Влияние глиозидов цистанхе на обучение познанию и синаптической пластичности у крыс в модели депривации сна

АБСТРАКТНЫЙ

Цель: «Исследовать, является лигликозиды цистанхеможет улучшитьобучающая и когнитивная функция лишения снамодели крыс отрегуляция синаптической пластичности. Методы: Пятьдесят самцов крыс Wistar были случайным образом разделены на пустую контрольную группу (Контроль), контрольную группу платформы (ПК), модельную группу (Модель),гликозиды группы цистанхе(GCs) и группу эстазолама (Est). Модель депривации сна у крыс была подготовлена ​​с помощью модифицированного метода многоплатформенной водной среды. Для обнаружения крыс использовали водный лабиринт Морриса и тест в открытом поле.пространственная когнитивная функция аи эмоциональные изменения. Для наблюдения за изменениями использовали окраску по Нисслю.морфология и количество нервных клетокв области CAl гиппокампа крыс. Вестерн-блоттинг и R'T-PCl использовали для определения уровней экспрессии синаптофизина (SYN), плотного вещества постсинаптической мембраны 95 (PSD - 95) и нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). Результаты: Результаты водного лабиринта Морриса показали, что по сравнению с контрольной группойобучаемость и познавательные способностикрыс в Модельной группе достоверно уменьшилось (P<0. 05 ), and theфункции обучения и памяти крысбыла улучшена обработка ГК ( P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Заключение: Гликозиды цистанхеможет влиять на синаптическую пластичность путем регулирования экспрессии маркеров, связанных с синапсом, тем самым улучшая обучающую и когнитивную функцию у крыс с моделью депривации сна.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВАГликозиды цистанхе; Гиппокамп; Депривация сна; Обучение и память; Беспокойство; Синаптическая пластичность

ПРОДАЖА ВЫСОКОГО УРОВНЯ ГЛИКОЗИДОВ ЦИСТАНХА

Расстройство сна (СД)этофункциональное расстройство снавызвано рядом сложных факторов, таких как бессонница, частые сны и легкое пробуждение. В последние годы заболеваемость СД постепенно увеличивается. Связанные исследования показали, что СД может вызватьсердечно-сосудистые заболевания, метаболическая дисфункция, иммунные заболеванияи дегенеративные заболевания центральной нервной системы, такие как болезнь Альцгеймера [1]. СД может вызывать окислительное повреждение нейронов гиппокампа, вызывать когнитивную дисфункцию и вызывать изменения настроения, такие как тревога и депрессия [2]. Cistanche Deserticola — ценное китайское лекарственное сырье, которое можно использовать в качестве лекарств и продуктов питания. Он тонизирует почки и восполняет ци, увлажняет кишечник, способствует дефекации и укрепляет Ян. Основной экстракт Cistanche Deserticola – гликозиды цистанхе (ГЦ) – обладают антиоксидантным, антиапоптотическим, печеночно-протекторным и нейропротекторным действием [3]. Наше предыдущее исследование показало, что GC могут улучшить обучающую и когнитивную функцию мышей SAMP8, играя антиоксидантную и антиапоптотическую роль [4]. Связанные исследования показали, что когнитивная дисфункция, вызванная СД, тесно связана с синаптической пластичностью [5]. Однако имеется мало сообщений о механизме, с помощью которого ГК регулируют синаптическую пластичность и улучшают обучение, ухудшение памяти и снижение когнитивных функций у крыс, вызванное лишением сна. Таким образом, данное исследование направлено на то, чтобы выяснить, влияют ли ГК на синаптическую пластичность, регулируя экспрессию синаптических маркеров, улучшая тем самым обучающую и когнитивную функцию крыс в модели депривации сна, а также предоставляя новые идеи и планы лечения обучения и когнитивные нарушения, вызванные нарушениями сна при приеме ГК.

1 Материалы и методы

1. 1 Экспериментальные животные

Крысы-самцы Wistar в возрасте от 6 до 8 недель и весом от 280 до 300 г были приобретены у компании Beijing Sibeifu с лицензией на производство животных [SCXK (Пекин) 2019-0010]. Все животные содержались в Центре экспериментов на животных Медицинского колледжа Баотоу при следующих условиях: температура (24 ± 1) градус, влажность от 50% до 55%, 12 часов света и 12 часов темноты, без ограничений в еде и воде. Этот эксперимент был одобрен школьным комитетом по этике [Baoyi Lunshen 2022 № (63)].

1.2 Основные реагенты и инструменты

Общие гликозиды Cistanche Deserticola были приобретены у Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (номер партии: KSM20220609011); Таблетки эстазолама были приобретены у CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (номер партии: 044220343); буфер для загрузки белка (P1015), буфер для лизиса RIPA (R0010), хемилюминесцентный раствор (PE0010) и т.д. были приобретены у компании Beijing Solebao; антитело к постсинаптическому веществу плотности 95 (PSD-95) (AB192757), антитело к синаптофизину (SYN) (ab32127), приобретенное у Abcam, США; нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) (48503-2), -актин (52901), приобретенный у SAB, США; вторичное антитело козы против кроличьего IgG (SA00001-20), приобретенное у Proteintech, США; крысиный мелатонин (MT), набор ELISA (MM-0657R1), приобретенный у Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Слайсер для парафина (Leica, Германия); оптический микроскоп (Leica, Германия); Водный лабиринт Морриса, испытательный стенд в открытом поле (Шанхай Синьжуань); прибор для вертикального электрофореза

(Пекинская компания Люи); шейкер для обесцвечивания (Beijing Liuyi Company); система анализа изображений белков (Shanghai Tanon Technology); прибор для количественной флуоресцентной ПЦР (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Экспериментальные методы

1. 3. 1 Группировка животных и введение препарата

5 0 самцов крыс Вистар были случайным образом разделены на контрольную группу (Контрольная группа), контрольную группу платформы (Контроль Платформы, группа ПК), модельную группу (Модельная группа), группу общих гликозидов Cistanche Deserticola (группа GC). , 50 мг/кг) и группу эстазола (группа Эст, 0,54 мг/кг) по 10 крыс в каждой группе. Контрольной группе и группе ПК вводили через зонд 0,9% физиологический раствор. Всем группам вводили через зонд каждый день в 7 часов утра после начала моделирования, и зонд продолжался в течение 21 дня.

1. 3. 2. Подготовка модели животных с депривацией сна

Модель депривации сна была создана с использованием модифицированного метода мультиплатформенной водной среды [6]. Экспериментальное оборудование представляло собой прямоугольный резервуар для воды из полиэтиленовой смолы размером 130 × 50 × 45 см. В резервуар с водой поместили небольшую платформу диаметром 5 см и высотой 20 см. Платформа группы ПК имела диаметр 10 см и высоту 20 см. Резервуар для воды был заполнен водой на глубину около 18 см, а температура воды поддерживалась на уровне (20 ± 1) градуса. За неделю до начала эксперимента крыс помещали в бокс депривации сна каждый день на 60 минут для ознакомления с окружающей средой. После создания модели, за исключением контрольной группы, крыс каждой группы помещали на небольшую платформу в часы с 8:00 до 20:00 каждый день для депривации сна в течение 21 дня подряд. Всем крысам разрешалось свободно есть и пить, а также свободно передвигаться по платформе с 12-часовым чередованием света и темноты каждый день.

1.3.3 Эксперимент с водным лабиринтом Морриса

Водный лабиринт Морриса был разделен на 4 области, заполненные водой, а платформа была размещена в 4-м квадранте. Поверхность воды находилась примерно на 2 см выше платформы. В воду добавляли пищевой меланин и поддерживали температуру воды на уровне (25 ± 1) градуса. (1) Эксперимент по позиционированию и навигации: выбирали центр каждой области и крыс осторожно помещали в воду. Им разрешили свободно исследовать. Регистрировали время, необходимое крысам для нахождения целевой платформы в течение 60 секунд. Крыс, которые не нашли платформу, направляли на платформу и оставались там в течение 20 секунд. Обучение продолжалось 5 дней. (2) Тест на пространственное исследование: на 6-й день платформу убрали и крыс поместили в воду из центра 2-го квадранта напротив стены. Регистрировали количество раз, когда крысы проходили платформу в течение 120 с, и время, в течение которого они оставались в 4-м квадранте.

1.3. 4 Эксперимент в открытом поле

Использовался экспериментальный ящик размером 100 см × 100 см × 50 см, дно которого было разделено на 9 сеток. Каждую группу крыс заранее помещали в экспериментальную комнату открытого типа для адаптации к комнатным условиям на 60 мин. В начале эксперимента подопытных крыс поочередно помещали в фиксированные углы экспериментального бокса с открытым полем и регистрировали количество раз стояния, расстояние движения и статическое время крыс в течение 5 минут с помощью программного обеспечения для поведенческого анализа. . Во время эксперимента окружающая среда должна была быть тихой, а между двумя экспериментами экспериментальное устройство протирали чистой водой и спиртом соответственно, чтобы запах предыдущей крысы не влиял на оценку поведения следующей крысы.

1. 3. 5 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Определение уровней МТ в сыворотке крыс. Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией и отбирали 5 мл крови из брюшной аорты. После ожидания в течение 30 мин при комнатной температуре кровь центрифугировали для получения сыворотки. В каждую лунку добавляли 40 мкл разбавителя образца, а затем добавляли 10 мкл тестируемого образца. После запечатывания герметизирующей пленкой инкубируйте при 37 градусах в течение 30 мин. Промойте 5 раз, добавьте 50 мкл раствора для мечения фермента и инкубируйте при 37 градусах в течение 30 минут после герметизации герметизирующей пленкой. Промойте 5 раз, затем поочередно добавьте раствор, проявляющий цвет, и раствор, останавливающий реакцию. Значение OD каждой лунки измеряли с помощью прибора для мечения ферментов при длине волны 450 нм.

１. ３. ６ Окраска по Нисслю

Из каждой группы брали по три крысы и ткань мозга удаляли путем декапитации. Ткань головного мозга фиксировали 4% раствором полиметилметакрилата, ткань обезвоживали, погружали в раствор воска и заливали, а ткань разрезали обычными методами. Срезы сохраняли толщиной 5 мкм, промывали PBS, окрашивали 0. 1% толуидинового синего для 0. 5 ч, дифференцировали 95%-ным спиртом, обезвоживали 100%-ным спиртом, прозрачно ксилолом и герметизировали нейтральной камедью. Изменения в морфологии и количестве нейронов в области CA1 гиппокампа крысы наблюдали под микроскопом и собирали изображения.

１. ３. 7. Вестерн-блот-эксперимент

Из каждой группы отбирали по четыре крысы и декапитацией выделяли гиппокамп. Ткань гиппокампа смешивали с лизирующим буфером RIP A в среде ледяной бани и центрифугировали для получения супернатанта. Концентрацию белка определяли методом BCA. 20 мкг белка добавляли с буфером для загрузки белка для электрофореза. После завершения электрофореза белков мембрану переносили при постоянном токе 300 мА, блокировали 5% сухим обезжиренным молоком, первичное антитело инкубировали при 4 градусах в течение ночи, а вторичное антитело инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После использования раствора для проявления цвета систему анализа хемилюминесцентных изображений использовали для статистического анализа белковых полос.

1. 3. 8 эксперимент RT-PCR

Из каждой группы отбирали по три крысы для приготовления гомогената ткани гиппокампа. Тотальную РНК из тканевой жидкости экстрагировали методом Тризола и измеряли концентрацию. Для обратной транскрипции использовали набор для синтеза кДНК натощак, а реакцию количественной амплификации флуоресценции использовали для определения относительного уровня экспрессии мРНК синаптически-родственного белка с использованием набора для количественного флуоресценции. Результаты анализировали с использованием 2-ΔΔCt, последовательности праймеров показаны в таблице 1.

1.4 Статистические методы

Результаты данных, которые соответствовали нормальному распределению, были выражены как среднее ± стандартное отклонение (x ± s), а статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9.5. Однофакторный дисперсионный анализ использовался для сравнения нескольких выборок, и P < 0,05 указывало на то, что разница была статистически значимой.