" medium="" and="" high="" dose="" groups="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), the number of normal pyramidal neurons To a certain extent, it shows an upward trend with increasing dose. There was no significant difference in the number of normal pyramidal cells between the vehicle group and the control group (P>0.05). См. Таблицу 1.
Таблица 1 Влияние гликозидов цистанхе на окрашивание NIS гиппокампа мышей SAMP8, нормальное количество пирамидных клеток и число дендритных шипиков (шт.)
а по сравнению с контрольной группой t=0,193, P=0,582; б по сравнению с контрольной группой t=13,621, P=0,008; c по сравнению с контрольной группой t=21,798, P=0,005; d сравнивается с контрольной группой t=18,326, P=0,006; e сравнивается с контрольной группой t=0,244, P=0,463; f по сравнению с контрольной группой По сравнению с t=10,903, P=0,010; g по сравнению с контрольной группой t=21,817, P=0,005; h по сравнению с контрольной группой t=15.572, P=0. 007.
2.2.действие общих гликозидовцистанхе на плотность дендритных шипиков у мышей SAMP8. Окрашивание по Гольджи показало, что количество дендритных шипиков в контрольной группе уменьшилось, и плотность уменьшилась. После введения животным ГК количество и плотность дендритных шипиков увеличились, и было замечено большое количество выпячиваний (P=0.048). Статистически значимой разницы между группой средней дозы и группой высокой дозы не было (P=0,853). Количество и плотность дендритных шипов Степень имеет тенденцию к увеличению с увеличением дозы. Группа транспортных средств и управление
Количество и плотность дендритных шипиков в группе не имеют статистической значимости (P=0,764). См. Таблицу 1.
2.3 ВлияниеЦистанхегликозидов на экспрессию PSD-95 у мышей SAMP8. Иммуногистохимическое качественное определение PSD-95 показало, что контрольная группа имела меньшую экспрессию PSD-95, окрашивание клеточных тел было более светлым, а скорость положительной экспрессии была ниже. После добавления ГК in vitro тело клетки окрашивалось глубже, а экспрессия и положительная скорость PSD-95 увеличивались (t=5,751, P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" middle-dose="" group="" and="" the="" high-dose="" group="" (t="1.077," p="">0.05). В определенной степени выражение PSD-95 демонстрировало тенденцию к увеличению с увеличением дозы. средство передвижения
There was no statistically significant difference in PSD-95 expression between the control group and the control group (t = 0.585, P>0.05).
3 Обсуждение
PSD-95 является основным постсинаптическим компонентом и связан с множеством синаптических функций, включая ионные каналы, синаптическую активность, внутриклеточные пути передачи сигнала и т. д. [3]. PSD-95 объединяет родственные белки в сигнальном пути рецептора NMDA с образованием комплекса рецептор-сигнальная молекула-регуляторная молекула-молекула-мишень [4], который играет ключевую роль в пути передачи сигнала. Рецепторы NMDA участвуют в индукции долговременной потенциации (ДП) в области СА1 гиппокампа, процессах обучения и памяти [5]. PSD-95 играет ключевую регулирующую роль в этом процессе, и его содержание белка можно использовать в качестве еще одного молекулярного маркера для измерения синаптической пластичности. В наших предыдущих исследованиях мы доказали, что ГК(гликозидыцистанхе)может улучшать обучаемость и когнитивные нарушения у мышей SAMP8, но мы не выяснили его возможный морфологический механизм. Этот эксперимент направлен на изучение его возможного клеточного морфологического механизма.
В этом эксперименте улучшение выживаемости пирамидных клеток и синаптической пластичности в GCs(гликозидыцистанхе)группа была лучше, чем группа, получавшая носитель, и контрольная группа. Видно, что ГК более значительно улучшали морфологию пирамидных клеток. Экспериментальные результаты показывают, что более высокие дозы ГК могут оказывать лучший эффект. Из сравнения между группой со средней дозой и группой с высокой дозой видно, что эффект существенно не меняется, когда доза достигает определенной концентрации. Поэтому во избежание потерь и побочных эффектов ГК при использовании ГК следует выбирать наиболее подходящую концентрацию [6].
Предыдущие исследования показали, что ГК(гликозидыцистанхе)может улучшить обучение и когнитивные нарушения мышей SAMP8 за счет повышения выживаемости пирамидных клеток [7]. Имеются также данные, указывающие на то, что ГК могут улучшать нейродегенеративные заболевания, способствуя пролиферации и дифференцировке нейральных стволовых клеток [8-10]. Автор считает, что механизм ГК для улучшения БА может быть достигнут за счет улучшения пластичности синаптической морфологии и поддержания количества пирамидных клеток, что закладывает основу для окончательного использования ГК в профилактике и лечении клинической БА.
использованная литература
[1] Chen Juluo, Chen Xingui, Hu Panpan и др. Пациенты с болезнью Альцгеймера используют функции Предварительные исследования [J]. Китайский журнал поведенческой медицины и науки о мозге, 2013 г., 22 (10): 889-891.
[2] Цзинь Чуньхуэй, Лю Сяовэй, Юань Цзяньминь и др. Одиночный нуклеозид гена рецептора сортировки 1. Корреляция между кислотным полиморфизмом и спорадической болезнью Альцгеймера［J］. Китайский журнал поведенческой медицины и науки о мозге, 2014 г., 23 (5): 427-429.
[3] Шлибс Р., Арендт Т. Значение холинергической системы в головном мозге при старении и болезни Альцгеймера［J］. Нейронный трансм, 2006, 113 (11): 1625-1644.
[4] Сориано FX. Специфическое нацеливание на сигналы рецептора NMDA, вызывающие смерть, с различной зависимостью от лиганда NR2B PDZ［J］． J Neurosci, 2008, 28 (42): 10696-10710.
[5] Селкое Д.Дж. Растворимые олигомеры бета-амилоидного белка нарушают синаптическую пластичность и поведение ［J］． Behav Brain Res, 2008, 192 (1): 106 -113.
[6] Хуан Цзунхуэй, Чен Гуаньминь, Чжао Кантао и др. Исследование токсичности Цистанхе ［J］. China Journal of Hygiene Inspection, 2014, 24 (8): 1098 -1100.
[7] Цзя Цзяньсинь, Сун Вэй, Ян Сюшэн и др. Суммарные гликозиды цистанхе действуют на мышей SAMP8. Влияние и механизм взаимного обучения и памяти［J］. Журнал медицинского колледжа Баотоу, 2014 г., 30 (6): 6-8.
[8] Сяо К., Ян П., Ма Х и др. Усиление биогенеза астроцитарных лизосом способствует клиренсу А и ослабляет патогенез амилоидных бляшек［J］． J Neurosci, 2014, 34 (29): 9607-9620.
[9] Li QJ, Tang YM, Liu J и др. Лечение болезни Паркинсона нейральными стволовыми клетками С172, сверхэкспрессирующими NURR1, с помощью рекомбинированного дефицитного республиканского аденовируса, содержащего ген NURR1［J］. Синапс, 2007, 61 (12): 971-977.
[10] Цинь Вэй, Вэй Вэй, Сюй Цянь и др. Цистанхе на пролиферацию нейральных стволовых клеток C172 Влияние [J]. Strait Pharmacy, 2015, 27 (12): 263-265.
